韋 宇， 李孝瓊， 陳 穎， 劉開強， 郭嗣斌*

(1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所/廣西水稻遺傳育種重點實驗室， 廣西 南寧 530007； 2.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 廣西 南寧 530007)

水稻病毒病是水稻三大病害之一，有水稻“癌癥”之稱，嚴(yán)重威脅著我國的糧食安全。與普通水稻黑條矮縮病不同，南方水稻黑條矮縮病是一種以白背飛虱為傳播媒介的水稻病毒病，其病原病毒為南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)，是呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟病毒屬(Fijivirus)第2組的一個新種[1]，該病于2001年在廣東省陽西縣晚稻田中首次被發(fā)現(xiàn)，在短短的幾年間病情蔓延迅猛，給我國南方廣大稻區(qū)及越南北部水稻生產(chǎn)造成了極大損失，甚至絕收[2]。目前，對南方水稻黑條矮縮病毒病的防治仍以防治飛虱為主，但長期施藥易使飛虱產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致病害再次爆發(fā)[3-4]。實踐證明，發(fā)掘并利用新抗源培育抗病新品種是控制水稻病害最經(jīng)濟有效和最環(huán)保的措施。挖掘南方水稻黑條矮縮病抗性資源、鑒定和定位抗性基因是當(dāng)前我國南方稻區(qū)水稻抗病育種的當(dāng)務(wù)之急。

國際上對由SRBSDV引起的南方水稻黑條矮縮病的研究主要集中在病毒檢測、分子生物學(xué)特點、發(fā)生危害及綜合治理等方面[2-11]，抗源鑒定與評價工作目前還處于起步階段，僅有幾篇關(guān)于抗性材料篩選的報道[12-15]。研究表明，生產(chǎn)上尚未普遍使用抗性品種來防治南方水稻黑條矮縮病病害，主要問題是抗性鑒定及品種培育存在技術(shù)困難，且耗時過長[16]。迄今為止，對南方水稻黑條矮縮病抗性的遺傳研究及抗性基因挖掘研究僅見零星報道[17-18]。農(nóng)保選等[17-18]對419個廣西地方稻種資源核心種質(zhì)的SRBSDV苗期抗性進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共檢測到8個抗病基因(R基因)，分別位于第1、第5及第11染色體上，可能參與SRBSDV苗期抗性的調(diào)控；利用來源于普通野生稻高抗SRBSDV的導(dǎo)入系D4為材料，將與水稻SRBSDV苗期抗性相關(guān)的主效QTL定位于第9染色體上102.3 kb處，將其命名為qSRBSDV9。

在前期研究中，廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所利用1份抗南方水稻黑條矮縮病的小粒野生稻(Oryzaminuta)基因滲入系桂恢1561和高感病品種桂1025雜交構(gòu)建F2為作圖群體，繪制了遺傳連鎖圖譜，并完成了重組自交系(Recombinant inbred lines, RILs)的構(gòu)建。為南方水稻黑條矮縮病的抗性育種提供新的基因資源，筆者等對桂1025/桂恢1561的重組自交系群體進行南方水稻黑條矮縮病抗性鑒定，對其抗性進行遺傳分析，并利用QTLNetwork-2.2軟件對RILs的南方水稻黑條矮縮病抗性 QTL 進行定位，旨在為南方水稻黑條矮縮病抗性育種提供基礎(chǔ)材料和理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

桂恢1561來自小粒野生稻基因滲入系，抗南方水稻黑條矮縮病；桂1025為三系雜交稻恢復(fù)系，高感南方水稻黑條矮縮病。2010年晚季廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所以桂恢1561(抗病親本)為父本，以桂1025(感病親本)為母本，經(jīng)雜交、自交，獲得F2遺傳分離群體，并構(gòu)建了包含210份個體的重組自交系群體(F8)。重組自交系種植于專用病圃進行抗性鑒定，感病對照 Taichung Native (TN1) 由中國水稻研究所提供，廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所繁殖和保存。抗病對照中浙優(yōu)8號，由浙江勿忘農(nóng)種業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

