熊 科 崔曉亭 王小藝 趙峙堯 柳佳蕓 裴鵬剛 鄧 蕾 熊蘇玥

（1北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心 北京 100048

2北京工商大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京 100048

3北京工商大學(xué) 北京市質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100048

4北京工商大學(xué) 北京市風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100048）

我國是農(nóng)業(yè)大國，伴隨著農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)加工，每年產(chǎn)生大量農(nóng)業(yè)廢棄物。這些農(nóng)業(yè)廢棄物資源再生利用率極低，大部分被浪費(fèi)[1-2]。大力開發(fā)利用這些資源可以緩解環(huán)境、資源和糧食危機(jī)，因此農(nóng)業(yè)廢棄物再利用成為近十幾年各國研究的熱點(diǎn)[3]。木聚糖是結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的半纖維素，為世界第二大可再生資源[4]。由于木聚糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，它的徹底水解需要一系列酶的協(xié)同作用，其中最關(guān)鍵的酶是木聚糖酶[5]。在眾多應(yīng)用中，以木聚糖經(jīng)酶法制取有較高附加值的功能低聚糖，是富含半纖維素材料的農(nóng)業(yè)廢棄物再生利用的有效增值途徑，具有巨大的潛在經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)保意義[6-8]。而木聚糖酶屬水解酶類，在碳循環(huán)過程中發(fā)揮了不可替代的功能，具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值，目前已成功應(yīng)用于食品、飼料、釀造、造紙、醫(yī)藥和能源等領(lǐng)域[9-11]。

目前，多數(shù)木聚糖酶來源于各類天然微生物菌株，通過天然產(chǎn)酶方式獲得的木聚糖酶多為復(fù)合酶，表達(dá)量低，且不易純化[12]。由于自然界中99%以上的微生物是不能被純培養(yǎng)利用，因此該方法得到的產(chǎn)木聚糖酶菌株十分有限，僅局限于不到1%的微生物基因資源，對(duì)自然界中所占比例較大的非培養(yǎng)微生物資源無法利用[13]。近年來，越來越多的學(xué)者基于宏基因組的方法篩選木聚糖酶。如汪國增等[14]通過構(gòu)建瘤胃宏基因組文庫，從中篩選到酶學(xué)性質(zhì)較為新穎的木聚糖酶，其最適作用溫度30℃，可用于果汁的澄清，生產(chǎn)飼料等工業(yè)。張鵬等[15]從堆肥構(gòu)建的宏基因組文庫中篩選到性質(zhì)較為優(yōu)良的纖維素酶和木聚糖酶，可用于造紙等工業(yè)。Bao等[16]從牦牛瘤胃等宏基因文庫中篩選到能提高木聚糖酶活力的纖維素酶，可用于食品加工，動(dòng)物飼料的加工。Hu Y等[17]從土壤宏基因文庫中篩選到一種低溫耐堿酶，與常規(guī)木聚糖酶不同，可用于制備生物燃料、燃料乙醇。GonX等[18]從牛瘤胃等中篩選到無纖維素酶活力的木聚糖酶，可用于紙漿漂白等工業(yè)化應(yīng)用。Mo XC等[19]從土壤宏基因組文庫中篩選到一種多功能酶，能夠制備低聚木糖。從來源上比較，木聚糖酶廣泛來源于各種環(huán)境，如海洋、陸地等。而土壤微生物是木聚糖酶的巨大來源庫，通常每1 g土壤中有幾億到幾百億個(gè)微生物，雖然土壤宏基因文庫構(gòu)建面臨的干擾因素多、難點(diǎn)大，如腐殖酸的去除等，但構(gòu)建土壤未培養(yǎng)微生物的宏基因組文庫能更廣泛地獲得木聚糖酶優(yōu)良基因資源。本研究以土壤環(huán)境作為宏基因來源對(duì)酶進(jìn)行發(fā)掘，相比其它環(huán)境的宏基因來源可大大提高尋找和發(fā)現(xiàn)新木聚糖酶基因的概率，理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值較大。利用HiTAIL-PCR將獲得非培養(yǎng)的木聚糖酶基因全長進(jìn)行異源表達(dá)，為更好地開發(fā)利用土壤未培養(yǎng)微生物資源，發(fā)掘新穎的木聚糖酶資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

