葛云飛，康子悅，沈 蒙，王 娟，全志剛，肖金玲，王維浩,2，曹龍奎,2,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學 國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319）

高粱屬于禾本科高粱屬，又名蜀黍、高粱米，蘆栗等[1]，因其高產(chǎn)性和高抗逆性及其在制糖、發(fā)酵食品、飼料及生物燃料等方面用途廣泛而被大量種植[2-3]，由于高粱具有涼血、解毒之功效，因此常吃高粱食品，不僅可緩解積食等消化不良癥，還可預防多種疾病[4]。

淀粉為高粱中主要的碳水化合物，質量分數(shù)約為60%～70%，高者可達80%左右，因此淀粉的理化性質直接影響到高粱的食用品質及老化性能，生活中因高粱的口感較粗糙，適口性較差而不易被消費者所接受，在以往的文獻報道中通常采用發(fā)酵、發(fā)芽和化學處理改善高粱的食用品質，擴大其應用范圍[5]，在西方國家通常將高粱進行發(fā)酵生產(chǎn)斷奶粥、高粱發(fā)酵飲料[6]、高粱面包等[7]。在目前發(fā)酵高粱的研究中主要集中在探討高粱消化率的大小、淀粉的理化性質[8]及發(fā)酵菌株的鑒定與篩選[9]，而對于自然發(fā)酵后高粱淀粉的分子結構及老化性能涉及較少，由許永亮等[10]研究可知，淀粉是由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成的高分子化合物，其中淀粉的凝膠特性、流變特性、熱特性及顆粒形態(tài)不僅與淀粉分子結構有關，還受分子質量分布情況的影響，所以只有進一步研究發(fā)酵高粱淀粉的分子結構及其理化性質，才能擴大高粱的應用范圍。

因山東臨沂R高粱的直鏈淀粉含量較高，更易老化，因此將其作為研究對象，本研究將高粱進行發(fā)酵0～15 d，探討不同發(fā)酵時期高粱淀粉的分子結構、顆粒形態(tài)及高粱淀粉的老化性能指標，并與未發(fā)酵高粱淀粉作對比，通過發(fā)酵處理提高高粱的老化性能，使其適用于生產(chǎn)米粉、粉絲等產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，提高其利用率，并為高粱淀粉的應用提供理論基礎與數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高粱為山東臨沂R高粱；鹽酸、氧化鈉（均為分析純）、溴化鉀（光譜級） 天津市大茂化學試劑廠；葡聚糖標準 美國Sigma公司；蒸餾水為實驗室自制。

1.2 儀器與設備

Dgg-9053A型電熱鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；MJ-10A型磨粉機 上海市浦恒信息科技有限公司；RVA4500型快速黏度分析儀 瑞典波通儀器公司；DSC1型差示掃描量熱儀 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；TAQ2000國產(chǎn)高壓不銹鋼坩堝 上海瑾恒儀器有限公司；掃描電子顯微鏡 荷蘭FEI公司；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher公司；凝膠色譜-示差-多角度激光光散射儀 美國Waters公司；ICS-5000離子色譜儀 美國Dionex公司。

1.3 方法

1.3.1 高粱的自然發(fā)酵

取高粱150 g，經(jīng)蒸餾水水洗3 次，加入蒸餾水300 g、葡萄糖4.5 g，在30 ℃自然發(fā)酵0～15 d。

1.3.2 自然發(fā)酵高粱淀粉的制備

發(fā)酵后的高粱進行水洗，于35 ℃烘干。將干磨后過80 目篩的高粱粉按料液比1∶3（g/mL）于0.3 g/100 mL的NaOH溶液中浸提3 h，4 000 r/min離心10 min，棄上清液，除去沉淀中上層黃褐色物質，連續(xù)水洗4 次，離心直至淀粉漿呈白色為止。用1 mol/L HCl溶液調淀粉漿至pH 7.0，離心，30 ℃干燥，過80 目篩備用[11]。

