幸春林 朱雪梅 張曉磊 陳 揚 陸國平

(復旦大學附屬兒科醫(yī)院重癥醫(yī)學科 上海 201102)

隨著心肺復蘇(cardiopulmonary resuscitation,CPR)指南進步,心臟驟停(cardiac arrest,CA)患者自主循環(huán)恢復(return of spontaneous circulation,ROSC)率較高,但住院患者最終存活出院率仍不理想[1-2]。CA、CPR時機體經(jīng)歷急性的強烈的非感染應(yīng)激反應(yīng)過程,全身各系統(tǒng)都發(fā)生劇烈改變,其中包括免疫系統(tǒng)。研究顯示CA患者ROSC后出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng),存在類似于膿毒癥免疫功能紊亂的表現(xiàn):(1)CPR后單核細胞HLA-DR的表達減少,且與降低的CD4+T細胞有相關(guān)性,死亡患者表達降低更明顯,存活患者的表達有恢復趨勢,且低體溫治療不能改變HLA-DR的表達狀態(tài)[3]。(2)CA患者的白細胞分泌細胞因子功能受損,且可能與CPR后第1天體內(nèi)細胞損傷后持續(xù)釋放的危險相關(guān)模式分子有關(guān)[4-5]。(3)CA后24 h時T細胞比例降低,Th1/Th2失衡[6-7]。小鼠CPR模型復蘇3 h內(nèi)腦組織中就有大量T細胞浸潤,并介導CPR后缺血性的神經(jīng)損傷[8]。因此免疫功能紊亂是CA患者ROSC后重要表現(xiàn)之一。

免疫系統(tǒng)包括細胞免疫及體液免疫,其中T細胞是細胞免疫中最重要的細胞,T細胞數(shù)量減少或功能降低是重癥患者出現(xiàn)繼發(fā)感染、預(yù)后不良的重要指標[9-10],通過調(diào)節(jié)T細胞功能可提高膿毒癥患者的生存率[11-12]。但目前關(guān)于CPR后CD4+T細胞分泌的炎癥因子變化及表面共刺激及共抑制分子的改變研究較少,因此,本研究通過建立SD大鼠CA模型,研究外周血中促炎因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素6(interleukin 6,IL-6)、干擾素γ(Interferon γ,IFN-γ)和抗炎因子IL-4、IL-10的變化,CD4+T細胞數(shù)量及其表面分子PD-1、CD28、CTLA-4的表達情況,為進一步研究CA后免疫改變機制和可能的治療干預(yù)方式提供參考。

材料和方法

實驗動物300～410 g清潔級SD大鼠,雌雄不限(上海杰思捷實驗動物有限公司,許可證號:SCXK(滬)2013-0006),本動物實驗研究得到復旦大學附屬兒科醫(yī)院倫理委員會的批準。

試劑及設(shè)備流式試劑:Anti-Rat CD3 Per-eFluor 710、Anti-Rat CD8a PE-Cy7、Anti-Human CD279(PD-1) APC、Anti-Rat CD152(CTLA-4) PE、Anti-Rat CD28 FITC(美國eBioscience公司)、V450 Mouse Anti-Rat CD4 (美國BD公司),ELISA 試劑盒:TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-6(杭州聯(lián)科生物公司);小動物呼吸機(型號:ALC-V8D,上海奧爾科特生物科技有限公司),心電監(jiān)護儀(型號:MP40,荷蘭PHILIPS公司);流式細胞儀(型號FACSCantoⅡ,美國BD公司);多功能酶標儀(美國Bio Tek公司)。

動物分組將SD大鼠隨機分為心臟驟停(CA)組和假手術(shù)(sham-operated,SO)組,每組24只,每組再按3、24、72 h 3個時間點分為3個亞組,每個亞組8只。CA組建立CA模型,SO組僅行氣管插管和動靜脈置管。分別于建?；虿僮骱?、24、72 h行心臟采血。

動物模型建立參照文獻[13]建立CA模型。所有大鼠造模前禁食12 h,不禁水。實驗前用10%水合氯醛4 mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉,行氣管切開插管,股動靜脈置管及動脈血壓監(jiān)測、心電監(jiān)護,穩(wěn)定10 min。在大鼠呼氣末時堵住氣管導管,窒息6 min后開始CPR,松開氣管導管,機械通氣,參數(shù)設(shè)置為呼吸頻率80 次/min,吸呼比為1∶1.5,潮氣量6～10 mL/kg,氧氣濃度100%。同時開始胸部按壓,頻率約180 次/min,按壓深度為胸骨前后徑的1/3,按壓10 s后股靜脈注射腎上腺素(0.02 mg/kg),持續(xù)按壓2 min后評估1次,若出現(xiàn)ROSC,則停止按壓,未恢復則繼續(xù)按壓。每3～5 min靜脈注射腎上腺素(0.02 mg/kg),若10 min之后還未達到ROSC標準,則放棄搶救,判為復蘇失敗,復蘇失敗大鼠不納入實驗。ROSC后予補液,3 h組于3 h后直接取血,24 h和72 h組于建模3 h后撤離呼吸機,拔除氣管導管及動靜脈置管,縫合傷口,放置于籠內(nèi),予氧氣吸入,正常飲食及飲水,于24 h和72 h時取血,如未到實驗時間動物死亡,死亡動物不納入研究。

