曹晨陽 孟令緣 王嘉煒 趙曉陽 楊保偉

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌 712100）

阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）是一種革蘭氏陰性致病菌，常污染乳及乳制品，可引起嚴(yán)重的新生兒腦膜炎、壞死性小腸結(jié)腸炎和敗血癥，死亡率高達(dá)50%以上[1-3]。即使治愈，也可能使神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生后遺癥[4]。近幾年，隨著國內(nèi)外一系列與阪崎克羅諾桿菌相關(guān)的污染事件的爆發(fā)，該菌受到研究者的廣泛關(guān)注[5-8]。目前，對(duì)阪崎克羅諾桿菌確切的污染來源尚不清楚，許多病例表明嬰幼兒配方乳粉是該菌的主要感染載體[9]。

如果嬰幼兒進(jìn)食染菌的乳粉和米粉，該菌則隨食物進(jìn)入嬰幼兒體內(nèi)，導(dǎo)致疾病。嬰幼兒乳粉/米粉沖調(diào)時(shí)使用溫水和/或微波加熱，這樣的處理肯定會(huì)或多或少的對(duì)菌體產(chǎn)生影響。乳粉/米粉沖調(diào)時(shí)，其中的阪崎克羅諾桿菌沒有被高溫和/或微波殺死，隨著食物進(jìn)入嬰幼兒體內(nèi)后，消化系統(tǒng)（特別是胃液）的pH值、腸道中的乳酸菌或發(fā)生腹瀉后服用媽咪愛等嬰幼兒常用藥物也會(huì)對(duì)該菌的生長產(chǎn)生一定的抑制或殺滅作用。雖然上述因素均會(huì)在一定程度抑制外源污染的阪崎克羅諾桿菌，甚至殺滅菌體，但目前除了對(duì)該菌的耐熱性能研究較多外[10-14]，尚無研究揭示阪崎克羅諾桿菌對(duì)其它因素的耐受性。本研究基于嬰幼兒進(jìn)食乳粉/米粉時(shí)常規(guī)操作和部分人體生理?xiàng)l件，闡明阪崎克羅諾桿菌對(duì)這些條件的耐受性，為指導(dǎo)乳粉/米粉合理沖調(diào)和保障嬰幼兒食品安全提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 阪崎克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC BAA-894由中國食品藥品檢定研究院提供，分離于嬰幼兒配方乳粉和米粉中不同基因型的阪崎克羅諾桿菌 11-19（1）、12-4（1）、12-8（1）、12-13（2）、13-8（2）、13-2（1）、14-20（1）、14-15（2）、14-4（1）、15-9（2）、18-16（1）、18-8（1）、18-24（1）、18-12（2）和18-14（1）由西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物研究室提供。供試代表性菌株選擇標(biāo)準(zhǔn)：分離于不同時(shí)間采集的不同品牌的嬰幼兒乳粉或米粉，具有不同耐藥表型和基于脈沖場 凝 膠 電 泳（Pulsed field gel electrophoresis，PFGE）的基因型，攜帶不同毒力基因。產(chǎn)乳酸菌素乳酸菌由西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院呂欣博士惠贈(zèng)。

1.1.2 材料與試劑 LB瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基（MHA）和腦心浸液培養(yǎng)基（BHI），購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；媽咪愛，購自北京韓美藥品有限公司；制作菌懸液用嬰幼兒配方乳粉，購于陜西楊陵好又多超市，為適于較大嬰兒及幼兒食用的2段配方牛乳粉。

1.1.3 主要儀器 高壓滅菌鍋（LAC-5080S），上海博訊；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1CU），蘇州泰安；微量移液槍（Effendorf），德國；百分之一天平（XS204），梅特勒；恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-211B），上海智誠。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化和擴(kuò)大培養(yǎng) 用接種環(huán)分別蘸取少量保存于-80℃ LB肉湯/甘油（50%/50%V/V）中的阪崎克羅諾標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離株，劃線接種到LB瓊脂培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)18～24 h。從LB培養(yǎng)基上挑取一個(gè)單菌落，接種到20 mL BHI肉湯中，37℃、100 r/min下?lián)u床培養(yǎng)10 h。