土壤樣品來自云南、貴州、河南、河北等15個(gè)地區(qū)。樣品采用鐵鏟采集，用刮刀除去5 cm厚的表層土。將采集的土壤樣品保存于無菌塑料袋中，于-4℃冰箱保存待用。

1.2 主要試劑

DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒（美國OMEGA）；瓊脂糖（西班牙 Biowest）；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、十二烷基磺酸鈉（SDS）購自上海生工生物技術(shù)有限公司；RNA酶，蛋白酶K來自（日本 TAKARA）；Sau 3A I、BamH I、CIAP、T4 DNA 連 接 酶 、Q5 DNA 聚 合 酶 、λDNA/Hind III、DL2000、1 kb PlusDNA Ladder，pUC19、E.coli DH5、pET28a 載體、E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞（日本TAKARA）；氨芐霉素（Amp）蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）（英國 Oxford公司）；Gel Exraction Kit（美國 OMEGA）；剛果紅，卡那霉素（美國 AMRESCO）；櫸木木聚糖（美國 Sigma）。

1.3 主要設(shè)備與儀器

DYC P-31BN水平電泳槽、DYY-10C電泳儀，北京六一儀器廠；Image Quant 300凝膠成像儀、Multitemp III恒溫循環(huán)水浴器，美國 GE公司；Sigma 1-14小型臺(tái)式高速離心機(jī)，美國 Sigma公司；WD-9405B型水平搖床，北京六一；PCR儀，Biometra，德國；ImageQuant 300 凝膠成像儀，Multitemp III恒溫循環(huán)水浴器，美國GE；瓊脂糖凝膠電泳儀，北京六一；DHZ-DA全溫振蕩器，江蘇太倉培英；WD-9405B型水平搖床，北京六一；Nanodrop核酸定量儀，Thermo公司。

1.4 土壤宏基因組文庫構(gòu)建

每次稱取80 g土壤，用提取緩沖液（Tris-HCl：100 mmol/L pH 8.0；EDTA：100 mmol/L，pH 8.0；NaCl：1.5 mol/L；CTAB：1%）溶解稀釋土樣，225 r/min?；靹?～3 h。具體提取方法參照Zhou等[20]。將回收后的DNA片段采用Sau3A I進(jìn)行部分酶切，并與經(jīng)BamH I酶切后與pUC19載體進(jìn)行連接，電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到DH5α中。

1.5 土壤宏基因組文庫的篩選

土壤宏基因組文庫的篩選方法參照Kwon等[21]，將文庫中的克隆子轉(zhuǎn)接到含有0.5%的木聚糖底物的平板上培養(yǎng)24 h，將平板放置在50℃烘箱30 min后，剛果紅染色15 min，1 mol/L的Na-Cl脫色15 min，在底物平板上能產(chǎn)生透明圈的克隆即為陽性克隆。

1.6 木聚糖酶基因cbxynA序列分析

對(duì)上述篩選得到的陽性克隆子提取質(zhì)粒并測(cè)序，用在線軟件預(yù)測(cè)外源插入片段所有可能的開放閱讀框，用DNAMAN預(yù)測(cè)目的基因可能的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)。

1.7 重組酶CBXYNA的表達(dá)和純化

利用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增cbxynA的ORF編碼序列。在序列 N端正（5’-CATGCCATGGCACACGTACACGTCCCG-3’）引入Xho I位點(diǎn)，在C端（5’-CCGCTGAGGCAGGCTGCGAAAAGCCC-3’）引入 Nco I位點(diǎn)。

