王家浩， 李永磊， 黨 健， 賀劉毅， 喬 敏， 汪春蕾

(東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150040)

銀是天然環(huán)保的、優(yōu)異的廣譜殺菌劑，而且不產(chǎn)生耐藥性。隨著研究的深入以及納米技術(shù)的發(fā)展，納米銀以其優(yōu)異的物理化學(xué)性質(zhì)，在近幾年得到快速發(fā)展，而其在抑菌滅菌方面的突出功效引起了科研人員的廣泛關(guān)注[1]。納米銀粒子直徑為1～100 nm，抗菌能力很強(qiáng)。納米銀與銀離子相比，具有比表面積大，抑菌活性強(qiáng)和穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥載體、水質(zhì)凈化、抗菌涂料和催化等領(lǐng)域[2]。

納米銀能穿透微生物的細(xì)胞壁，進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)，與蛋白質(zhì)的巰基結(jié)合后破壞細(xì)菌的呼吸鏈，產(chǎn)生活性氧簇，氧化并殺死細(xì)菌[3]。與傳統(tǒng)物理和化學(xué)的合成方法相比，納米銀的微生物合成法是一種環(huán)境友好的可持續(xù)發(fā)展方法，具有綠色環(huán)保、低成本、低能耗、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)[4]，已經(jīng)成為納米銀合成領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[5]。因此，篩選出新穎的具有納米銀合成能力的菌株，以擴(kuò)大菌種的范圍，具有非常重要的意義。

銀離子具有較強(qiáng)的殺菌作用，因此只有對(duì)銀離子有較強(qiáng)抗性的菌株才能作為合成納米銀的菌株[4]。筆者從泥水混合樣中篩選分離到1株具有合成納米銀的芽孢桿菌屬菌株Ag2，通過(guò)透射電鏡(TEM)和X射線衍射(XRD)技術(shù)對(duì)該菌株合成的粒子進(jìn)行表征，并研究了納米銀的抑菌作用，以期為新型殺菌技術(shù)提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品泥水混合樣采自黑龍江省哈爾濱市馬家溝東北林業(yè)大學(xué)流段。

1.1.2試劑細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(Bacteria DNA Kit)、Taq DNA Polymerase和E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技有限公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購(gòu)買于杭州濱和微生物試劑有限公司；Agarose Gel DNA Extraction Kit、DNA Marker DL2000、dNTP和pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司；16S rDNA通用引物27F和1492R由華大基因公司合成；其余常規(guī)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純制品。

1.1.3培養(yǎng)基液體選擇培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物 5 g/L，pH 7.0。固體選擇培養(yǎng)基：0.7 mmol/L AgNO3，胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物 5 g/L，瓊脂 15 g/L，pH 7.0。

1.2菌種篩選與鑒定方法

1.2.1菌種篩選稱量泥水混合樣3 g，加至30 mL蒸餾水中制成懸濁液，取懸濁液3 mL接種至液體選擇培養(yǎng)基中，150 r/min，避光，30℃培養(yǎng)2 d，傳代培養(yǎng)于含0.1 mmol/L AgNO3的液體選擇培養(yǎng)基中，150 r/min，避光，30℃培養(yǎng)2 d，取菌體培養(yǎng)液2.0 mL分別接種至AgNO3濃度為0.1 mmol/L、0.3 mmol/L、0.5 mmol/L、0.7 mmol/L和0.9 mmol/L的液體選擇培養(yǎng)基中，150 r/min，避光，30℃培養(yǎng)7 d。將生長(zhǎng)在含0.7 mmol/L AgNO3培養(yǎng)基中的菌液涂布于固體選擇培養(yǎng)基上，避光，30℃培養(yǎng)2 d。將長(zhǎng)勢(shì)良好的單克隆劃線純化培養(yǎng)3次[6]。

1.2.2菌種鑒定選取長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株Ag2進(jìn)行革蘭氏染色，并利用生理生化反應(yīng)管測(cè)定菌株Ag2對(duì)糖的利用及各種生理生化反應(yīng)特性[7]。