1.2試驗方法

1.2.1南方水稻黑條矮縮病抗性鑒定南方水稻黑條矮縮病是以白背飛虱為傳播媒介的水稻病毒病，其病原病毒為南方水稻黑條矮縮病毒。選擇廣西壯族自治區(qū)興安縣湘漓鎮(zhèn)麥源村的病圃(東經(jīng)110°14′，北緯25°17′)為鑒定圃，該病圃位于我國白背飛虱遷飛的重要通道，雖然白背飛虱發(fā)生程度年度間有差異，但各年均有發(fā)生[20-21]。鑒定圃的白背飛虱量越大，其南方水稻黑條矮縮病抗性鑒定越有效，鑒定效果越可靠?？剐澡b定參照于文娟等[15]的鑒定方法，于2016年4月26日播種感病對照品種TN1、抗性對照中浙優(yōu)8號及210份重組自交系，秧田較常規(guī)管理增施尿素75 kg/hm2，苗期不使用殺蟲劑和殺菌劑。

6月6日移栽，將TN1(感病對照品種)作誘發(fā)南方水稻黑條矮縮病材料，TN1種植小區(qū)每行單本移栽6株(株距 15 cm、行距18 cm)。重組自交系穿插于TN1小區(qū)之間種植，每個重組自交系種植5行，每行10株(株距 15 cm、行距18 cm)，隨機區(qū)組排列，重復(fù)3次。抗病對照中浙優(yōu)8號每個重復(fù)種植1個小區(qū)，種植規(guī)格同重組自交系。大田管理較常規(guī)肥水管理增施尿素150 kg/hm2，除拔節(jié)初期用殺蟲雙防治1次稻縱卷葉螟外，其他生長期不使用殺蟲劑和殺菌劑。

移栽50 d后采用盤拍法調(diào)查對照及重組自交系材料的白背飛虱蟲量。在黃熟期，將明顯矮縮株和具高位分蘗的單株記為病株，調(diào)查各小區(qū)內(nèi)50叢水稻的死亡株和存活的病株數(shù)。由于病圃內(nèi)褐飛虱發(fā)生較重而引起部分植株枯死，為排除褐飛虱引起的枯死株影響，計算時以存活單株的矮縮株除以存活株總數(shù)計算南方水稻黑條矮縮病發(fā)病率。發(fā)病率= (存活病株數(shù)/存活株數(shù)) ×100%。以3個重復(fù)的發(fā)病率平均值作為重組自交系各株系的抗南方水稻黑條矮縮病表型值。抗性分級標(biāo)準(zhǔn)：1 級，發(fā)病率0.1%～5.0%，高抗(HR)；2級，發(fā)病率5.1%～15.0%，中抗(MR)；3級，發(fā)病率15.1%～30.0%，中感(MS)；4級，發(fā)病率30.1%～50.0%，感(S)；5級，發(fā)病率>50.0%，高感(HS)。依照上述方法，2017年4月進行重復(fù)試驗，但由于當(dāng)年自然災(zāi)害的原因，導(dǎo)致試驗失敗，因此，2018年4月再次進行重復(fù)鑒定，獲得2年重組自交系對南方水稻黑條矮縮病的抗性表型數(shù)據(jù)。

1.2.2重組自交系基因型數(shù)據(jù)分析2015年9月至2016年12月，提取210份重組自交系材料的DNA，獲得其基因型。DNA提取、PCR反應(yīng)、電泳和銀染檢測方法與前期研究相同[22]。選取在雙親間具有多態(tài)的202對均勻分布于水稻12條染色體上的SSR引物，對桂1025/桂恢1561的重組自交系210個株系材料進行全基因組標(biāo)記分析，用JoinMap 4.0作遺傳連鎖圖。

1.2.3南方水稻黑條矮縮病抗性QTL分析結(jié)合重組自交系的表型數(shù)據(jù)和基因型數(shù)據(jù)，參照YANG等[22]的方法利用軟件QTLNetwork-2.2對RILs的南方水稻黑條矮縮病抗性進行QTL定位，分析各個抗性QTL的遺傳效應(yīng)，預(yù)測最優(yōu)的基因型值。

1.2.4對鑒定出的抗性較好的株系材料進行育種評價和利用選擇部分南方水稻黑條矮縮病抗性較好的株系材料作父本，分別與天豐A、豐田A和華浙2A等不育系配制雜交稻組合，對雜交組合進行試種和抗病鑒定，考查其配合力和抗病表現(xiàn)，評價其育種價值。同時利用抗病親本桂恢1561和部分重組自交系抗性株系為供體親本，以廣恢998、華占和桂恢553等優(yōu)良恢復(fù)系為受體，進行回交轉(zhuǎn)育和分子標(biāo)記輔助選擇，分離世代種植于廣西興安縣湘漓鎮(zhèn)麥源村的病圃進行自然誘發(fā)鑒定，選育新的抗南方黑條矮縮病育種材料。

