鄧小蓉，雷用東,2，盧士玲，劉 娟，張 建,*

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院，農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，新疆 石河子 832000）

高白鮭（Coregonus peled），屬鮭科，白鮭屬，為冷水性魚(yú)類(lèi)[1]，其蛋白質(zhì)含量高，富含二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸等不飽和脂肪酸，易加工。在中國(guó)，目前主要以冷凍肉銷(xiāo)售，而在貯藏和分銷(xiāo)過(guò)程中，往往容易發(fā)生由蛋白氧化引起的質(zhì)量劣變[2]。魚(yú)肉蛋白對(duì)氧化敏感，研究發(fā)現(xiàn)魚(yú)類(lèi)的肌漿蛋白、肌纖維蛋白和基質(zhì)蛋白，可能會(huì)在肌肉或肉加工過(guò)程中被脂類(lèi)、金屬離子和其他氧化劑氧化破壞[3-4]，而大大降低了其食用品質(zhì)和商品價(jià)值。

蛋白氧化通過(guò)不同機(jī)理而形成蛋白交聯(lián)派生物，包括二硫化物、二聚酪氨酸和羰基的形成，以及肽鍵斷裂，使蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變[5]。有研究表明氧化使肌纖維蛋白發(fā)生變性，造成蛋白質(zhì)聚合物的形成和蛋白質(zhì)降解，這可能對(duì)蛋白質(zhì)消化率有影響[6-8]。有報(bào)道稱(chēng)，氧化系統(tǒng)中，蛋白質(zhì)中的二硫鍵和非二硫鍵可以產(chǎn)生交聯(lián)[9]，形成蛋白質(zhì)聚合物，而導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)疏水性基團(tuán)增加，蛋白表面疏水性也隨之增加。蛋白質(zhì)氧化可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象、蛋白溶解性，以及蛋白質(zhì)水解酶的敏感性的改變[10]。Ca和K-ATPase活性受肌漿蛋白上端活性中心的2 個(gè)活性巰基的影響；因此，兩者都可以用作氧化指數(shù)，指示肌漿蛋白結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的變性[11]。

L i Y a n g q i等[12]研究了鯉魚(yú)肌原纖維蛋白（myofibrillar proteins，MP）經(jīng)氧化后，MP的結(jié)構(gòu)和功能變化，顯示MP易受自由基攻擊，氧化應(yīng)激對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和MP的一般功能有不利影響。冷凍也會(huì)誘導(dǎo)魚(yú)肉蛋白氧化，而配以冷凍保護(hù)劑可減少鯉魚(yú)肉肌纖維蛋白氧化，從而減少有損魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)變化的蛋白結(jié)構(gòu)改變[13]。目前對(duì)于魚(yú)類(lèi)蛋白質(zhì)的研究主要集中在冷藏或冷凍過(guò)程中蛋白質(zhì)變化和生理變化方面[14-15]。肌漿蛋白占肌肉組織總蛋白的30%，與魚(yú)肉的顏色、風(fēng)味、持水性等有關(guān)，可間接影響?hù)~(yú)肉質(zhì)構(gòu)品質(zhì)[16]。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)以高白鮭肌漿蛋白（sarcoplasmic proteins，SP）為研究對(duì)象，采用羥自由基氧化系統(tǒng)（hydroxyl radical-generating system，HRGS），對(duì)蛋白進(jìn)行不同程度的體外模擬氧化，研究蛋白氧化對(duì)肌肉蛋白物化特性的影響，蛋白氧化及其物化特性指標(biāo)均對(duì)闡釋氧化還原反應(yīng)對(duì)高白鮭肌肉蛋白質(zhì)量的影響具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高白鮭購(gòu)于新疆賽里木湖，捕撈后立即進(jìn)行內(nèi)臟清理和去鱗處理，封于冰內(nèi)運(yùn)至石河子大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。將魚(yú)背部肌肉切割成大小均勻的肉塊（約15 g），置于冰箱（-20 ℃）中備用。

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)物 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；其他化學(xué)試劑均為優(yōu)級(jí)純。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Cary 50紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、Cary eclipse熒光分光光度計(jì) 美國(guó)Varian公司。

