郭羅培 陳麗梅 陳 芳 江寧紅 隋 龍,2

(1復旦大學附屬婦產科醫(yī)院宮頸疾病診療中心 上海 200011; 2上海市女性生殖內分泌相關疾病重點實驗室 上海 200011)

宮腔粘連(intrauterine Adhesion,IUA)多因宮內操作造成內膜損傷,表現(xiàn)為月經不規(guī)律,不孕與復發(fā)性流產。根據(jù)文獻報道,人工流產后IUA發(fā)生率在8.1%～21.2%。雖然宮腔鏡下粘連分解術可以治療IUA,但是此病的復發(fā)率仍高達62.5%[1-2]。目前針對IUA尤其是重度IUA尚無較好的治療方法,關于此病的發(fā)病機制也是知之甚少。

婦產科醫(yī)師普遍認同IUA是一種纖維化疾病,子宮內膜上皮細胞對激素失去敏感性,纖維組織增生,顯微鏡下病理表現(xiàn)為纖維化,大量內膜被纖維組織所替代[3]。上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮性細胞經過特定程序轉化為具有間質細胞表型的生物過程,包括胚胎發(fā)育相關的Ⅰ型EMT,纖維化相關的Ⅱ型EMT與腫瘤相關的Ⅲ型EMT[4]。EMT在創(chuàng)傷導致的纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,由此推測Ⅱ型EMT極可能在IUA纖維化的發(fā)生過程中發(fā)揮關鍵調節(jié)作用。在小鼠IUA模型中,間質指標Vimentin蛋白水平較正常小鼠升高,上皮指標Cytokeratin蛋白水平下降[5]。但是小鼠子宮內膜組織難以準確提取,并且上皮與間質標志在宮腔內的定位關系無法通過Western blot體現(xiàn)。針對這一問題,本研究采用機械損傷方式建立大鼠IUA模型,采用免疫組化的方式檢測上皮及間質標志,以期為IUA內膜纖維化的發(fā)病機制提供研究線索。

材料和方法

動物材料24只清潔級SD成年雌性大鼠,6～8周齡,體重200～250 g,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司(批號:SCXK滬2017-0005)。飼養(yǎng)條件:室溫(21±2) ℃,恒濕(40%～60%),光照12 h/12 h,正常飲食,自由攝水。

試劑和儀器LEICA顯微鏡(德國Leica公司),石蠟切片機(金華市益迪醫(yī)療設備廠),戊巴比妥鈉,顯微手術器械(上海金中器械廠),醫(yī)用7-0縫線(上海強生公司),蘇木素和伊紅(武漢谷歌生物有限公司),Masson染色試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司),鼠抗E-cadherin(美國Santa-Cruz公司),兔抗N-cadherin (武漢賽維爾生物科技有限公司),兔抗CD31兔抗Vimentin,兔抗TGF-β1及488山羊抗兔IgG熒光二抗(英國Abcam公司),兔/鼠通用型免疫組化二抗試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色液(上海杰浩生物技術公司)。

模型制備SD大鼠術前禁食1晚,10%戊巴比妥鈉按5 mL/kg腹腔注射麻醉后固定大鼠。剃去下腹部毛發(fā),碘伏棉球消毒。在動物實驗中心超凈臺中于恥骨聯(lián)合上端2～3 cm處挑起外層皮膚,剪刀縱向剪開腹壁皮膚2 cm,逐層切開腹層黏膜、肌肉組織,進入腹腔,緩慢挑出大鼠的 Y型子宮(雙子宮、雙宮頸、單陰道,兩側宮角互不相通),于左側子宮造模(IUA-L組),眼科剪于子宮中段正中央縱向剪開子宮壁,盡量全部剪開(大鼠子宮全長3～4 cm),眼科剪沿著子宮內膜慢慢剪,徹底去除子宮內膜全層,手術過程中無菌紗布隨時止血,保證視野清晰,深度控制在子宮組織淺肌層至深肌層,以確保子宮漿膜面的完整性。子宮內膜切除完成后,7-0顯微無菌手術縫線間斷縫合子宮,清除血液,右側子宮作自身對照(IUA-R組)。Sham假手術組左側子宮(Sham-L組)僅切開再縫合,右側子宮(Sham-R組)不做處理。手術完成后,將子宮還納至腹腔,清洗腹腔,4-0手術縫線關腹。7天和28天后分別處死各組大鼠,子宮取樣,4%多聚甲醛固定組織,48 h內石蠟包埋、切片[6]。

