王 妍 謝曉鶯 陳榮新 任正剛 張 嵐

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝腫瘤內(nèi)科 上海 200032)

肝癌在全球常見腫瘤中排名第六位,而在腫瘤相關(guān)死因排名中位居第四,每年有841 000例新發(fā)病例和782 000例死亡病例,其中75%～85%為肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)[1]。盡管越來越多的分子靶向藥物和免疫治療藥物被證實可使部分晚期HCC患者獲益,但其價格昂貴、客觀反應(yīng)率低[2];在傳統(tǒng)化療方面,含有奧沙利鉑的FOLFOX4方案治療晚期HCC(亞洲)的緩解率為8.15%,疾病控制率為53.2%[3],然而反復(fù)化療后出現(xiàn)的耐藥問題也逐漸成為HCC系統(tǒng)化療失敗的主要原因,晚期HCC的治療仍是一大難題。

炎癥與腫瘤密不可分,在眾多炎癥因子中,Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17A在多種動物模型和人類腫瘤研究中均被證實影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后[4]。IL-17RA作為IL-17A的主要作用受體,在非小細(xì)胞肺癌[5]、膽管癌[6]等多種腫瘤中高表達,與患者不良預(yù)后相關(guān)。慢性炎癥對HCC的發(fā)生、發(fā)展亦起到至關(guān)重要的作用,然而IL-17A/IL-17RA軸在HCC中發(fā)揮了何種作用仍不明確。本研究旨在明確IL-17RA在HCC患者中的表達及預(yù)后意義,及其對HCC細(xì)胞株生物學(xué)特征的影響。

資料和方法

患者樣本收集與隨訪篩選2008年1—12月因原發(fā)性肝癌至復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院行肝腫瘤切除術(shù)且病理診斷為HCC的患者163例,術(shù)前未接受其他抗腫瘤治療且未發(fā)現(xiàn)腫瘤有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。收集患者術(shù)前基本信息及臨床信息,術(shù)后每隔3個月隨訪患者生存情況,統(tǒng)計患者的總生存期(overall survival,OS),末次隨訪時間為2016年4月。

組織芯片制作及免疫組化染色由中山醫(yī)院病理科提供患者原位癌組織的石蠟標(biāo)本,每個病例的石蠟塊上取2個位點制成組織芯片陣列蠟塊,每張組織芯片切片的厚度為4 μm。針對IL-17RA使用二步法進行免疫組化染色(IL-17A受體抗體,美國Abcam公司,1∶150),在高倍鏡下觀察腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)或胞膜染為棕黃色為陽性,根據(jù)著色面積(0:0分;1%～15%:1分;16%～50%:2分;>50%:3分)和著色強度(陰性:0分;弱陽性:1分;陽性:2分;強陽性:3分)計算免疫組化積分,取2個位點的平均值為該患者的免疫組化積分,積分>4分為高表達組,≤4分為低表達組(圖1)。

A:Negative;B:Weak;C:Positive;D:Strong.Scale bar:50μm.
圖1 肝癌組織芯片IL-17RA免疫組化染色
Fig 1 Immunohistochemical staining of IL-17RAin HCC specimens tissue microarray

細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染處理及轉(zhuǎn)染效率驗證高侵襲性HCC細(xì)胞系MHCC-97H和Huh7由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所提供。siRNA由吉馬基因公司設(shè)計,序列為:5’-GCGUCAGGUUUGAGUU-UCUTT-3’。轉(zhuǎn)染前一天在6孔板中鋪板,24 h后用Lipo2000進行轉(zhuǎn)染,培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染4～6 h后更換新鮮培養(yǎng)基。用qRT-PCR檢測干擾組和對照組IL-17RA mRNA水平(上游引物:5’-CTGGTTCA-TCACGGGCATCTCC-3’;下游引物:5’-GGTGG-TCGGCTGAGTAGATGATC-3’),用Western blot檢測干擾前后IL-17RA蛋白質(zhì)水平(一抗:IL-17A受體抗體,美國Abcam公司,1∶1 000)。

劃痕實驗當(dāng)細(xì)胞密度達到 80%時,用200 μL無菌槍頭在培養(yǎng)板中央輕輕劃痕,48 h后顯微鏡下觀察細(xì)胞向劃痕區(qū)的生長情況并拍照,重復(fù)3次,每次設(shè)3個復(fù)孔,取平均值為實驗結(jié)果。

侵襲實驗使用Transwell侵襲小室,將基質(zhì)膠于4 ℃化為液態(tài),預(yù)冷實驗所需槍頭和培養(yǎng)基,將工作濃度基質(zhì)膠100 μL加于小室上室后放入培養(yǎng)箱凝固2 h。細(xì)胞消化后計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度,上室接種5×105個細(xì)胞懸液100μL(無血清DMEM培養(yǎng)基),下室加入含20%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基600 μL,培養(yǎng)24～48 h后,取出小室,用棉簽擦去上室面細(xì)胞,漂洗、固定、結(jié)晶紫染色,顯微鏡下拍照觀察并計數(shù)腫瘤細(xì)胞侵襲情況。實驗重復(fù) 3 次,取其平均數(shù)作為實驗結(jié)果。