2結(jié)果與分析

2.1南方黑條矮縮病鑒定結(jié)果的可靠性

由于南方水稻黑條矮縮病是以白背飛虱為傳播媒介的水稻病毒病，南方水稻黑條矮縮病鑒定區(qū)域白背飛虱量越大，其抗性鑒定越有效，鑒定效果越可靠。調(diào)查結(jié)果表明，2016年和2018年的水稻分蘗期感病對照TN1白背飛虱平均蟲量分別為35.2頭/株和43.6頭/株，白背飛虱蟲量充足，說明研究區(qū)域具備南方黑條矮縮病鑒定的外部條件。水稻黃熟期感病對照TN1各重復(fù)的病株率均為100%，抗病對照中浙優(yōu)8號平均病株率小于5%，表現(xiàn)抗病，表明水稻南方黑條矮縮病田間發(fā)病充分，抗性鑒定結(jié)果可靠。

2.2重組自交系的抗性表現(xiàn)

對重組自交系各株系、抗性親本桂恢1561、感病親本桂1025的南方水稻黑條矮縮病調(diào)查結(jié)果表明，桂恢1561表現(xiàn)高抗，桂1025表現(xiàn)高感，210個重組自交系株系表現(xiàn)為偏正態(tài)連續(xù)性分布(圖1)，表明桂恢1561的南方水稻黑條矮縮病抗性可能受主基因和微效基因共同控制。根據(jù)南方水稻黑條矮縮病抗性分級標(biāo)準(zhǔn)，2016年和2018年從210份重組自交系中鑒定出抗及中抗的株系材料共計31份。

圖1 重組自交系南方水稻黑條矮縮病田間抗性頻次分布

Fig.1 Frequency distributions of the SRBSDV-resistance of RILs

2.3構(gòu)建高密度遺傳圖譜

從圖2看出，桂1025/桂恢1561RILs構(gòu)建的水稻遺傳連鎖圖中包括185個SSR標(biāo)記，13個連鎖群，覆蓋了水稻全基因組1 202.5 cM的區(qū)域，標(biāo)記平均間距6.5 cM。

圖2 桂1025/桂恢1561 RILs構(gòu)建的水稻遺傳連鎖圖

2.4QTL的分析結(jié)果

從表1看出，2016年共檢測到4個抗病QTL，分布于第3、4、7和12號染色體上，表型貢獻(xiàn)率為6.5%～36.3%；其中效應(yīng)值最大的QTL是qSRBSDV4，其位于第4染色體RM3471～RM518區(qū)間。來自桂恢1561的等位基因可降低病株率19.2%，表型貢獻(xiàn)率為36.3%，可能是主效基因。

2018年共檢測到3個抗病QTL，分布于第3、4和12號染色體上，表型貢獻(xiàn)率為8.7%～37.5%。其中效應(yīng)值最大的QTL是qSRBSDV4，其位于第4染色體RM3471～RM518區(qū)間，來自桂恢1561的等位基因可降低病株率20.1%，表型貢獻(xiàn)率為37.5%，與2016年的結(jié)果較一致。因此，初步確定qSRBSDV4為抗南方水稻黑條矮縮病的主效QTL位點。

表1 2016年和2018年RILs抗南方水稻黑條矮縮病的QTL檢測結(jié)果

注：表中A為被檢測QTL的加性效應(yīng)值，其負(fù)值表示抗性等位基因來自小粒野生稻。

Note: A is the additive effect value of QTL, and its negative value indicates that the resistance allele comes fromO.sativa.