將目的基因cbxynA經(jīng)Xho I和Nco I雙酶切后連接到pET-28a（+）載體并轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)。對(duì)表達(dá)過程中何時(shí)加入IPTG的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、加入IPTG誘導(dǎo)后的溫度、誘導(dǎo)的時(shí)間及IPTG濃度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。收集菌體后用裂解液裂解，超聲波破碎細(xì)胞后離心收集上清粗酶液。用Ni柱純化粗酶液，先用2.5%wash&elution buffer對(duì)柱料進(jìn)行沖洗，通過A280檢測(cè)器對(duì)除雜蛋白情況進(jìn)行監(jiān)控，直至檢測(cè)器顯示沒有雜峰的出現(xiàn)。用wash&elution buffer對(duì)柱料進(jìn)行梯度洗脫，梯度分別為5%，10%，20%，40%，60%，80%，100%。并將對(duì)應(yīng)的出峰時(shí)間的蛋白進(jìn)行收集。用SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化后的酶蛋白。

1.8 重組酶CBXYNA活力及酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

以木聚糖為底物，采用DNS法測(cè)定酶活力。酶最適pH值和pH穩(wěn)定性測(cè)定緩沖液體系為pH值2.2～11。每種緩沖體系5個(gè)點(diǎn)，共35個(gè)點(diǎn)。重組CBXYNA酶活力的測(cè)定在50℃下進(jìn)行，將常規(guī)方法中的緩沖液替換為上述不同pH體系的緩沖液，測(cè)定所得酶活力記為100%。pH穩(wěn)定性是將酶液稀釋，使酶液處于不同的緩沖體系中，50℃下保溫30 min后立即冰浴終止反應(yīng)，之后按照DNS測(cè)定方法測(cè)定殘余酶活力，以未經(jīng)保溫處理的重組木聚糖酶CBXYNA活力為100%，分別計(jì)算不同pH下的殘余相對(duì)酶活力。

測(cè)定最適溫度時(shí)，用最適pH緩沖液將酶稀釋一定比例，然后置于40～80℃的不同溫度下，反應(yīng)10 min，測(cè)定酶活力，以最大值為100%。溫度穩(wěn)定性的測(cè)定，將樣品與酶最適反應(yīng)緩沖溶液以一定比例混勻，置于不同溫度（50，55，60，65，70 ℃）中保溫不同時(shí)間（0，30 min，1 h，1.5 h，2 h，3 h，4 h，5 h）。定時(shí)取樣，測(cè)定樣品殘留酶活力，以未處理木聚糖酶活力作對(duì)照。

考察的金屬離子 Na+、K+、Li+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Fe3+、Al3+、Cu2+對(duì) CBXYNA 酶活力的影響。酶對(duì)底物特異性的研究，添加1%（w/v）的燕麥木聚糖、樺木木聚糖、水溶性玉米芯木聚糖、水不溶性玉米芯木聚糖在0.05 mol/L，pH 5.2的醋酸緩沖液中，反應(yīng)時(shí)間為10 min，反應(yīng)溫度為55℃條件下測(cè)定木聚糖酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤宏基因組文庫的構(gòu)建及其篩選

從土壤中提取總的DNA，經(jīng)純化濃縮后的23 kb以上的DNA的量約為6 μg。因土壤環(huán)境中得到的總DNA片段較長，不利于外源片段插入載體中。故采用Sau3A I酶對(duì)回收的土壤DNA片段進(jìn)行部分酶切，再用1%的瓊脂糖凝膠回收2～10 kb以內(nèi)的DNA片段約2 μg左右。土壤粗提DNA電泳圖如圖1所示。

將酶切時(shí)間設(shè)置為1 h，每100 μL加入0.75 U的Sau3A I酶，使得土壤DNA的條帶分布在2～8 kb，符合構(gòu)建質(zhì)粒土壤宏基因組文庫。酶切之后的土壤DNA與pUC19載體經(jīng)T4連接酶連接后，導(dǎo)入到DH5α中。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板后獲得了大量宏基因文庫克隆子。從文庫中隨機(jī)提取10個(gè)克隆子并提取質(zhì)粒，用EcoR I和Hind III雙酶切之后，結(jié)果表明：質(zhì)粒間插入的外源酶切帶型差異顯著，文庫克隆片段隨機(jī)性較高。外源插入大小為1.5～4.5 kb，平均為 3 kb，粗略計(jì)算，宏基因組的庫容量為30 Mb。