1.3 方法

1.3.1 SP提取

魚(yú)背部肌肉中SP的提取參考Hashimoto[17]和Chine[18]等的方法，提取液分別為磷酸鹽緩沖液A和磷酸鹽緩沖液B，所提取的蛋白用于測(cè)定蛋白氧化后的物化特性變化。

向魚(yú)背部肌肉加入10 倍體積磷酸鹽緩沖液A，均質(zhì)1 min，8 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液，沉淀物再進(jìn)行1 次提取，分別合并2 次提取后的上清液。向上清液中加入10 倍體積的5%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液，8 000 r/min、4 ℃離心15 min，沉淀物即為所需SP。

1.3.2 蛋白氧化

HRGS參照Park等[11]的方法進(jìn)行制備，采用H2O2氧化體系，即控制體系中的FeCl3和抗壞血酸（ascorbic acid，Asc）的濃度，改變H2O2濃度（1～20 mmol/L），發(fā)生氧化還原反應(yīng)而生成自由基。將提取的蛋白樣品分別溶解在HRGS的磷酸鹽緩沖溶液（50 mmol/L、pH 6.0）中，然后將樣品在4 ℃條件下分別放置1、3 h和5 h，使肌肉蛋白發(fā)生不同程度的氧化，待蛋白質(zhì)樣品與氧化液反應(yīng)結(jié)束后加入乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）以終止氧化反應(yīng)。

1.3.3 羰基含量的測(cè)定

參照Oliver等[19]的方法進(jìn)行測(cè)定。取5 mL蛋白樣品于離心管中，每管加入5 mL 10 mmol/L的2,4-二硝基苯肼，室溫下反應(yīng)1 h（每10 min旋渦振蕩1 次）后，添加5 mL 20% TCA溶液，8 000 r/min離心5 min，棄清液；取5 mL體積比為1∶1的無(wú)水乙醇和乙酸乙酯混合溶液清洗沉淀3 次以除去多余的試劑，再向沉淀中加入3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液后置于水浴鍋中（37 ℃，15 min），將沉淀溶解，8 000 r/min離心5 min除去不溶物質(zhì)，離心后的上清液于370 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。采用摩爾消光系數(shù)22 000 L/（mol·cm）計(jì)算羰基含量。蛋白含量采用Biuret法測(cè)定，用血清白蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 總巰基含量的測(cè)定

參照Simplicio等[20]的方法進(jìn)行測(cè)定。取1 mL蛋白樣品溶液，加入8 mL的Tris-甘氨酸（pH 8，每升該溶液中含有10.4 g Tris、6.9 g甘氨酸、1.2 g EDTA、8 mol/L尿素），然后均質(zhì)，8 000 r/min離心15 min，除去不溶蛋白，再向溶液中加入0.5 mL 10 mmol/L Ellman試劑，反應(yīng)30 min后，于412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，采用摩爾消光系數(shù)13 600 L/（mol·cm）計(jì)算總巰基含量，采用Biuret法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。除對(duì)照組不加蛋白溶液外，其他處理方法均如上所述。

1.3.5 游離氨基相對(duì)含量的測(cè)定

根據(jù)Brands等[21]的方法，采用鄰苯二甲醛（orthophthalaldehyde，OPA）顯色法進(jìn)行測(cè)定。準(zhǔn)確稱(chēng)取40 mg的OPA溶解于1 mL甲醇中，先后加入2.5 mL 20%的十二烷基磺酸鈉、25 mL 0.1 mol/L的硼砂和100 μL β-巰基乙醇，并用蒸餾水定容至50 mL。將200 μL蛋白樣品液分別注入到含有4 mL空白液和4 mL OPA試劑的試管中，混合均勻后在35 ℃條件下反應(yīng)2 min，于340 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度A0和A。游離氨基相對(duì)含量按式（1）計(jì)算：

1.3.6 表面疏水性的測(cè)定

參照Chelh等[22]的方法進(jìn)行測(cè)定。取1 mL蛋白樣品溶液加入到200 μL 1 mg/mL的溴酚藍(lán)（bromophenol blue，B P B）中，混勻，室溫下攪拌1 0 m i n，8 000 r/min離心15 min，取上清液于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A。將200 μL 1 mg/mL的BPB加入到1 mL 20 mmol/mL的磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）作為BPB空白樣，磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）為空白樣，測(cè)定吸光度A0。按式（2）計(jì)算：