2.5抗性株系材料的育種價值評價及利用

2017年早季從桂1025/桂恢1561的RILS中選擇14份抗南方水稻黑條矮縮病的株系材料作父本，分別與天豐A、豐田A和華浙2A等不育系配制42個雜交稻組合。對42個雜交組合于2017年晚季在南寧試種，考察產(chǎn)量性狀，并于2018年4月對42個雜交組合進行南方水稻黑條矮縮病抗性鑒定。綜合抗性鑒定結(jié)果及考種結(jié)果，篩選得到7個配合力及抗性表現(xiàn)較好的株系材料(表4)，分別為GK1、GK3、GK5、GK6、GK7、GK11和GK13。

2015-2018年，以抗病親本桂恢1561和部分重組自交系抗性株系為供體親本，以廣恢998、華占和桂恢553等優(yōu)良恢復(fù)系為受體，進行回交轉(zhuǎn)育和分子標(biāo)記輔助選擇，分離世代種植于廣西興安縣湘漓鎮(zhèn)麥源村的病圃進行自然誘發(fā)鑒定，獲得BC2F3、F4和F5等各世代株系材料187份。2018年對187份株系材料進行抗性鑒定，篩選出農(nóng)藝性狀基本穩(wěn)定且對南方水稻黑條矮縮病抗性較好的株系材料32份。

表2 7個抗性材料所配部分雜交組合產(chǎn)量相關(guān)性狀表現(xiàn)

3結(jié)論與討論

研究從210份桂1025/桂恢1561的重組自交系株系中鑒定得到31份對南方水稻黑條矮縮病中抗以上材料，其中7份株系配合力較高；利用重組自交系定位到4個抗性QTL，qSRBSDV3位于第3染色體RM5548～RM85區(qū)間，qSRBSDV4位于第4染色體RM3471～RM518區(qū)間，qSRBSDV7位于第7染色體RM5508～RM1135區(qū)間，qSRBSDV12位于第12染色體RM7102～RM1261區(qū)間，其中qSRBSDV4為主效抗性位點。利用鑒定得到的抗性材料與部分恢復(fù)系材料進行雜交選育，獲得了一批抗性育種基礎(chǔ)材料。

野生稻長期在自然環(huán)境下生長，具有豐富的遺傳多樣性和對病蟲害的抗性，是寶貴的水稻病蟲害抗源。研究中重組自交系的親本之一桂恢1561來源于四倍體的小粒野生稻，其所蘊含的抗逆基因已在多項研究中得到證實[23-24]。近年來，南方水稻黑條矮縮病給水稻生產(chǎn)造成了巨大經(jīng)濟損失，從小粒野生稻資源中發(fā)掘并利用新抗源培育抗性品種是防治該病的有效途徑之一。

病圃所在的廣西壯族自治區(qū)興安縣湘漓鎮(zhèn)麥源村，地處水稻飛虱自華南向長江流域遷移的“湘桂走廊”，歷年均有白背飛虱發(fā)生[25]，于文娟等[15]研究表明，該地區(qū)也可能是SRBSDV在我國重要的毒源積累和繁殖地。在興安病圃進行的田間自然傳毒鑒定法相對于人工接種鑒定法，避免了室內(nèi)人工接種抗病性鑒定中用到的白背飛虱不易捕捉、不易大批量繁殖等缺點[12]，是一種簡便易行且經(jīng)濟的鑒定方法。該病圃蟲量充足，發(fā)病充分，抗性鑒定結(jié)果可靠。

目前，部分學(xué)者僅開展了抗源鑒定與評價工作，雖獲得一些抗南方黑條矮縮病的材料[12-15]，但關(guān)于SRBSDV抗性相關(guān)的基因或QTL挖掘方面研究不多。農(nóng)保選等[17]從廣西地方稻種資源核心種質(zhì)中檢測到8個SRBSDV苗期抗性抗病基因，分別位于第1、第5及第11染色體上；農(nóng)保選等[18]從普通野生稻導(dǎo)入系中定位到1個水稻SRBSDV苗期抗性相關(guān)的主效QTL，將其命名為qSRBSDV9，其位于第9染色體上102.3 kb處。研究發(fā)掘出的抗南方水稻黑條矮縮病的主效QTL位點qSRBSDV4位于第4條染色體上，與目前已報道的SRBSDV抗性QTL[17-18]不在同一條染色體上，因此認(rèn)為qSRBSDV4是抗南方水稻黑條矮縮病的新位點，下一步將利用SLAF-seq技術(shù)和HighMap軟件對桂1025/桂恢1561的RIL開發(fā)高密度分子標(biāo)簽，利用該高密度遺傳連鎖圖對主效QTL抗性位點qSRBSDV4進行精細(xì)定位，開發(fā)與目標(biāo)基因緊密連鎖的標(biāo)記，爭取實現(xiàn)基因的直接選擇和有效聚合，大幅縮短育種年限，提高育種效率。