HE和Masson染色石蠟切片脫蠟、復水,HE染色。鏡下觀察整個子宮形態(tài)及炎癥反應情況,計算每只大鼠子宮中的所有腺體數(shù)目。Masson染色用于計算子宮內膜纖維化程度。石蠟切片脫蠟復水后,使用Masson復合染色液染色6 min,磷酸鉬染色5 min,中性樹膠封片。每張片子拍攝3～5個視野,用Image Pro-Plus 6.0 (IPP)統(tǒng)計纖維化率。打開其中一張Masson圖片,先建立一個統(tǒng)一掃描模板,然后直接批量打開要統(tǒng)計的圖片,框出每張圖片的間質部分,獲得讀數(shù)即為纖維化率[7]。

免疫組化子宮石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精入水,3%H2O2溶液去除內源性過氧化物酶,檸檬酸高壓鍋修復3 min,山羊血清封閉非特異性結合位點,CD31、E-cadherin、N-cadherin、TGF-β1 于4 ℃孵育過夜,二抗孵育60 min,DAB顯色,蘇木素襯染細胞,中性樹膠封片。每張切片采集3～5個視野,根據(jù)CD31染色結果統(tǒng)計血管數(shù),E-cadherin、N-cadherin、TGF-β1應用Image Pro-Plus 6.0統(tǒng)計平均光密度(mean optical density,MOD)。

免疫熒光切片脫蠟復水,高壓修復,Vimentin 4 ℃孵育過夜,488山羊抗兔熒光二抗孵育60 min,DAPI封片劑封片,Confocal熒光顯微鏡拍照。

結 果

大鼠子宮內膜形態(tài)改變手術后7天及28天IUA組大鼠造模子宮積水,病理組織學可見宮腔堵塞充血,內膜上皮細胞幾乎不可見,宮腔內充斥大量紅細胞和中性粒細胞。7天時大鼠內膜幾乎無腺體及微血管再生,28天時大鼠腺體可見少數(shù)再生(圖1、2)。當觀察到腺上皮細胞,并圍成一個腔隙時,認為其是腺體結構。圖1黑色箭頭指向由腺上皮圍成的腺體結構。黑箭頭所指可見腺上皮細胞,認為其為腺體(圖1B、1F),若未觀察到腺上皮,即使可見腔隙,也不能認為是腺體(圖D),28天IUA-L雖然可見小的腔隙,但是腔隙形態(tài)僵硬,并且未觀察到腺上皮細胞,不能認為其是腺體。紅色箭頭指向炎癥細胞(中性粒細胞為主)和紅細胞,炎癥細胞在HE染色圖片中表現(xiàn)為暗黑色小點,與細胞核相似(但是更小),并可以發(fā)現(xiàn)炎癥細胞彌散在間質內(圖1B)。Sham-L組、IUA-R組和Sham-R組子宮內膜結構均完整,宮腔表面呈波浪狀,上皮細胞與間質細胞形態(tài)分明,腺體數(shù)量密集。應用CD 31免疫組化顯示小血管,可見內皮細胞陽性表達CD 31,用于計數(shù)統(tǒng)計(圖2,×400)。可見 IUA-L組少量散在的微血管(圖2A、2B),并能觀察到密集的微小血管(圖2C～2H),與Sham-L組、IUA-R組和Sham-R組相比,IUA-L組的微血管密度(microvascular density,MVD)明顯下降。7天IUA-L組宮腔腺體數(shù)量(P<0.01)及7天和28天MVD(P<0.001)均較Sham-L組和IUA-R組減少(P<0.05);28天IUA-L組宮腔腺體數(shù)量較IUA-R組減少(P<0.05,表1)。

IUA大鼠內膜纖維化內膜纖維化是評價IUA的重要指標,本研究利用Masson染色計算內膜纖維化程度。Masson染色后膠原纖維呈藍色,子宮內膜細胞、血管和肌肉呈暗紅色。高倍鏡下IUA-L組子宮內膜水腫嚴重,藍染的膠原纖維彌散整個宮腔,IUA-L組7天時可觀察到密集的紅染炎癥細胞(圖3)。IUA-L組子宮纖維化面積比率明顯高于IUA-R組和Sham-L組(P<0.001),Sham-L組與Sham-R組比較差異無統(tǒng)計學意義(表1)。