1.2.2 菌液初始濃度測定和存活率計(jì)算 取1 mL阪崎克羅諾桿菌BHI肉湯培養(yǎng)物，用生理鹽水依次進(jìn)行 10倍稀釋，分別得到其 101，102，103，104，105和106倍稀釋液。分別取各稀釋液50 μL接種于LB平板上，涂布均勻后37℃下倒置培養(yǎng)18 h，計(jì)數(shù)。同時(shí)接種50 μL無菌生理鹽水于LB平板表面作為陰性對(duì)照。每個(gè)稀釋度（包括對(duì)照）共做3個(gè)重復(fù)。選擇菌落分布均勻且皿內(nèi)菌落數(shù)在30～300 CFU的稀釋度的菌落數(shù)計(jì)算菌液的起始濃度。

存活率計(jì)算按照下列公式進(jìn)行：

1.2.3 阪崎克羅諾桿菌對(duì)溫度的耐受性測定 結(jié)合日常生活中乳粉沖調(diào)時(shí)使用的水溫，分別選取50，60和70℃ 3個(gè)溫度點(diǎn)進(jìn)行研究。取1.2.1節(jié)中的BHI肉湯培養(yǎng)物1 mL加入到滅菌的裝有10 mL沖調(diào)乳粉（用礦泉水按照乳粉生產(chǎn)商的推薦比例沖調(diào)，下同）的50 mL離心管中，振蕩混勻，將離心管分別置于50，60和70℃的水浴中保溫處理20 min，保溫過程不斷進(jìn)行振蕩使菌體受熱均勻。處理結(jié)束后，按照1.2.2節(jié)所述方法，立即取樣測定阪崎克羅諾桿菌的濃度并計(jì)算存活率，采用存活率衡量其對(duì)溫度的耐受性。

1.2.4 阪崎克羅諾桿菌對(duì)pH的耐受性測定 將沖調(diào)好的乳粉高溫滅菌后，使用無菌HCl和/或NaOH調(diào)整其pH 為4.0，6.0和8.0，確定每個(gè)離心管中調(diào)整pH值后的乳粉體積為20 mL后，分別向其中加入1 mL 1.2.1節(jié)中的BHI肉湯培養(yǎng)物，振蕩勻后室溫下靜置20 min。處理結(jié)束后，按照1.2.2節(jié)所述方法，立即取樣測定阪崎克羅諾桿菌的濃度并計(jì)算存活率，采用存活率衡量其對(duì)pH的耐受性。

1.2.5 阪崎克羅諾桿菌對(duì)微波處理的耐受性 取1 mL 1.2.1節(jié)中的BHI肉湯培養(yǎng)物，加入沖調(diào)好的10 mL無菌乳粉中。由預(yù)試驗(yàn)可知，10 mL沖調(diào)乳粉在微波爐中加熱到60℃所需時(shí)間大約為2 min。通過秒表計(jì)時(shí)，對(duì)所有加有菌液的沖調(diào)奶粉進(jìn)行微波處理2 min后，立即取樣測定阪崎克羅諾桿菌的濃度并計(jì)算存活率，采用存活率衡量其對(duì)微波的耐受性。

1.2.6 阪崎克羅諾桿菌對(duì)乳酸菌的敏感性 首先向無菌培養(yǎng)皿底部平鋪一層厚度約2 mm的乳酸菌培養(yǎng)基（de Man Rogosa Sharpe，MRS），待其凝固后，以劃線法在培養(yǎng)基中間接種已經(jīng)活化的乳酸菌，共劃線2條。之后將100 μL 1.2.1節(jié)中培養(yǎng)得到的阪崎克羅諾桿菌菌液加入10 mL已滅菌并冷卻至50℃的MHA培養(yǎng)基中，振蕩混勻后水平傾注于MRS固體培養(yǎng)基上，凝固后于37℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，觀察抑菌結(jié)果。采用垂直于乳酸菌劃線方向抑菌區(qū)域的最大半徑表示阪崎克羅諾桿菌的敏感性。

1.2.7 阪崎克羅諾桿菌對(duì)媽咪愛的敏感性 將購買的媽咪愛在LB肉湯中振蕩過夜培養(yǎng)，備用。采用牛津杯法測定阪崎克羅諾桿菌對(duì)媽咪愛的敏感性，即：先在無菌培養(yǎng)皿底部平鋪一層10‰的無菌瓊脂，待瓊脂凝固后，在其上方均勻放置4個(gè)無菌的牛津杯，再向皿內(nèi)倒入適量的已滅菌并冷卻至55℃左右的MHA培養(yǎng)基，待其冷卻凝固后，使用涂布法將 100 μL（濃度約 108CFU/mL）阪崎桿菌菌液均勻涂布在MHA培養(yǎng)基表面。當(dāng)液體被培養(yǎng)基充分吸收后，再用無菌鑷子沿垂直于培養(yǎng)基的方向拔掉牛津杯，向牛津杯形成的孔洞中加入約100 μL媽咪愛培養(yǎng)物，37℃培養(yǎng)18～20 h后測量抑菌圈直徑。采用抑菌圈直徑和牛津杯外徑的比值表示阪崎克羅諾桿菌的敏感性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0對(duì)不同溫度、pH、微波條件下阪崎克羅諾桿菌的存活率和對(duì)媽咪愛及乳酸菌的敏感性結(jié)果進(jìn)行方差分析、多重比較（Tukey法）和卡方檢驗(yàn)，得到阪崎克羅諾桿菌的耐受性結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 阪崎克羅諾桿菌對(duì)溫度的耐受性