利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株Ag2的基因組DNA，以菌株Ag2基因組DNA為模板，以27F和1492R為引物擴(kuò)增菌株Ag2的16S rDNA基因[8]。PCR體系和反應(yīng)條件見(jiàn)參考文獻(xiàn)[9]，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，使用Agarose Gel DNA Extraction Kit回收16S rDNA片段。回收的16S rDNA與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，連接體系、轉(zhuǎn)化及反應(yīng)條件見(jiàn)參考文獻(xiàn)[10]。

轉(zhuǎn)化子用氨芐青霉素篩選后，將經(jīng)菌落PCR鑒定為陽(yáng)性的單克隆送至華大基因有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。利用CExpress對(duì)所測(cè)得的原始序列進(jìn)行拼接，在NCBI官網(wǎng)進(jìn)行BLAST分析，用Phylip-3.69中的最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建基于16S rDNA序列菌株Ag2的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[11]。

1.3菌株Ag2合成產(chǎn)物的提取與表征

向菌液中連續(xù)3 d分3次補(bǔ)加AgNO3，使培養(yǎng)液中Ag+終濃度為0.7 mmol/L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)1 d。離心菌體培養(yǎng)液，將菌體沉淀和培養(yǎng)液上清(樣品1)分離，無(wú)菌水洗滌菌體沉淀3次，去除附著的有機(jī)物。向菌體沉淀中加20 mL無(wú)菌水，超聲波破胞，功率200 W，工作與停止各15 s交替進(jìn)行30 min，離心后分別收集破胞后的上清(樣品2)和沉淀(樣品3)。使用透射電子顯微鏡檢測(cè)樣品1、樣品2和樣品3。樣品3經(jīng)真空干燥后，進(jìn)行XRD檢測(cè)分析。

1.4納米銀粒子抑菌效果

取大腸桿菌和枯草芽孢桿菌接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，將培養(yǎng)后的菌液稀釋1000倍，取100 μL稀釋后的菌液涂布于LB固體平板上，用黃色槍頭在平板上打2個(gè)孔，向2個(gè)樣品孔中分別加入40 μL無(wú)菌水和40 μL 50 mg/mL的樣品3，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，觀察抑菌效果。

2結(jié)果與分析

2.1篩選菌種

樣品經(jīng)篩選、分離和純化后得到5個(gè)單菌落，其中菌株Ag2長(zhǎng)勢(shì)最好，可用于試驗(yàn)。菌株Ag2在含0.1～0.9 mmol/L AgNO3的選擇培養(yǎng)基中均有生長(zhǎng)，AgNO3濃度大于0.5 mmol/L的培養(yǎng)液顏色由黃色變?yōu)楹谏?，納米銀溶于水時(shí)的顏色為黑色[12]，表明該菌株具有合成納米銀的能力。

2.2鑒定菌種

2.2.1形態(tài)鑒定菌株Ag2的菌落為白色，圓形且表面光滑，革蘭氏染色結(jié)果呈紫色(圖1)，為革蘭氏陽(yáng)性桿菌。菌株Ag2可以利用葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖和麥芽糖作為碳源，具有淀粉水解酶、硝酸鹽還原酶、馬尿酸水解酶和精氨酸雙水解酶的活性(表1)。

圖1 菌株Ag2革蘭氏染色形態(tài)(×1 000)

表1 菌株Ag2的生理生化反應(yīng)

注：+表示陽(yáng)性反應(yīng)，-表示陰性反應(yīng)。

Note:+ indicates positive and - indicates negative.

2.2.2分子鑒定以提取菌株Ag2的總DNA為模板，克隆的16S rDNA條帶清晰明亮，長(zhǎng)度約1 500 bp，無(wú)非特異性擴(kuò)增條帶(圖2)。經(jīng)測(cè)序，菌株Ag2的16S rDNA大小為1 513 bp，提交Genbank后的序列號(hào)為MK920167。在NCBI上經(jīng)BLAST比對(duì)分析，菌株Ag2的16S rDNA序列與多種芽孢桿菌屬的細(xì)菌具有較高相似度，確定該菌株屬于芽孢桿菌屬。由圖3可見(jiàn)，菌株Ag2與枯草芽孢桿菌、死谷芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌聚為一類。

注：M，分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2 000；泳道1，空白對(duì)照；泳道2，樣品。

Note: M,DL2 000 marker; Lane 1, blank control; Lane 2, sample.