CA模型成功標準心率呼吸下降,平均動脈壓降至20 mmHg (1 mgHg=0.133 kPa,下同),認為建模成功。

ROSC標準大鼠出現(xiàn)自主心率,MAP≥60 mmHg且持續(xù)10 min以上,心律恢復為竇性心律,認為達到ROSC。

外周血中T細胞表面分子表達取3個流式管(抗體管A,同型對照管B,空白對照管C),每管加100 μL 肝素抗凝血,A管按說明書劑量加入CD3、CD4、CD8、PD-1、CTLA-4、CD28共6種抗體同時標記,B管加PE-Cy7、APC、FITC、PE標記的同型對照、Per-eFluor 710標記的CD3抗體、V450標記的CD4抗體各5 μL,混勻,C管不加任何抗體,A、B管均避光孵育25 min。每管加2 mL溶血素,混勻,37 ℃放置10 min以溶解紅細胞。500×g離心10 min,棄上清液。每管加2 mL FBS,混勻,500×g離心5 min,棄上清液。每管加250 μL PBS,重懸細胞。2 h內(nèi)上機檢測。采用FlowJo軟件分析結(jié)果,根據(jù)前向散射光(forward scatter,FSC)和側(cè)向散射光(side scatter,SSC)信號選定淋巴細胞群,分析其中CD3+(即T細胞)的比例,CD4+T細胞設(shè)門為CD3+CD4+CD8-,CD8+T細胞設(shè)門為CD3+CD8+CD4-,并分別分析CD4+T細胞表面CD28、CTLA-4、PD-1的表達(圖1)。

ELISA檢測運用ELISA法檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10、IFN-γ、IL-4的濃度。按照聯(lián)科生物公司試劑盒的Protocol操作,多功能酶標儀在450 nm處檢測吸光度值(D)。

結(jié) 果

各組基線特征與生理學參數(shù)各組大鼠性別、體重差異無統(tǒng)計學意義,各組大鼠的基線特征:呼吸、心率、平均動脈壓差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05,表1)。誘導CA時間為(226±28) s,非干涉時間為(136±26) s,CPR時間為(168±115) s。實驗各組基線特征可比,組間個體差異較小。

促炎因子水平CA組血清中TNF-α的濃度在3 h和24 h時均高于SO組,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。IL-6在CA后3 h時最高,在3 h (P=0.001)和24 h(P=0.005)均顯著高于SO組,差異有統(tǒng)計學意義,到72 h后IL-6降低至與SO組無統(tǒng)計學差異。IFN-γ的濃度3 h時較SO組高,在24 h和72 h時降低,顯著低于SO組(P<0.001,P=0.018,圖2)。

抗炎因子水平CA組血清中IL-10的變化與IL-6一樣,在CA后3 h時最高,在3 h(P=0.015)和24 h(P<0.001)均顯著高于SO組,差異有統(tǒng)計學意義,到72 h后IL-6降低至與SO組無統(tǒng)計學差異。而IL-4在3個時間點(3、24、72 h)均顯著高于SO組(P=0.002,P=0.028,P=0.021,圖3)。

T細胞數(shù)量及表面分子表達CA組的T細胞在ROSC后3 h已經(jīng)開始降低,到24 h和72 h時顯著低于SO組,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.009,P=0.034,表2)。CA后3 h、24 h和72 h時3組T細胞CD4和CD8亞群比例均無顯著改變。在本實驗中,與SO組相比,CA組CD4+T細胞表面共刺激因子CD28及共抑制因子CTLA-4、PD-1在CA后24 h時均處于較高表達狀態(tài),差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.037,P=0.003,P<0.001,圖4)。

(1)P<0.05,(2)P<0.001.
圖2 CA組和SO組大鼠在3個時間點TNF-α、IL-6、IFN-γ的含量變化
Fig 2 Levels of TNF-α,IL-6 and IFN-γ in rats between CA group and SO group at three time points

表1 SO組和CA組大鼠基線特征與生理學參數(shù)Tab 1 Baseline values and physiological parameters in rats of SO group and CA group

MAP:Mean arterial pressure.