阪崎克羅諾桿菌經(jīng)50，60和70℃處理后的存活率見表1。50℃處理后，除12-8（1）和14-15（2）死亡較多外，其它菌株基本沒有死亡，大部分菌株反而呈生長態(tài)勢。當(dāng)溫度上升到60℃時(shí)，所有菌株都呈現(xiàn)出死亡的趨勢。70℃時(shí)，所有菌株的存活率都低于0.11%。對(duì)3種溫度處理后阪崎克羅諾桿菌濃度的對(duì)數(shù)值方差分析和多重比較（表2，表3）結(jié)果表明：50，60與70℃處理后菌株的存活率具有極顯著差異。

表1 溫度耐受試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of anti-thermal test

表2 溫度耐受試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 2 Results of variance analysis of anti-thermal test

表3 不同溫度處理后存活率多重比較結(jié)果Table 3 Results of multiple comparison of survival rate at different temperatures

2.2 阪崎克羅諾桿菌對(duì)不同pH條件的耐受性

供試菌株在pH 4.0，6.0和8.0條件下處理后的存活率見表4。3種pH條件處理后，大部分菌株出現(xiàn)不同程度死亡。13-2（1）的死亡率均相對(duì)較高，說明該菌對(duì) pH 比較敏感。18-8（1）、18-16（1）和18-12（2）經(jīng)pH處理后還出現(xiàn)增長態(tài)勢，表明對(duì)pH的耐受性非常強(qiáng)。

阪崎克羅諾桿菌經(jīng)3種pH處理后存活率方差分析和多重比較結(jié)果（表5，表6）表明：pH 4.0條件處理與pH 6.0和pH 8.0條件處理后菌液濃度的對(duì)數(shù)值在1%水平上存在極顯著差異。pH 6.0與pH 8.0條件處理后菌株存活率無顯著性差異。

表4 酸堿耐受性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of anti-acid and anti-alkaline test

表5 酸堿耐受性試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 5 Results of variance analysis of anti-acid and anti-alkaline test

表6 不同pH處理后存活率多重比較結(jié)果Table 6 Results of multiple comparison of survival rate at different pH

2.3 阪崎克羅諾桿菌對(duì)微波處理的耐受性

微波處理對(duì)菌株存活率的影響主要體現(xiàn)在微波的殺菌作用，只要微波劑量足夠，菌株基本都會(huì)死亡。研究中大部分菌株的死亡率高達(dá)99%（表7），卡方檢驗(yàn)的結(jié)果表明供試菌株的存活率間無顯著性差異（P＞0.05），即微波的殺滅作用較為普遍。

表7 微波處理后阪崎克羅諾桿菌的存活率Table 7 Survival rates of Cronobacter sakazakii after microwave treatment

2.4 阪崎克羅諾桿菌對(duì)乳酸菌的敏感性

乳酸菌在生長過程中會(huì)代謝產(chǎn)生具有抑菌活性的乳酸菌素，對(duì)革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌均有一定的抑制作用[15]。乳酸菌對(duì)阪崎克羅諾桿菌抑制的最大半徑見表8。菌株12-4（1）對(duì)乳酸菌最敏感，而 14-4（1）和15-9（2）的耐受性較強(qiáng)，表明產(chǎn)乳酸菌素的乳酸菌對(duì)阪崎克羅諾桿菌生長具有一定的抑制，多重比較結(jié)果表明不同菌株對(duì)乳酸菌的敏感性具有極顯著的差異。

2.5 阪崎克羅諾桿菌對(duì)媽咪愛的敏感性

研究中牛津杯外徑（即加樣孔直徑）為9.0 mm，抑菌圈直徑及其與加樣孔直徑的比值如表9所示。由表9可知，媽咪愛對(duì)供試阪崎克羅諾桿菌均有一定程度的抑制作用。18-16（1）對(duì)媽咪愛最為敏感，18-8（1）相對(duì)不敏感，多重比較結(jié)果表明除部分菌株對(duì)媽咪愛的敏感程度存在極顯著的差異外，其它菌株的敏感性較為相似。

