于永昂， 王潤豪， 胡海燕， 李成偉

(河南科技學(xué)院 生命科技學(xué)院， 河南省糧食作物基因組編輯工程技術(shù)研究中心， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

近年來，由于工業(yè)“三廢”的不合理排放以及農(nóng)藥化肥不合理的使用，導(dǎo)致土壤中的重金屬鎘含量急劇增加[1-3]。其中，土壤鎘污染超標(biāo)率居首位，超標(biāo)率達(dá)7.0%[4]。鎘(Cadmium，Cd)是植物生長發(fā)育的非必需元素，其毒性強(qiáng)、污染范圍廣、遷移性強(qiáng)，極易被植物吸收積累，不僅嚴(yán)重影響作物生長發(fā)育，降低其產(chǎn)量和品質(zhì)，而且能通過食物鏈富集，危害人體健康，會產(chǎn)生致畸、致癌及致突變等效應(yīng)[5-7]。隨著工業(yè)進(jìn)程的快速發(fā)展，鎘超標(biāo)農(nóng)產(chǎn)品報道日益增多，鎘進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)危害人類健康的現(xiàn)象日益增多，嚴(yán)重影響農(nóng)產(chǎn)品的食用安全和人類健康[8]。鎘對土壤的污染已成為人們所面臨且亟待解決的環(huán)境污染問題之一。

植物種子在萌發(fā)期對外界環(huán)境較為敏感，鎘對植物生長發(fā)育具有明顯的毒害作用，對種子的萌發(fā)產(chǎn)生不同程度的刺激和抑制作用，影響植株的生長發(fā)育進(jìn)程，導(dǎo)致植株生長遲緩、植株矮小、葉片泛黃等癥狀[9]。 鎘在植物中累積到一定程度后會阻礙光合作用和呼吸作用[10-11]，降低蒸騰速率，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)的多種損傷，改變細(xì)胞膜的透性，破壞細(xì)胞內(nèi)酶及代謝作用[12]，導(dǎo)致養(yǎng)分虧缺，生理生化過程紊亂，最終使植物的生長發(fā)育受到不同程度的抑制，嚴(yán)重時可導(dǎo)致死亡[13]。因此，植物通過抗氧化防御機(jī)制抵抗鎘的毒性[14]，抗氧化酶系統(tǒng)可有效地預(yù)防或降低植物過氧化作用帶來的損傷并抑制 MDA的積累[15]。重金屬被植物吸收以后，通過調(diào)節(jié)生理和生物化學(xué)新陳代謝過程緩解或者去除鎘的毒害，主要通過對重金屬的吸收運(yùn)輸、各部位的分配方式以及與植物體內(nèi)物質(zhì)的結(jié)合形態(tài)等因素克服重金屬脅迫危害[16]。如通過植物細(xì)胞壁固定或區(qū)隔在液泡內(nèi)，根際 pH的改變，或通過氨基酸、蛋白質(zhì)及多肽與 鎘結(jié)合，積累、儲存并固定等方式。研究表明， 鎘的亞細(xì)胞分布與植物的金屬耐性及解毒機(jī)制有關(guān)，亞細(xì)胞鎘主要分布在根系細(xì)胞壁內(nèi)[17]。因此，鎘在植物中的器官積累及亞細(xì)胞分布規(guī)律是影響植物體內(nèi)鎘遷移、積累特性和植物毒性的重要因素。

小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一，同樣也是中國第二大糧食作物，其在全世界的糧食安全中占據(jù)重要地位[18]。小麥作為鎘積累型作物，對鎘具有較強(qiáng)的耐性，具有潛在的鎘污染風(fēng)險。目前，鎘的植物毒性機(jī)制研究主要集中在光合特性、根系特性、種子萌發(fā)、植株酶活性及植物生理生化影響等方面[19-20]，關(guān)于小麥器官及亞細(xì)胞不同組分鎘積累分配差異，小麥解毒及耐性機(jī)制尚缺乏較為深入的研究。因此，研究小麥在鎘脅迫下的植物毒性機(jī)制及應(yīng)答機(jī)制，對于提高小麥對鎘的抗/耐性，改良糧食作物品質(zhì)，降低鎘從植物進(jìn)入食物鏈的危險性具有十分重要的理論和實(shí)踐指導(dǎo)意義。為此，采用水培法研究不同濃度鎘脅迫下，小麥種子的發(fā)芽率變化，在小麥幼苗器官中鎘的分布規(guī)律及其對鎘的吸收和積累差異，以期為鎘在小麥體內(nèi)的遷移機(jī)理以及小麥耐鎘機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