圖1 不同方法提取土壤DNA電泳圖Fig.1 Extraction and purification of DNA from soil by different methods

圖2 土壤宏基因組文庫重組質(zhì)粒雙酶切分析Fig.2 The restriction analysis of recombinant plasmids from the soil metagenomic library

隨后，基于功能策略篩選，采用剛果紅法對(duì)文庫進(jìn)行初篩，Cb5545克隆子在剛果紅平板上的透明圈如圖3所示。

圖3 Cb5545克隆子初篩（a）及復(fù)篩（b）選平板中的透明圈Fig.3 Transparent rings of Cb5545 clone in primary screening（a）and screening（b）plate

平板篩選結(jié)果表明：克隆子Cb5545具有水解木聚糖底物的活性，使以木聚糖為底物的平板經(jīng)剛果紅染色后產(chǎn)生了陽性透明圈。隨后對(duì)篩選的克隆子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，取粗酶液采用DNS法測(cè)定發(fā)現(xiàn)其初始酶活力為12.09 U/mL。

2.2 基因cbxynA序列分析

將篩選得到的陽性克隆子Cb5545測(cè)序，得到一段4 238 bp的DNA序列，并預(yù)測(cè)了該外源插入片段的所有可能開放閱讀框，其中開放閱讀框ORF10是一個(gè)822 bp長的編碼木聚糖酶的完整的開放閱讀框，其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列與來自Halobacteriaceae archaeon（古細(xì)菌屬）編碼的木聚糖酶的相似度最高也僅為45%，表明該序列是一條未知的新序列（GenBank登記號(hào)：KY062986）。該基因編碼的產(chǎn)物由273個(gè)氨基酸組成，預(yù)測(cè)的分子質(zhì)量為29.1 ku，等電點(diǎn)為5.2。

2.3 重組酶CBXYNA原核表達(dá)優(yōu)化

將目的基因cbxynA克隆到pET-28a（+）表達(dá)系統(tǒng)里進(jìn)行異源表達(dá)。對(duì)重組質(zhì)粒何時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)的時(shí)機(jī)、加入IPTG后的誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度及IPTG濃度進(jìn)行優(yōu)化。最終的優(yōu)化結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明：培養(yǎng)5 h后，添加IPTG終濃度為0.7 mmol/L，在23℃下誘導(dǎo)25 h，獲得的最大酶活力為52 U/mL，較初始值提高了4.3倍。

2.4 重組酶CBXYNA的純化

CBXYNA經(jīng)硫酸銨鹽析和Ni-NTA純化結(jié)果如表1所示。硫酸銨鹽析和Ni-NTA純化后的產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證（圖5泳道2），將得到的電泳純級(jí)CBXYNA木聚糖酶進(jìn)行酶學(xué)特性研究。

2.5 重組酶CBXYNA酶學(xué)性質(zhì)研究

圖4 IPTG誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的菌體生長曲線（a）及IPTG加入后的誘導(dǎo)時(shí)間（b）、誘導(dǎo)溫度（c）及誘導(dǎo)劑濃度（d）對(duì)CBXYNA酶活力影響Fig.4 Growth curve of muton for IPTG inducing（a）and Effect of IPTG inducing time（b），temperature（c），concentration（d）on CBXYNA enzyme activity

表1 重組木聚糖酶CBXYNA的純化總結(jié)Table 1 Summary of purification recombinant CBXYNA

圖5 CBXYNA純化過程的電泳圖和酶譜圖Fig.5 The SDS-PAGE electrophoresis and zymogram of recombinant CBXYNA

當(dāng)以木聚糖為底物時(shí)，CBXYNA酶促反應(yīng)的最適pH為5.2（圖6a），其pH穩(wěn)定性在pH 4.2到10.2之間，保溫30 min后殘余酶活仍能達(dá)到70%以上（圖6b）。CBXYNA的酶促反應(yīng)最適溫度為55℃（圖6c），在50～60℃條件下保溫30 min，殘余酶活力仍為80%以上（圖6d）。