表8 阪崎克羅諾桿菌對(duì)乳酸菌的敏感性Table 8 Sensitivity of Cronobacter sakazakii to Lactobacillus

表9 阪崎克羅諾桿菌對(duì)媽咪愛的敏感程度Table 9 Sensitivity of Cronobacter sakazakii to Mamiai

3 討論

阪崎克羅諾桿菌是一種常見的食源性條件致病菌，在嬰幼兒乳粉、米粉、奶酪、面包及豆腐等多種食品中均被檢出[16]。自Muytjens等[17]于1983年從沖調(diào)乳粉的器具上分離到阪崎克羅諾桿菌，繼而將其與嬰幼兒乳粉聯(lián)系起來后，世界多地，如：美國、丹麥、冰島和新西蘭等，均出現(xiàn)了由阪崎克羅諾桿菌引起的疾病暴發(fā)[18]。2011年，在美國俄克拉馬州和密蘇里州相繼發(fā)生了嬰兒感染阪崎克羅諾桿菌致死的事件，之后，美國的沃爾瑪超市及一些零售商開始大規(guī)模召回嬰幼兒乳粉[19]。這些事件的爆發(fā)表明研究與乳粉密切相關(guān)的阪崎克羅諾桿菌具有十分重要的意義。

研究中供試菌株為分離于不同時(shí)間、不同市場類型和城市中采集的不同品牌或批次的嬰幼兒乳粉或米粉，這些菌株藥敏性、基因型和攜帶的毒力基因均不相同，具有一定的代表性。研究中測試的溫度和微波處理均為日常生活中乳粉和米粉沖調(diào)時(shí)常用的水溫和加熱處理方式，測試pH范圍與嬰幼兒胃液相當(dāng)，因此研究這些理化條件對(duì)已經(jīng)污染到食品中的阪崎克羅諾桿菌生存的影響具有一定的理論和實(shí)際指導(dǎo)意義。

目前，針對(duì)阪崎克羅諾桿菌對(duì)熱及酸堿的耐受性研究較多，在國內(nèi)，陳彬等[20]（2008）發(fā)現(xiàn)，分離自奶制品中的阪崎腸桿菌對(duì)高溫都有相當(dāng)?shù)哪褪苄?，用高?0℃的水沖調(diào)奶粉時(shí)，奶粉中阪崎腸桿菌的數(shù)量會(huì)至少減少4個(gè)數(shù)量級(jí)。姜琛璐等[13]（2014）研究發(fā)現(xiàn)，分離自重慶17個(gè)區(qū)縣嬰幼兒食品中的阪崎腸桿菌對(duì)50℃均表現(xiàn)出一定的耐受性，大部分菌株在60時(shí)死亡，70℃下所有菌株基本迅速失活。在國外，Breeuwer等[21]（2003）對(duì)分離自農(nóng)場的阪崎腸桿菌的耐受性研究也表明其對(duì)熱具有一定的耐受性。本研究在70℃條件下處理20 min，所有菌株的存活率都不高于0.11%，與上述結(jié)果基本一致。

對(duì)于阪崎克羅諾桿菌耐酸堿性的研究，姜琛璐[13]（2014）、柴云雷[22]（2014）和袁飛等[8]（2005）所得結(jié)果類似，設(shè)計(jì)的條件均在pH不高于2.0且不低于12.0的范圍內(nèi)，與本研究采用的范圍不同。人體胃液的pH值約為0.9～1.5，小腸的pH值范圍較廣，為4.8～8.2[23]，而嬰幼兒的胃液 pH值偏高[24]，新生兒正常胃液的pH值為5～6.8[25]，其中母乳喂養(yǎng)的嬰幼兒胃液pH值約為2.7±0.3，奶粉喂養(yǎng)的嬰幼兒為 3.6±0.2[26]，故選取 pH 4.0，6.0和8.0 3個(gè)條件。本研究中pH 4.0處理后存活率與其它2組具有極顯著的差異，即：如果大量阪崎克羅諾桿菌進(jìn)入嬰幼兒體內(nèi)，除了胃液可能會(huì)殺死部分菌株外，侵入其他組織的菌株很難被完全殺死，與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC BAA-894存活率比較，可推測在同等條件下，pH同為4.0時(shí)，供試菌株的致病風(fēng)險(xiǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)菌株。