Black arrow points at epithelial cells and glands.Red arrow points at neutrophils and red blood cells.
圖1 IUA-L組、IUA-R組、Sham-L組及Sham-R 組子宮7天與28天時HE染色結果
Fig 1 HE staining of uterus in IUA-L,IUA-R,Sham-L,Sham-R group on day 7 and day 28

圖2 IUA-L組、IUA-R組、Sham-L組及Sham-R組子宮7天與28天時CD31染色結果(×400)Fig 2 CD31 staining of IUA-L,IUA-R,Sham-L and Sham-R on day 7 and day 28 (×400)

上皮及間質指標的表達及定量分析上皮指標E-cadherin在正常內膜腺上皮和腔上皮細胞胞質中呈現(xiàn)強陽性表達,間質細胞中偶可見E-cadherin表達。N-cadherin是一個鮮少表達于內膜上皮與間質細胞中的EMT指標。本研究中,可以觀察到IUA-L組大鼠子宮內膜上皮細胞中E-cadherin表達明顯低于IUA-R組和Sham-L組(P<0.001),Sham-L組與Sham-R組相比差異無統(tǒng)計學意義(圖4)。N-cadherin在正常大鼠子宮內膜上皮和間質細胞中幾乎不表達,但在造模的IUA-L組大鼠子宮中可發(fā)現(xiàn)病變的上皮細胞質中N-cadherin表達陽性,而間質細胞中未見表達(圖5)。N-cadherin在IUA-L組中的表達明顯高于IUA-R和Sham-L組(P<0.01),Sham-L組與Sham-R組N-cadherin的表達差異無統(tǒng)計學意義。Vimentin通常表達于間質細胞質中,熒光圖片中可以清楚發(fā)現(xiàn)該指標在IUA-L組大鼠子宮內膜上皮細胞胞質中出現(xiàn),而在未發(fā)生病變和正常的內膜中,Vimentin只表達于間質細胞中,不涉及腺上皮及腔上皮。表達Vimentin的上皮細胞所圍成的腺體形態(tài)大多僵硬(圖6)。

表1 各組子宮內膜腺體數(shù)量、MVD計數(shù)及纖維化率比較Tab 1 Gland numbers,MVD and fibrosis rate of endometrium in different groups

圖3 IUA-L組、IUA-R組、Sham-L組及Sham-R組子宮7天與28天時Masson染色結果Fig 3 Masson staining of IUA-L,IUA-R,Sham-L and Sham-R on day 7 and day 28

轉化生長因子TGF-β1的表達及分析TGF-β1作為一個促炎分子,強陽性表達于IUA-L內膜上皮及間質細胞質中,Sham-L組與正常內膜的IUA-R組和Sham-R組的上皮細胞可見弱表達的TGF-β1,間質細胞則幾乎不表達。IUA-L組造模子宮內膜中TGF-β1的表達顯著升高,其在IUA-R組及Sham-L組中的表達較弱(P<0.01,圖7)。IUA-L組TGF-β1與N-cadherin不相關(P=0.694),而與E-cadherin相關(P=0.031,r=0.288)。

討 論

本研究探討了IUA纖維化與EMT之間的關系。IUA是一種醫(yī)源性疾病,多因宮內操作(如刮宮)等引起,我國的發(fā)病率遠遠高于其他國家[8]。如果將月經看成是一種機體正常的創(chuàng)傷修復,那么IUA則類似于嚴重創(chuàng)傷造成的瘢痕,過度損傷子宮內膜功能層及基底層,從而造成嚴重的炎癥反應,導致內膜纖維化的發(fā)生[9]。

(1)P<0.001.
圖4 免疫組化檢測IUA-L組、IUA-R組、Sham-L組及Sham-R組子宮7天與28天時E-cadherin表達(×400)
Fig 4 E-cadherin of IUA-L,IUA-R,Sham-L andSham-R on day 7 and day 28 by IHC (×400)

根據(jù)文獻報道,雖然有些學者選擇LPS、苯酚膠漿或電熱損傷等方式建立IUA模型,但是本研究傾向于以切除全層子宮內膜的方式建立穩(wěn)定的動物模型,因為此方法更加貼近臨床上IUA的發(fā)病原因[10-11]。7天和28天的時間節(jié)點也提示本模型效果長期有效。本實驗通過建立IUA組以及Sham組模型,以排除單純切開縫合子宮對造模方式的影響,同時本實驗應用了自身對照的方法。如果對大鼠子宮雙側子宮同時進行造模手術,術后雙側子宮粘連到一起的概率較高,不利于解剖取材及觀察。因此本實驗選擇自身對照的方法,既節(jié)約了動物材料,又能較好地獲得觀察效果。