圖2菌株Ag2的16S rDNA的PCR電泳圖譜

Fig.2 PCR electrophoresis of 16S rDNA of strain Ag2

圖3 基于16S rDNA序列菌株Ag2的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3菌株Ag2合成納米銀粒子的表征

菌株Ag2與AgNO3共培養(yǎng)后在透射電鏡下均可觀察到納米粒子，分散性良好。菌體破胞沉淀樣品(樣品3)中粒子的密度和粒徑(圖4A)均大于培養(yǎng)液上清(樣品1)與破胞后上清樣品(樣品2)中的納米粒子(圖4B、C)，粒徑在10～20 nm，在高倍鏡下可清晰地觀測(cè)到樣品3中粒子的晶格結(jié)構(gòu)(圖4D)，其晶格條紋間距為0.229 nm，與Jade 6.5提供的PDF#04-0783卡片中納米銀晶體數(shù)據(jù)相符。從菌體破胞沉淀樣品(樣品3)的X射線衍射分析圖譜(圖5)可看出，菌株Ag2合成納米銀的晶面指數(shù)包含(111)、(200)、(222)和(311)4種類型，為多晶結(jié)構(gòu)，且以(111)型納米銀含量最多。

注：A和D，菌體破胞沉淀樣品(樣品3);B,培養(yǎng)液上清(樣品1) ;C,破胞后的上清樣品(樣品2)。

Note: A and D, precipitatesample after cell broken (sample 3); B,culture solutionsupernatant (sample 1); C,supernatant sample after cell broken (sample 2).

圖4透射電鏡下菌株Ag2制備的納米粒子

Fig.4 Nanoparticles prepared by strain Ag2 under transmission electron microscopy

圖5 XRD鑒定菌株Ag2合成的納米銀

Fig.5 Silver nanoparticles synthesized by strain Ag2 under XRD

2.4納米銀粒子的抑菌效果

菌株Ag2胞內(nèi)合成的納米銀粒子對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均具有殺菌能力(圖6)，表現(xiàn)出很強(qiáng)的應(yīng)用潛力。

注：A，大腸桿菌;B,枯草芽孢桿菌;樣品孔1,樣品3;樣品孔2,無(wú)菌水。

Note: A,Escherichiacoli;B,Bacillussubtilis; sample hole 1,sample 3; sample hole 2, sterile water.

圖6菌株Ag2胞內(nèi)合成納米銀的抑菌效果

Fig.6 Antibacterial effect of silver nanoparticles intracellular synthesised by strain Ag2

3結(jié)論與討論

研究利用篩選出的芽孢桿菌屬菌株Ag2與AgNO3共培養(yǎng)，在菌體細(xì)胞內(nèi)部大量合成了納米銀粒子，其粒徑在10～20 nm，晶面條紋間距為0.229 nm，與納米銀(111)的晶面間距相符，納米銀粒子對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有抑菌效果。

利用化學(xué)法制備納米粒子具有一定的毒性，而生物法制備納米粒子，綠色環(huán)保，認(rèn)可度高[13]。細(xì)菌合成納米銀粒子主要有菌液胞內(nèi)合成與培養(yǎng)上清液胞外合成2種方式[4]，菌株Ag2的胞內(nèi)外均合成了納米銀，菌株Ag2與AgNO3共培養(yǎng)后，培養(yǎng)液變?yōu)楹谏?，表明有納米粒子的合成，但透射電鏡結(jié)果表明，胞外合成的納米粒子密度及粒徑均小于菌體細(xì)胞內(nèi)合成的納米粒子。菌株Ag2具有硝酸鹽還原酶的活性，推測(cè)其與納米銀的合成有關(guān)[14]。

單質(zhì)銀具有殺菌功能，而納米銀粒子比表面積大，粒徑小，與細(xì)菌的接觸幾率大，具有更強(qiáng)的殺菌能力。菌株Ag2胞內(nèi)合成的納米銀粒子對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均具有殺菌效果。抑菌環(huán)是納米銀粒子殺菌效果的直接證明[15]。研究篩選出的菌株Ag2提供了生物合成納米銀的新菌株，利用菌株Ag2進(jìn)行生物方式合成的納米銀粒子具有抗菌應(yīng)用潛力。