微波殺菌是非熱效應(yīng)和熱效應(yīng)共同作用的結(jié)果[27]，本研究主要考慮用微波爐加熱乳粉和/或米粉時(shí)微波的非熱效應(yīng)對(duì)于阪崎克羅諾桿菌的殺滅作用。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，使用研究開展實(shí)驗(yàn)室的微波爐加熱10 mL乳粉到60℃需要2 min，而之前溫度耐受性試驗(yàn)結(jié)果表明60℃對(duì)阪崎克羅諾桿菌的殺滅作用不明顯，故對(duì)供試菌株微波處理2 min，可以在一定程度上排除微波熱效應(yīng)的影響。微波對(duì)阪崎克羅諾桿菌的殺滅作用尚無明確的報(bào)道，王紹林等[28]（1993）驗(yàn)證了微波殺菌非熱效應(yīng)的觀點(diǎn)，王冬等[29]（2007）研究表明微波可以抑制并殺滅霉菌，肖平等[30]（2007）研究表明在一定火力范圍內(nèi)，鮮乳中細(xì)菌總數(shù)及大腸菌群數(shù)均隨微波火力的增強(qiáng)而減少。本研究中，對(duì)阪崎克羅諾桿菌進(jìn)行微波處理，驗(yàn)證了微波的非熱效應(yīng)對(duì)該菌的殺滅作用明顯，且供試菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株存活率間無顯著性差異，為嬰幼兒乳粉沖調(diào)提供指導(dǎo)，也為后續(xù)研究提供參考。

除理化因素對(duì)阪崎克羅諾桿菌有一定的抑制作用外，生物因素也對(duì)其有一定的影響。健康人體腸道中常駐有乳酸菌，即使乳粉或米粉中污染的阪崎克羅諾桿菌未在沖調(diào)過程被殺死，隨食品進(jìn)入腸道后，腸道內(nèi)乳酸菌也會(huì)對(duì)其產(chǎn)生拮抗或抑制作用。杜靜芳等[31]（2016）在篩選和鑒定拮抗阪崎腸桿菌乳酸菌時(shí)，采用雙層瓊脂擴(kuò)散法產(chǎn)生抑菌圈直徑大小來衡量該乳酸菌對(duì)阪崎腸桿菌的抑制作用，其抑菌圈直徑最大為19.89 mm。吳玲等[32]（2011）采用管碟法對(duì)分離自泡菜中的乳酸菌對(duì)阪崎腸桿菌的抑制作用結(jié)果表明乳酸菌對(duì)其具有一定的抑制作用，其抑菌圈直徑最大為16.2 mm。本研究采用的抑菌方法有所不同，但結(jié)果基本一致，不同菌株對(duì)乳酸菌的敏感程度有明顯差異，腸道內(nèi)乳酸菌可能不會(huì)完全殺死進(jìn)入腸道的阪崎桿菌。當(dāng)嬰幼兒由于阪崎克羅諾桿菌進(jìn)入其體內(nèi)引起腹瀉后，會(huì)服用媽咪愛等微生態(tài)制劑類嬰幼兒藥物，其主要成分為糞鏈球菌和枯草桿菌。鐘有添等[33]（2006）研究了媽咪愛對(duì)腸道致病菌、條件致病菌及其L型的抑菌作用，結(jié)果表明媽咪愛在體外對(duì)大腸埃希菌、福氏志賀菌、傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、自假絲酵母菌及其L型皆有不同程度的抑菌作用，并且濃度越大，抑菌作用越強(qiáng)。目前，媽咪愛對(duì)阪崎克羅諾桿菌的抑制作用的研究尚未報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株與大部分供試菌株對(duì)媽咪愛的敏感程度較為相似，媽咪愛對(duì)阪崎克羅諾桿菌引起的疾病有一定的治療效果。

嬰幼兒食品安全問題已成為當(dāng)前人們最關(guān)注的食品安全問題之一。研究阪崎克羅諾桿菌對(duì)溫度、酸堿及微波的耐受性，這將為嬰幼兒乳粉/米粉的合理沖調(diào)提供指導(dǎo)，了解其對(duì)乳酸菌和媽咪愛的敏感性，有助于保障嬰幼兒食品安全及嬰幼兒身體健康。另外，獲得阪崎克羅諾桿菌對(duì)微波的耐受性及對(duì)媽咪愛的敏感性結(jié)果，可以為日后研究微波的非熱效應(yīng)及微生態(tài)制劑對(duì)阪崎克羅諾桿菌的殺滅作用提供理論基礎(chǔ)。