奧沙利鉑抑制率的檢測細(xì)胞鋪于96孔板,每孔5×103個細(xì)胞,按10、20、40、80 μmol/L濃度遞增加入奧沙利鉑,每組設(shè)3個復(fù)孔,培養(yǎng)48 h后加入CCK8試劑并測定OD值,重復(fù)3次,比較不同濃度奧沙利鉑對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。

統(tǒng)計學(xué)分析患者數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件,單因素生存分析采用Kaplan-Meier法,多因素生存分析采用Cox回歸模型。實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad 6.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用t檢驗或χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

IL-17RA高表達影響HCC患者術(shù)后生存期163例患者年齡最小19歲,最大79歲,平均(52.32±12.29)歲,其中男性137例,女性26例。術(shù)后1年、3年、5年生存率分別為80%、60%和51%,平均生存期為(64.87±3.39)個月。IL-17RA高表達組和IL-17RA低表達組患者在人口統(tǒng)計學(xué)信息、血清膽紅素、白蛋白、凝血酶原時間、術(shù)前甲胎蛋白、乙肝表面抗原、腫瘤直徑、個數(shù)、有無肉眼或鏡下癌栓等因素差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

進一步分析上述因素及IL-17RA的表達對患者術(shù)后OS的影響。單因素分析結(jié)果顯示,術(shù)前AFP≤20 ng/mL組和AFP>20 ng/mL組的平均生存時間分別為68.83個月和59.60個月(P=0.043),腫瘤直徑≤10 cm和>10 cm組的平均生存時間分別為71.45個月和35.02個月(P<0.001),未合并癌栓和合并癌栓組的平均生存時間分別為76.63個月和44.64個月(P<0.001),IL-17RA低表達組和高表達組的平均生存時間分別為68.37個月和53.36個月(P=0.009),以上各組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。多因素分析顯示,腫瘤直徑>10 cm (HR=1.820,P=0.028)、合并癌栓(HR=2.087,P=0.003)以及IL-17RA高表達(HR=1.579,P=0.042)是影響肝癌患者術(shù)后總生存期的獨立危險因素(圖2,表2)。

表1 IL-17RA低表達和高表達患者臨床因素比較Tab 1 Clinical factors comparison between IL-17RA low group and IL-17RA high group (n)

圖2 肝癌患者術(shù)后生存曲線Fig 2 Survival curve of HCC underwent resection

FactorsnUnivariateMultivariateOS(mo)PHR(95%CI)PAge(y) >652866.38 ≤6513554.770.321Gender Male13763.31 Female2655.730.121Totalbilirubin(μmol/L) ≤17.113466.10 >17.12956.130.455Albumin(g/L) ≥3515166.04 <351246.130.285Prothrombintime(s) ≤1414665.86 >141752.890.504AFP(ng/mL) ≤206568.83 >209859.600.0431.061(0.647-1.741)0.814HbsAg Negative2362.39 Positive14064.520.657Tumordiameter(cm) ≤1013271.45 >103135.020.0001.820(1.065-3.109)0.028Tumornumbers Single13767.51 Multiple2648.560.063Thrombus No9876.63 Yes6544.640.0002.087(1.275-3.414)0.003IL-17RA Low9968.37 High6453.360.0091.579(1.016-2.452)0.042

下調(diào)IL-17RA表達后HCC細(xì)胞體外遷移和侵襲能力下降用siRNA瞬時轉(zhuǎn)染人HCC細(xì)胞株MHCC-97H和Huh7,下調(diào)IL-17RA表達后,分別采用qRT-PCR和Western blot方法檢測干擾效率。結(jié)果顯示,與對照組相比,干擾組細(xì)胞在IL-17RA的mRNA和蛋白質(zhì)水平均明顯下降(P<0.05,圖3)。瞬時轉(zhuǎn)染siRNA后,用劃痕實驗觀察下調(diào)IL-17RA對MHCC-97H和Huh7細(xì)胞遷移能力的影響,結(jié)果顯示干擾組細(xì)胞遷移能力較對照組明顯下降;用Tranwell侵襲實驗觀察下調(diào)IL-17RA對MHCC-97H和Huh7細(xì)胞侵襲能力的影響,結(jié)果顯示干擾組細(xì)胞侵襲能力較對照組明顯下降(P<0.05,圖4)?？梢娤抡{(diào)IL-17RA表達可以抑制MHCC-97H和Huh7細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

下調(diào)IL-17RA表達后奧沙利鉑對HCC細(xì)胞增殖的抑制率提高用siRNA瞬時轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞株MHCC-97H和Huh7下調(diào)IL-17RA表達后,分別用不同濃度的奧沙利鉑作用于干擾組和對照組細(xì)胞,用CCK8方法檢測奧沙利鉑對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率。結(jié)果顯示當(dāng)奧沙利鉑作用濃度為40 μmol/L及80 μmol/L時,對干擾組細(xì)胞的抑制率明顯高于對照組(P<0.05,圖5)?？梢娤抡{(diào)IL-17RA的表達可以提高奧沙利鉑對肝癌細(xì)胞增殖的抑制率。