(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001.
圖3 CA組和SO組大鼠在3個時間點IL-10和IL-4的含量變化
Fig 3 Levels of the IL-10 and IL-4 in rats of CA group and SO group at three time points

表2 SO組和CA組大鼠T細胞及T細胞亞群比例比較Tab 2 Comparison of T cells and subsets in rats of SO group and CA group

(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001.
圖4 CA組和SO組在3個時間點CD28、CTLA-4、PD-1的表達
Fig 4 The percentage of PD-1,CTLA-4 and CD28 expressed on CD4+T cells of CA group and SO group at three time points

討 論

在動物研究中發(fā)現(xiàn),窒息后立即發(fā)生高碳酸血癥和低氧血癥,伴短暫的心動過速、血壓升高和全身血管阻力增加,5 min后進展為心動過緩和低血壓、低心輸出量、肺高壓、組織缺氧、乳酸酸中毒、持續(xù)加重最后導致CA,ROSC后雖然血液動力學、呼吸和全身代謝參數(shù)恢復,但是組織尤其是內(nèi)臟器官缺氧持續(xù)存在[14]。CPR過程存在急性炎癥反應(yīng),不僅釋放致炎細胞因子(如IL-1、TNFα、IL-6等)引起類似于膿毒癥的全身炎癥反應(yīng)綜合征,同時釋放大量的炎癥抑制因子(如IL-4、IL-10、IL-1Ra等)[5,15],這些細胞因子相互作用,同時參與機體的免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)。本研究中的細胞因子均可由CD4+T細胞分泌,CD4+T細胞通過分泌細胞因子參與炎癥反應(yīng)[16]。CA后3 h抗炎因子和促炎因子均升高,在72 h時促炎因子IL-6、TNFα與對照組無差別,IFN-γ甚至低于對照組,而抗炎因子IL-4仍高于對照組,提示在CA最初抗炎反應(yīng)和促炎反應(yīng)同時存在,3天后促炎反應(yīng)減少,抗炎反應(yīng)仍然存在。

在創(chuàng)傷患者中最初4天淋巴細胞持續(xù)低水平與死亡率和住院天數(shù)的增加有關(guān),淋巴細胞數(shù)量不能恢復者預(yù)后差,提示淋巴細胞在創(chuàng)傷后的改變對預(yù)后很重要[17]。T淋巴細胞是淋巴細胞中最主要的細胞,Gouel等[18]對創(chuàng)傷患者的研究也證實,CD4+T細胞數(shù)量降低的患者更易繼發(fā)感染。陳永斌等[19]發(fā)現(xiàn)細胞免疫功能水平與危重癥患者病情的嚴重程度有關(guān),可以作為評估危重癥患者病情的檢測指標。本研究發(fā)現(xiàn)CA組CD3+T細胞比例在24 h和72 h時顯著低于SO組,有可能與CA后導致T細胞凋亡有關(guān),與Gu等[6]研究結(jié)果一致。

T細胞的活化需要雙重信號的刺激,其中表達于T細胞表面的CD28作為共刺激因子最為重要,外周血幾乎所有CD4+T細胞和50%CD8+T細胞表達CD28,T細胞活化后CD28表達水平升高,B細胞和抗原提呈細胞表面的B7家族分子是其配體[20]。本研究證實CD28持續(xù)表達于CD4+T細胞表面,在CA 24 h后CD28表達顯著升高,表明在CA 24 h后CD4+T細胞活化明顯,活化功能正常。

CTLA-4主要表達于活化的T細胞表面,與CD28具有高度同源性,但與B7親和力更強,可競爭性抑制CD28與B7結(jié)合,有效限制T細胞活化與增殖反應(yīng),應(yīng)用CTLA-4/Ig融合蛋白競爭性抑制CD28與B7結(jié)合,可發(fā)揮強的免疫作用,并已用于臨床治療[21]。在膿毒癥的動物模型中發(fā)現(xiàn)CTLA-4表達升高,阻斷CTLA-4通路能提高生存率[22]。本研究中CA組CTLA-4表達在24 h后較SO組顯著升高,與在膿毒癥研究中的改變一致,表明CA后負性調(diào)控的表達先于活化受體的表達,且持續(xù)較高,T細胞處于受抑制調(diào)控狀態(tài)。

PD-1是T細胞表面標志物之一,主要表達于活化的T細胞表面,與配體PD-L1和PD-L2結(jié)合后可抑制T細胞增殖和產(chǎn)生IL-10、IFN-γ等,在免疫起始和效應(yīng)階段均可發(fā)揮負調(diào)節(jié)作用,在小鼠膿毒癥模型中,PD-1在T細胞表面的表達率上調(diào),阻斷PD-1的信號轉(zhuǎn)導可提高大鼠對致病微生物的清除率,提高膿毒癥大鼠的生存率[23]。本研究中PD-1的表達在CA組 3 h時開始升高,在24 h時較SO組比較差異有統(tǒng)計學意義,且至第3天時仍處于高表達狀態(tài),說明在CA后T細胞表面的負性調(diào)節(jié)分子表達升高,且持續(xù)處于高表達狀態(tài),表明T細胞功能處于持續(xù)受抑制調(diào)控的狀態(tài),這樣的高表達狀態(tài)是否與膿毒癥一樣會造成T細胞的嚴重耗竭[24],以及對預(yù)后的影響有待于進一步研究。

總之,本實驗通過建立SD大鼠窒息致CA模型,研究了CD4+T細胞分泌的炎癥因子變化及表面共刺激及共抑制分子表達。證實了CA后最初3 h和24 h促炎反應(yīng)和抗炎反應(yīng)同時存在,72 h后抗炎反應(yīng)為主。 CD4+T細胞在CA 24 h時共抑制因子表達升高,處于受抑制調(diào)控狀態(tài)。