小麥：品種為百農(nóng)207，由河南科技學(xué)院小麥遺傳改良中心提供。

1.2試驗方法

1.2.1材料處理試驗設(shè)4個鎘濃度處理，分別為0 mmol/L(蒸餾水，對照)、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L和2.0 mmol/L。選取飽滿均勻一致的小麥種子，用1%的 NaClO消毒15 min后，用去離子水沖洗干凈，播于鋪有雙層直徑 15 cm無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿擺放種子50粒。每日加 10 mL不同濃度鎘溶液，于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽，培養(yǎng)箱光周期為光照16 h/黑暗8 h，相對濕度(75±5)%，每個處理3次重復(fù)，7 d后開始測定發(fā)芽率、幼苗生長狀況和生理生化指標(biāo)。

發(fā)芽勢= 4 d內(nèi)供試種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽率= 7 d內(nèi)供試種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%

1.2.2樣品的處理與測定

1) 小麥測定樣品的處理。選取5株長勢一致的小麥，用去離子水沖洗干凈，再用20 mmol/LNa2-EDTA浸泡30 min，去除根系吸附的鎘，自來水沖洗 3～4次，最后用去離子水潤洗，吸干表面水分，分成根系和地上部2個部分。根系和地上部再分成2部分，一部分在105℃殺青20 min，于 80℃烘干至恒重，稱量地上部和根干重，粉碎，用于鎘含量測定；另一部分保存于-20℃冰箱內(nèi)備用，分別用于生理生化指標(biāo)和植株亞細(xì)胞組分鎘含量的測定。

2) 小麥幼苗生理生化指標(biāo)的測定。各處理結(jié)束后，用丙酮提取法測定小麥葉片的葉綠素(CHL)含量；用硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)含量；超氧化物歧化酶活性(SOD)采用NBT光還原法測定；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定；過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法測定。

3) 小麥幼苗亞細(xì)胞內(nèi)鎘含量的測定。采用WANG等[21]的方法分離根系和地上部亞細(xì)胞組分。取出預(yù)處理好的冰凍植物樣，稱取2 g剪碎，用植物樣品與提取液[0.25 mol/L蔗糖+1 mmol/L二硫赤蘚糖醇+50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)]按1∶10的比例混合后迅速將樣品研磨成勻漿。研磨時先放入少量提取液，將大塊的植物樣品盡量磨細(xì)后，再加入大量的提取液磨成勻漿，然后轉(zhuǎn)移到 50 mL離心管中，3 000 r/min離心30 s，下部沉淀和底層碎片為細(xì)胞壁組分(F1)，得到的上清液在 10 000 r/min離心分離 30 min，下部沉淀為細(xì)胞器組分(F2)，上清液為可溶組分(F3)，全部操作在4℃下進(jìn)行。

4) 樣品中鎘含量測定。稱取烘干并粉碎后的樣品0.2 g和亞細(xì)胞分離出的組分用1∶4(V/V)的HNO3-HClO4混合消煮，定容、過濾，最后采用ICP-OES測定其鎘含量。亞細(xì)胞分離出的各組分無需消化，直接用原子吸收光譜儀測定鎘含量。

1.3數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用Excel和SAS 8.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1鎘脅迫對小麥種子萌發(fā)的影響

小麥種子在鎘脅迫條件下能否正常萌發(fā)是其能否在鎘污染土壤中生長的先決條件。用于反映種子萌發(fā)的重要參數(shù)是發(fā)芽勢和發(fā)芽率，發(fā)芽勢反映種子的發(fā)芽速度和整齊度，發(fā)芽率反映種子發(fā)芽多少，是種子質(zhì)量的綜合反映。由圖1可知，隨著鎘濃度的升高，小麥種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率均逐漸下降。所有鎘處理小麥種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢均顯著低于對照。當(dāng)鎘脅迫濃度為2.0 mmol/L時，其發(fā)芽勢和發(fā)芽率最低，分別為45%和53%。

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)水平，下同。

Note:Different letters indicate significant difference atP<0.05 level，the same below.