A:IL-17RA protein level was decreased in MHCC-97H or Huh7 with siRNA compared with control cells detected by Western blot;B:IL-17RA mRNA level was decreased in MHCC-97H or Huh7 with siRNA compared with control cells detected by qRT-PCR.
圖3 siRNA瞬時轉(zhuǎn)染MHCC-97H和Huh7細(xì)胞株后IL-17RA表達
Fig 3 IL-17RA expression in MHCC-97H and Huh7 afterdown-regulated IL-17RA by siRNA

A:The migration rate of MHCC-97H and Huh7 was decreased with siRNA compared with control cells;B:The number of invasion cells of MHCC-97H and Huh7 was decreased with siRNA compared with control cells.(1)vs.control group,P<0.05.
圖4 siRNA瞬時轉(zhuǎn)染下調(diào)HCC細(xì)胞IL-17RA表達后MHCC-97H和Huh7細(xì)胞的遷移和侵襲能力下降
Fig 4 The abilities of migration and invasive of MHCC-97H and Huh7 were decreased after down-regulated the expression of IL-17RA

圖5 siRNA瞬時轉(zhuǎn)染下調(diào)HCC細(xì)胞IL-17RA表達后奧沙利鉑對肝癌細(xì)胞的抑制率較對照組顯著提高Fig 5 The inhibition rate of oxaliplatin on tumor cells was increased with siRNA compared with control cells

討 論

IL-17細(xì)胞因子家族包括IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(IL-25)和IL-17F,其中Th17細(xì)胞分泌的IL-17A和IL-17F形成二聚體,通過激活效應(yīng)細(xì)胞上的含有IL-17RA和IL-17RC受體復(fù)合物發(fā)揮效應(yīng)[7]。IL-17A/IL-17RA軸在結(jié)腸癌、宮頸癌、肺癌等腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移以及化療耐藥等方面都發(fā)揮了重要作用[8]。IL-17A既能直接活化腫瘤細(xì)胞STAT3信號通路促進腫瘤的生長轉(zhuǎn)移[9],也通過微環(huán)境中的其他細(xì)胞(如CD8+T細(xì)胞、MDSC等)起作用。例如IL-17可以促進腫瘤血管形成,可以通過NF-κB和ERK信號途徑誘導(dǎo)G-CSF的表達,促使未成熟的髓系細(xì)胞在腫瘤局部積聚,進而降低了腫瘤對VEGF抑制劑的敏感性[10]。IL-17可以調(diào)節(jié)G-CSF進而上調(diào)TANs表面NOS2、BV8、S100a8、S100a9的表達而使其促進乳腺癌轉(zhuǎn)移[11]。IL-17RA是IL-17A作用的主要受體,表達于腫瘤微環(huán)境中的上皮細(xì)胞、造血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞表面[12],在胃癌[13]、在非小細(xì)胞肺癌[5]、膽管癌[6]等實體腫瘤中高表達并且與不良預(yù)后相關(guān)。本研究通過肝癌患者組織芯片免疫組化染色及預(yù)后分析證實,IL-17RA高表達的患者較低表達患者術(shù)后生存期短,IL-17RA高表達是影響HCC患者術(shù)后生存期的預(yù)后因素,由此為研究IL-17A/IL-17RA軸在HCC中的作用機制提供了基礎(chǔ)和依據(jù)。本研究進一步通過siRNA瞬時轉(zhuǎn)染下調(diào)HCC細(xì)胞株IL-17RA表達后,通過遷移、侵襲實驗證實下調(diào)IL-17RA可以降低HCC細(xì)胞株的遷移、侵襲能力,證明IL-17RA對于HCC細(xì)胞株的惡性生物學(xué)行為有著重要的影響作用,再一次回應(yīng)了IL-17RA高表達影響HCC患者生存的臨床研究結(jié)果,當(dāng)然其具體的作用途徑及相關(guān)信號通路有待進一步研究。

既往多項研究證實,IL-17A/IL-17RA軸在腫瘤的化療耐藥中也發(fā)揮了重要作用。IL-17A通過上調(diào)磷酸化ERK1/2促進乳腺癌的增殖及對多西他賽治療的耐藥[14]。在結(jié)腸癌小鼠模型中證實,化療可以促進IL-17A的分泌,而使用IL-17A抗體聯(lián)合5-FU治療可以明顯減少小鼠的腫瘤負(fù)荷,其機制可能是下調(diào)了腫瘤組織IL-6的表達[15]。奧沙利鉑是肝癌常用全身化療藥物及局部灌注化療藥物之一,目前國內(nèi)外仍有許多關(guān)于奧沙利鉑化療療效的臨床研究正在進行[16-17],如何提高其療效仍是我們面臨的主要問題。本研究證實下調(diào)HCC細(xì)胞株IL-17RA的表達可以提高奧沙利鉑對HCC細(xì)胞株的抑制率,再一次提示了靶向IL-17A/IL-17RA軸的治療,尤其是聯(lián)合化療,將可能使肝癌患者獲益。