(1)P<0.01.
圖5 免疫組化檢測IUA-L組、IUA-R組、Sham-L組及Sham-R組子宮7天與28天時N-cadherin表達(×400)
Fig 5 N-cadherin of IUA-L,IUA-R,Sham-L andSham-R on day 7 and day 28 by IHC (×400)

EMT過程中上皮細胞失去細胞黏附性,同時獲得更多的間質細胞特性,原本整齊排列的上皮細胞在遭受外界強烈的炎癥刺激后表現(xiàn)出更多的侵襲遷移特性[12]。上皮指標E-cadherin表達下降,細胞逐漸趨于長梭形,細胞間縫隙連接變得稀疏,間質指標N-cadherin表達開始出現(xiàn)[13]。本研究發(fā)現(xiàn),E-cadherin和N-cadherin在病變的內膜上皮細胞中表達改變。同樣,熒光圖片中Vimentin出現(xiàn)于腺體上皮細胞中,更是直觀又強有力地證明了EMT。本研究首次系統(tǒng)地在動物模型中介紹EMT與IUA內膜纖維化發(fā)病機制的關系,即IUA內膜纖維化發(fā)生后,可以確切觀察到上皮細胞逐漸產生間質細胞的特性。通過對E-cadherin、N-cadherin和Vimentin這3個重要的上皮間質指標的觀察,本研究說明EMT在IUA內膜纖維化的發(fā)生中發(fā)揮了至關重要的作用。近年來發(fā)現(xiàn),不論是在正常月經內膜脫落后再生,還是在婦科疾病子宮內膜異位癥和子宮腺肌病的發(fā)病機制中,EMT均發(fā)揮了重要作用,學者們也逐漸認為子宮內膜上皮細胞特性改變,獲得越來越多的間質特性,從而獲得運動能力,侵入肌層或侵襲遷移至周邊組織器官,進而導致內異癥或腺肌癥的發(fā)生[14-15]。內異癥、腺肌癥和IUA的共通之處在于組織病理學均表現(xiàn)為內膜組織的纖維化,越來越多的研究證實EMT在內異癥和腺肌癥的內膜纖維化中存在,結合本研究結果,我們預測EMT與IUA纖維化發(fā)生密切相關。但是本研究無法闡明EMT與纖維化的因果關系。

White arrow points at epithelial cells obtained with Vimentin.
圖6 免疫熒光法檢測IUA-L組、IUA-R組、Sham-L組及Sham-R 組子宮7天與28天時Vimentin表達(×500)
Fig 6 Vimentin of IUA-L,IUA-R,Sham-L and Sham-R on day 7 and day 28 by immunofluorescence (×500)

(1)P<0.01.
圖7 免疫組化檢測IUA-L組、IUA-R組、Sham-L組及Sham-R組子宮7天與28天TGF-β1表達(×400)
Fig 7 TGF-β1 of IUA-L,IUA-R,Sham-L and Sham-Ron day 7 and day 28 by IHC (×400)

TGF-β1是一個重要的促炎分子,不論是在動物模型還是人體內膜標本中,TGF-β1的表達均明顯升高[16-19]。本研究提示TGF-β1與E-cadherin的表達相關,這一現(xiàn)象揭示炎癥反應與EMT的聯(lián)系,即TGF-β1可能誘導上皮細胞性狀的改變,推動內膜以EMT的方式向纖維化發(fā)展。Smad通路是TGF-β1下游經典的通路蛋白,這又提示TGF-β1/Smad通路極有可能以EMT的方式改變內膜上皮細胞特性,使內膜上皮細胞向基質細胞或成纖維細胞和肌成纖維細胞分化,經Smad信號通路調控其向纖維化發(fā)展[20]。

本研究通過建立大鼠IUA模型,說明IUA的發(fā)生過程中存在EMT現(xiàn)象。許多研究一直在探討IUA的干細胞治療策略,以期為臨床宮腔粘連松解術后提供輔助治療,尤其是為了降低重度IUA的復發(fā)率[21-22]。了解IUA的發(fā)病機制能夠為其治療帶來更多新思路和治療參考價值。