圖1不同濃度鎘脅迫下小麥種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率

Fig.1 Germination potential and germination rate of wheat seeds under cadmium stress with different concentration

2.2鎘脅迫對小麥葉綠素及丙二醛含量的影響

2.2.1葉綠素葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的重要色素，其含量是判斷植物光合效率及其同化能力的重要指標(biāo)之一。由圖2可知，隨著鎘濃度的增加，小麥幼苗葉片葉綠素含量逐漸降低，且各處理均顯著低于對照，鎘濃度0.5 mmol/L、1.0 mmol/L和2.0 mmol/L處理分別較對照降低41.82%、47.27%和76.36%。表明，隨著鎘濃度增加，小麥幼苗的光合作用受到抑制，進(jìn)而影響幼苗的生長和發(fā)育。

2.2.2丙二醛(MDA)丙二醛含量是植物組織在逆境下遭受氧化脅迫發(fā)生膜脂過氧化的產(chǎn)物,其含量高低反映膜受損程度。從圖2可知，隨著鎘濃度的增加，小麥幼苗葉片中MDA含量逐漸上升。鎘濃度0.5 mmol/L、1.0 mmol/L和2.0 mmol/L處理的MDA含量較對照顯著增加，分別增加213.65%、617.33%和690.67%。表明，隨著鎘濃度的增加，引起小麥葉片內(nèi)膜脂過氧化，從而引起膜的嚴(yán)重?fù)p傷。

圖2 不同濃度鎘脅迫小麥幼苗葉片的葉綠素及丙二醛含量

2.3鎘脅迫對小麥抗氧化酶活性的影響

植物體內(nèi)抗氧化保護(hù)酶活性的高低是反映植物對逆境適應(yīng)的重要指標(biāo)。從圖3可知，隨著鎘脅迫濃度的增大，小麥幼苗葉片的SOD、POD和CAT活性均呈先升后降趨勢。在鎘濃度為0.5 mmol/L時SOD活性最大，與對照相比增加60.71%，且差異顯著。當(dāng)鎘濃度為2.0 mmol/L時，SOD活性最低，比對照降低9.52%，但與對照無顯著差異，其原因可能是高濃度鎘直接抑制SOD活性，或者對SOD酶基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯過程產(chǎn)生抑制。CAT和POD活性在鎘脅迫下的變化規(guī)律與SOD類似，均在鎘濃度為0.5 mmol/L時達(dá)到最大，分別比對照增加154.05%和183.33%，且均與對照差異顯著；鎘濃度為2.0 mmol/L時，與對照相當(dāng)。

圖3 不同濃度鎘脅迫小麥的抗氧化酶活性

2.4鎘脅迫對小麥幼苗根系及地上部鎘含量的影響

從表1可知，隨著鎘處理濃度的提高，小麥根系和地上部的鎘含量顯著增加；在同一鎘濃度下，小麥根系的鎘含量顯著高于地上部分。其中，鎘濃度0.5 mmol/L、1.0 mmol/L和2.0 mmol/L處理小麥根系的鎘含量分別是地上部的16.38倍、12.80倍和8.7倍。

表1不同鎘濃度處理小麥根系和地上部的鎘含量

Table 1 Cadmium content in aboveground part and root of wheat treated with different cadmium concentrations mg/kg

鎘濃度/(mmol/L)cadmium concentration根系Root地上部Aboveground part0.52 998.86±92.21 c183.05±2.24 c1.04 076.46±103.52 b318.59±2.27 b2.04 705.93±13.32 a540.61±2.19 a

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note:Different lowercase letters in the same column indicate significant difference atP<0.05 level.The same below.

2.5鎘在小麥幼苗亞細(xì)胞組分中的分布

從表2可知，隨著鎘濃度的升高，小麥根系和地上的細(xì)胞壁組分和細(xì)胞器組分的鎘含量均顯著上升，且差異顯著；可溶組分均呈先升后降的變化趨勢，且差異顯著。不同濃度鎘處理下，各亞細(xì)胞組分吸附鎘的比例均呈細(xì)胞器>細(xì)胞壁>可溶組分；鎘濃度為0.5 mmol/L時對小麥已產(chǎn)生了嚴(yán)重傷害。根系累積的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于地上部的速度，同一鎘濃度處理時，地上部亞細(xì)胞中的鎘含量遠(yuǎn)低于根系。不同濃度鎘處理后，鎘在根系細(xì)胞器中的分布比例為78.07%～90.15%，在整個細(xì)胞亞細(xì)胞組分中占絕對優(yōu)勢；在細(xì)胞壁中的分布比例為9.81%～21.50%。鎘處理后小麥地上部細(xì)胞器、細(xì)胞壁和可溶組分的鎘分配比例分別為50.97%～62.71%、36.93%～48.76%和0.27%～0.87%。鎘脅迫下可溶組分的鎘含量在根系和地上部的比例含量均低于1%。