1.3.7 二聚酪氨酸含量的測(cè)定

參考Davies等[10]的方法進(jìn)行測(cè)定。利用熒光分光光度計(jì)測(cè)定二聚酪氨酸含量，測(cè)定條件為發(fā)射波長(zhǎng)420 nm，激發(fā)波長(zhǎng)325 nm，狹縫寬度10 nm。

1.3.8 Ca2+-ATPase活性的測(cè)定

根據(jù)Katoh等[23]的方法測(cè)定。取0.2 mL蛋白樣品溶液于2 mL Ca2+-ATPase反應(yīng)液（內(nèi)含7.6 mmol/L ATP、15 mmol/L CaCl2·2H2O、150 mmol/L KCl、180 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，溫度25 ℃）中反應(yīng)10 min后，加入1.0 mL 10% TCA溶液終止反應(yīng)，8 000 r/min離心5 min去除沉淀，取1.0 mL上清液并加入3.0 mL 0.66%的鉬酸銨溶液，充分混合后，加入0.5 mL新配制的10% FeSO4溶液，反應(yīng)2 min，于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算磷酸鹽的含量。

1.3.9 SDS-PAGE測(cè)定

配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的肌肉蛋白溶液置于塑料離心管中，加入等體積的5×樣品緩沖液（含50%甘油、10% SDS、β-巰基乙醇、1% BPB和1 mol/L pH 6.8的Tris-HCl），混勻后，于100 ℃水浴2 min，冷卻至室溫備用。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）參照Laemmli[24]的方法。電泳選用10%的分離膠和5%的濃縮膠，上樣量為5 μL，電泳開(kāi)始時(shí)將電壓調(diào)到80 V，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)節(jié)到120 V。電泳結(jié)束后，將電泳膠片剝出，用考馬斯亮藍(lán)（2.5 g考馬斯亮藍(lán)R-250，500 mL甲醇，100 mL冰乙酸定容至1 000 mL）染色30 min，然后用脫色液（250 mL甲醇、75 mL冰乙酸，定容至1 000 mL）進(jìn)行多次脫色，直至膠片透明，蛋白質(zhì)樣品分子質(zhì)量的確定根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker的相對(duì)遷移率計(jì)算獲得。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin和SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和差異顯著性分析，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 羰基含量的變化

圖1 高白鮭SP氧化后羰基含量的變化Fig. 1 Changes in carbonyl content in SP after oxidation

蛋白質(zhì)氧化過(guò)程復(fù)雜并產(chǎn)生更多的氧化產(chǎn)物，羰基的形成是氧化后蛋白質(zhì)中的一個(gè)最顯著的變化[25-27]。如圖1所示，SP羰基隨氧化劑H2O2濃度和氧化時(shí)間的增加而增加（P＜0.05），在經(jīng)過(guò)20 mmol/L H2O2氧化后，羰基含量與未氧化的羰基含量相比增加了41.28%。在較低濃度氧化劑作用下，氧化時(shí)間對(duì)SP羰基含量的變化影響顯著（P＜0.05），在較高濃度氧化劑條件下（20 mmol/L）羰基含量變化趨于平衡。肌肉組織中的氨基酸殘基側(cè)鏈和多肽鏈均為自由基攻擊的對(duì)象，氨基酸側(cè)鏈上的—NH—或者是—NH2被羥自由基氧化，轉(zhuǎn)化成羰基基團(tuán)[28]。實(shí)驗(yàn)中羰基含量的增加可能是由于H2O2中的羥自由基的不斷增加，而羥自由基與氨基酸側(cè)鏈或肽鏈不斷發(fā)生氧化反應(yīng)造成羰基含量的增加。

2.2 總巰基含量的變化

如圖2所示，隨著H2O2濃度增大和氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，可觀察到SP總巰基含量顯著減少（P＜0.05），氧化劑H2O2（20 mmol/L）氧化5 h后SP總巰基含量減少了65.9%。結(jié)果表明總巰基含量對(duì)氧化劑濃度和作用時(shí)間均敏感。巰基是蛋白質(zhì)中一個(gè)重要的功能基團(tuán)，具有很高的抗氧化活性，在H2O2存在的條件下極易氧化，形成各種氧化產(chǎn)物，例如—SOH、—SOOH、—SS—，而導(dǎo)致總巰基的減少[13,29-30]。另外有報(bào)道稱(chēng)，氧化系統(tǒng)中，蛋白質(zhì)中的二硫鍵和非二硫鍵可以產(chǎn)生交聯(lián)，是形成蛋白質(zhì)聚合的主要途徑[9,31]。巰基變化結(jié)果表明，蛋白氧化使SP巰基基團(tuán)氧化形成各種氧化產(chǎn)物，并形成蛋白聚合物。