研究 Ca2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、K+和Na+、等不同金屬離子對(duì)重組木聚糖酶CBXYNA酶活力的影響，由圖7可知，Na+、 K+、Ca2+、Li+在1～7 mmol/L的范圍之內(nèi)對(duì)酶有促進(jìn)作用，而Mg2+則在1～3 mmol/L內(nèi)對(duì)酶有促進(jìn)作用，在5～7 mmol/L對(duì)酶有抑制作用。Mn2+、Zn2+、Fe3+、Al3+、Cu2+對(duì)酶有抑制作用，且抑制作用隨著金屬離子濃度的升高而增強(qiáng)。其中，Cu2+對(duì)酶的抑制作用最明顯，幾乎使其完全喪失酶活。金屬離子在微生物機(jī)體內(nèi)主要是作為酶活性中心的組成部分，維持生物大分子細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。但是有些金屬離子對(duì)機(jī)體有不利影響，研究認(rèn)為半胱氨酸可以參與糖殘基-酶中間體的形成，而有些重金屬離子阻礙了這一過程，不利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行，也可能是影響了酶與底物的結(jié)合及解離狀態(tài)。然而金屬離子影響酶活力的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

進(jìn)一步探究CBXYNA酶的底物特異性，以樺木木聚糖的酶活力為對(duì)照100%，當(dāng)以水溶性玉米芯木聚糖作為底物時(shí)，CBXYNA酶活力達(dá)到162%；以燕麥木聚糖為底物時(shí)，酶活力為139%。以水不溶性玉米芯為底物時(shí)，酶活力為74%；以麩皮為底物時(shí)，其酶活力為56%（表2）。

圖6 重組酶CBXYNA的酶學(xué)性質(zhì)Fig.6 Enzymatic properties of the recombinant enzyme CBXYNA

圖7 金屬離子對(duì)木聚糖酶活性的影響Fig.7 Effect of metal Ions on xylanase activity

3 結(jié)論

研究從土壤宏基因文庫中篩選并鑒定出一個(gè)木聚糖酶基因cbxynA，經(jīng)分析表明該基因是一段未知的新序列。隨后對(duì)該基因進(jìn)行克隆表達(dá)，對(duì)其原核表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終獲得其最大酶活力為52 U/mL，較初始值提高了4.3倍。重組木聚糖酶 CBXYNA，其最適 pH為 5.2，pH在4.2到10.2之間時(shí)其酶活力在70%以上，有較好的pH穩(wěn)定性。CBXYNA的最適溫度為55℃，在50～60℃保溫30 min酶活力仍在80%以上，具較好的熱穩(wěn)定性。Na+、K+、Ca2+、Li+在1～7 mmol/L 的范圍之內(nèi)對(duì)酶有促進(jìn)作用，Mn2+、Zn2+、Fe3+、Al3+、Cu2+對(duì)酶有抑制作用，且抑制作用隨著金屬離子濃度的升高而增強(qiáng)。其中，Cu2+對(duì)酶的抑制作用最明顯，幾乎使其完全喪失酶活。當(dāng)該酶以水溶性玉米芯木聚糖、燕麥木聚糖、水不溶性玉米芯木聚糖、酶活力分別為162%，139%，74%，說明該CBXYNA更容易結(jié)合水解水溶性木聚糖底物。重組木聚糖酶CBXYNA有較好的pH穩(wěn)定性，可用于造紙、飼料、食品等工業(yè)應(yīng)用中。同時(shí)該酶以燕麥木聚糖、水溶性玉米芯木聚糖為底物時(shí)，酶活力相對(duì)較高，有較強(qiáng)的親和能力，可被用于水解可溶性木聚糖底物制備低聚木糖。

表2 重組CBXYNA對(duì)不同水解底物的特異性Table 2 Specificity of CBXYNA towards different hydrolysis substrates