表2 不同濃度鎘處理在小麥亞細(xì)胞的分布

3結(jié)論與討論

3.1結(jié)論

在鎘脅迫下，小麥種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢明顯降低，小麥幼苗的葉綠素含量隨著鎘脅迫濃度的增加逐漸降低，SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性均隨著鎘濃度的增加呈先升后降趨勢，均在鎘濃度0.5 mmol/L時達(dá)最大。在同一鎘濃度下，小麥根系鎘含量顯著高于地上部；地上部亞細(xì)胞中的鎘含量遠(yuǎn)低于根系。小麥地上部和根系大部分的鎘分布在細(xì)胞壁和細(xì)胞器中，而在可溶組分中的分布較少。

3.2討論

種子萌發(fā)是作物生長的關(guān)鍵時期和對外界脅迫最敏感的階段，種子發(fā)芽質(zhì)量好壞與農(nóng)作物生長和經(jīng)濟(jì)效益之間有著直接的關(guān)系，通過觀察種子發(fā)芽對外源鎘的響應(yīng)，可以更加深入了解鎘脅迫對植物的毒害作用[22]。鎘是重金屬元素，是植物生長過程的非必需元素，但鎘脅迫會對種子萌發(fā)和幼苗生長產(chǎn)生不同程度的影響。一般來說，種子的發(fā)芽勢高，其種子的生命力就較強(qiáng)，種子出苗整齊一致，而發(fā)芽率則能夠反映種子的出苗情況。研究結(jié)果表明，鎘脅迫處理顯著降低小麥種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率，抑制小麥種子的萌發(fā)。光合作用是一個高度自我調(diào)節(jié)的過程，逆境過程可能會導(dǎo)致植株超微結(jié)構(gòu)的改變和功能的破壞，由此光合速率被抑制[23]。研究結(jié)果表明，在小麥苗期，隨著鎘濃度升高，小麥幼苗葉綠素含量降低，光合作用受到抑制，阻礙了小麥的生長和發(fā)育。

在逆境脅迫下，通常植物會產(chǎn)生高度反應(yīng)性的活性氧自由基(ROS)，而活性氧積累到一定水平便會誘發(fā)膜脂不飽和脂肪酸發(fā)生連鎖的過氧化反應(yīng)，使膜結(jié)構(gòu)遭受破壞、細(xì)胞功能失常，甚至造成植株死亡。植物可通過抗氧化系統(tǒng)、體內(nèi)細(xì)胞的作用和根部截留等抗性機(jī)理來減少重金屬的毒害，而抗氧化系統(tǒng)在植物抵抗逆境時至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，隨著鎘濃度的增加，MDA含量顯著增加，說明在鎘脅迫下，小麥幼苗中積累了大量的有害物質(zhì)，對小麥的細(xì)胞膜系統(tǒng)造成了嚴(yán)重?fù)p害。此外，小麥的抗氧化酶系統(tǒng)酶活性(SOD、POD和CAT)均隨鎘脅迫濃度的增加呈先升后降的變化規(guī)律，說明小麥具有一定的適應(yīng)和抵抗鎘傷害的能力，但鎘濃度較高時，小麥幼苗的細(xì)胞發(fā)生了嚴(yán)重?fù)p傷，其酶活性出現(xiàn)不可逆下降，與何俊瑜等[24-25]研究結(jié)果一致。隨著鎘脅迫濃度的增加，小麥根系和地上部中鎘含量顯著增加，同一鎘濃度處理下，根系中的鎘含量高于地上部，該結(jié)果與鎘在植物體內(nèi)分布的普遍規(guī)律即地下部大于地上部結(jié)果一致。鎘對植物的危害程度與其在亞細(xì)胞中的分布密切相關(guān)。研究結(jié)果表明，鎘脅迫下，小麥根系和地上部中鎘主要分布在細(xì)胞器和細(xì)胞壁中，在可溶組分中較少。與大多數(shù)研究結(jié)果不一致，其原因可能是不同植物有不同的解毒機(jī)制，同時也可能與該研究采用的鎘處理濃度有著一定的關(guān)系。