圖2 高白鮭SP氧化后總巰基含量的變化Fig. 2 Changes in total sulfhydryl content in SP after oxidation

2.3 游離氨基相對(duì)含量變化

圖3 高白鮭SP氧化后游離氨基相對(duì)含量的變化Fig. 3 Changes in free amino group content of SP after oxidation

如圖3所示，隨著H2O2濃度增加和氧化時(shí)間延長(zhǎng)，游離氨基相對(duì)含量減少（P＜0.05）。在H2O2濃度達(dá)到20 mmol/L和氧化時(shí)間達(dá)到5 h時(shí)，SP游離氨基相對(duì)含量顯著減少，更長(zhǎng)的氧化時(shí)間或更高的H2O2濃度，蛋白的游離氨基相對(duì)含量趨于減少。結(jié)果表明，游離氨基相對(duì)含量的降低，可能與蛋白氨基酸側(cè)鏈中含有—NH—或—NH2的氨基酸參與了羰基的形成有關(guān)，這與羰基結(jié)果變化趨勢(shì)相呼應(yīng)（圖1），結(jié)果與Morzel等[32]對(duì)豬骨胳肌MP氧化后游離氨基的研究結(jié)果相似。理論上，活性氧主要的攻擊對(duì)象是蛋白質(zhì)中的氨基酸側(cè)鏈，所有的氨基酸幾乎都可以被自由基攻擊，但是不同的氨基酸對(duì)自由基的敏感程度不同，蛋白中具體哪種氨基酸側(cè)鏈參與反應(yīng)，還需進(jìn)一步研究。

2.4 表面疏水性的變化

圖4 高白鮭SP氧化后表面疏水性的變化Fig. 4 Changes in surface hydrophobicity of SP after oxidation

如圖4所示，經(jīng)氧化劑H2O2處理后，SP表面疏水性均增加，與氧化劑濃度和氧化時(shí)間呈正相關(guān)。與對(duì)照組相比，氧化劑H2O2的加入可顯著增加SP表面疏水性（P＜0.05），隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)SP表面疏水性增加（P＜0.05），與羰基增加趨勢(shì)相似，結(jié)果與Liu Qian等[13]的研究結(jié)果相似。蛋白疏水性增加，可能與疏水氨基酸殘基暴露密切相關(guān)[27]，總巰基變化產(chǎn)生的二硫鍵和非二硫鍵產(chǎn)生交聯(lián)，而導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)的疏水性基團(tuán)增加[31]。另外，疏水性增加可能還與蛋白質(zhì)聚合物的形成會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)的疏水性基團(tuán)增加有關(guān)[27]。

2.5 二聚酪氨酸含量的變化

圖5 高白鮭SP氧化后二聚酪氨酸含量的影響Fig. 5 Changes in dityrosine content of SP after oxidation

二聚酪氨酸的形成是蛋白在自由基氧化體系中發(fā)生氧化的一個(gè)重要標(biāo)記。如圖5所示，隨著H2O2濃度增加和氧化時(shí)間延長(zhǎng)，二聚酪氨酸含量明顯增加（P＜0.05）。在較低濃度氧化劑作用下，氧化時(shí)間對(duì)SP二聚酪氨酸含量的變化影響顯著（P＜0.05），在較高濃度氧化劑條件下（20 mmol/L）二聚酪氨酸含量變化趨于平衡。在H2O2濃度達(dá)到20 mmol/L和氧化時(shí)間達(dá)到5 h時(shí)，SP二聚酪氨酸含量與未氧化時(shí)相比增加了39.5%。結(jié)果說(shuō)明蛋白氧化使蛋白氨基酸側(cè)鏈發(fā)生改變，酪氨酸-酪氨酸交聯(lián)，形成酪氨酸二聚體。蛋白氧化過(guò)程中，二硫鍵對(duì)蛋白質(zhì)分子的交聯(lián)起到主要作用，二聚酪氨酸對(duì)蛋白質(zhì)的交聯(lián)作用并不顯著[5]。因此，二聚酪氨酸結(jié)果可顯示蛋白氨基酸側(cè)鏈形成交聯(lián)，是否交聯(lián)形成蛋白質(zhì)聚合物需進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.6 Ca2+-ATPase活性的變化

圖6 高白鮭SP氧化后對(duì)Ca2-ATPase活性的影響Fig. 6 Changes in Ca2+-ATPase activity of SP after oxidation

Ca2+-ATPase活性受SP上端活性中心的活性巰基的影響[33]，可用作氧化指數(shù)，指示SP結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的變性[34]。同時(shí)，在蛋白氧化過(guò)程中，會(huì)造成酶活性發(fā)生改變，Ca2+-ATPase活性是反映蛋白變性程度的重要指標(biāo)之一。SP氧化研究顯示H2O2的添加可降低蛋白Ca2+-ATPase活性。如圖6所示，Ca2+-ATPase活性隨氧化劑濃度增加和氧化時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，活性降低明顯（P＜0.05），在較高濃度水平（15 mmol/L和20 mmol/L）時(shí)達(dá)到平衡。Wang Baowu等[35]的報(bào)道顯示新鮮牛肉肌原纖維分離的SP Ca2+-ATPase活性與巰基含量密切相關(guān)，但在凍結(jié)肌纖維蛋白樣品中，它與疏水氨基酸殘基暴露密切相關(guān)。研究結(jié)果表明，SP Ca2+-ATPase活性的降低，與巰基氧化形成二硫鍵有關(guān)[36]，造成酶活性中心發(fā)生改變，而使Ca2+-ATPase活性下降。

2.7 SDS-PAGE圖譜分析

如圖7A所示，高白鮭SP氧化后的蛋白質(zhì)條帶發(fā)生了明顯的變化。SP氧化后，14～25 kDa和70～160 kDa的分子條帶變淡，這可能是蛋白氧化使低分子物質(zhì)發(fā)生聚合，而高分子物質(zhì)發(fā)生斷裂，出現(xiàn)新的30～70 kDa之間的中間條帶。延長(zhǎng)氧化時(shí)間，SP的新條帶逐漸減弱（圖7B）。蛋白氧化通過(guò)不同機(jī)理而形成蛋白交聯(lián)派生物，包括二硫化物、二聚酪氨酸和羰基的形成，以及肽鍵斷裂，使蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變[5]。由此可見(jiàn)，由于氧化劑的介入，SP發(fā)生聚合，同時(shí)肽鍵斷裂，發(fā)生蛋白降解，從而改變了蛋白的物化特性。

圖7 高白鮭SP經(jīng)氧化后的SDS-PAGE圖譜Fig. 7 SDS-PAGE patterns of C. peled SP after oxidation

3 結(jié) 論

在HRGS系統(tǒng)內(nèi)，可明顯地觀察到高白鮭SP氧化反應(yīng)（P＜0.05）。結(jié)果表明，氧化劑H2O2（1～20 mmol/L），使高白鮭SP的羰基含量、二聚酪氨酸含量、表面疏水性均明顯增加（P＜0.05），低濃度范圍內(nèi)（1、5 mmol/L和10 mmol/L H2O2），對(duì)氧化劑濃度敏感?？値€基含量、游離氨基相對(duì)含量和Ca2+-ATPase活性降低（P＜0.05），在整個(gè)過(guò)程中呈濃度依賴(lài)型，中高濃度范圍內(nèi)（10、15 mmol/L和20 mmol/L H2O2），對(duì)氧化劑濃度敏感。隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)（1、3 h和5 h），SP的物化指標(biāo)變化趨勢(shì)與氧化劑濃度相似，在相同氧化劑濃度下，氧化時(shí)間越長(zhǎng)（5 h），對(duì)氧化時(shí)間越敏感。SDS-PAGE測(cè)定從分子水平上證實(shí)了，蛋白氧化使蛋白聚合和肽鍵斷裂分解。因此，高白鮭貯藏和加工條件尤為重要，防止過(guò)程中因外界因素導(dǎo)致肌肉蛋白氧化，從而減輕蛋白氧化對(duì)高白鮭肌肉蛋白物化特性的改變。