1.3.3 自然發(fā)酵對高粱淀粉分子結構的影響

1.3.3.1 發(fā)酵對高粱淀粉分子質量的影響

樣品處理：取10 mg淀粉樣品，加1 mL 90%二甲基亞砜，100 ℃溶解過夜，加3 mL無水乙醇，離心去除上清液，沉淀經(jīng)無水乙醇洗2 次，風干后加3 mL 1 mol/L NaNO3溶液（含0.02% NaN3）于121 ℃反應20 min，12 000 r/min離心10 min，取100 μL上樣，樣品數(shù)據(jù)用ASTRA 6.1軟件分析[12]。

檢測條件：流動相為0.1 mol/L NaNO3溶液（含0.02% NaN3），流速0.4 mL/min，柱溫60 ℃，分析柱型號為Ohpak SB-804 HQ、Ohpak SB-806 HQ，上樣量100 μL。

1.3.3.2 發(fā)酵對高粱淀粉分子官能團的影響

取高粱淀粉0.5～2 mg，再加入100～200 mg經(jīng)過磨細干燥的KBr粉末，混合研磨均勻后，放入傅里葉紅外光譜儀光束中進行全波段的掃描，掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，最后得到發(fā)酵高粱淀粉的紅外光譜圖[13]。

1.3.3.3 發(fā)酵對高粱淀粉分子鏈長分布的影響

稱取已純化淀粉2 mg，先用500 μL 95%乙醇溶液重懸，再加4.5 mL去離子水，沸水浴60 min，間斷渦旋混勻，取2.5 mL的糊化樣品，加入10 μL（1 000 U/μL）異淀粉酶脫分支。樣品600 μL每管進行分裝，在室溫下真空干燥。溶解后取25 μL樣品注射入配置有二極管陣列檢測器和PA-1色譜柱的ICS5000中。淋洗速率0.5 mL/min。不同鏈長所對應的峰面積用PeakNet軟件進行分析。色譜條件：流動相為NaOH-NaAC，流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃，色譜柱型號為PA1，上樣量25 μL。

1.3.3.4 發(fā)酵對高粱淀粉結晶度的影響

X-射線衍射儀分析條件：特征射線CuKa，功率1 600 W，管流40 mV，管壓4.0×104V，掃描速率4°/min，掃描范圍2θ為3°～60°，步長0.02°，DS-SS-RS設置分別為1 mm-1 mm-0.1 mm[14]。利用X′pert HighScore軟件進行結晶度的計算，并導出相應曲線。

1.3.3.5 發(fā)酵對高粱淀粉顆粒形態(tài)的影響

用導電膠將分散均勻的高粱淀粉樣品固定，利用離子濺射鍍膜儀噴金，用掃描電鏡進行觀察并拍攝有代表性的照片。

1.3.4 自然發(fā)酵對高粱淀粉老化性質的影響

稱取3.500 g（干基）發(fā)酵及未發(fā)酵高粱淀粉于鋁筒中，加蒸餾水25 mL，35 ℃保溫3 min，以升溫速率6 ℃/min加熱到95 ℃，保溫5 min，以6 ℃/min速率降溫到50 ℃，用RVA4500型快速黏度分析儀分析得到老化特征值[15]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel、SPSS軟件對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用Origin軟件進行繪圖處理，各數(shù)據(jù)重復測定3 次取 ±s。

2 結果與分析

2.1 自然發(fā)酵對高粱淀粉分子結構的影響

2.1.1 發(fā)酵對高粱淀粉分子質量的影響

圖1 自然發(fā)酵高粱淀粉分子質量分布圖譜Fig. 1 Molecular mass distribution profiles of naturally fermented sorghum starch

表1 自然發(fā)酵高粱淀粉分子質量測定結果Table 1 Molecular weight measurement of naturally fermented sorghum starch

圖1為自然發(fā)酵高粱淀粉分子質量，隨著發(fā)酵時間的延長高粱淀粉分子質量先降低后增加。0～14 d分子質量測定結果如表1所示，自然發(fā)酵高粱淀粉的重均分子質量（mw）低于未發(fā)酵淀粉，其中低分子質量（＜1×107Da）百分含量由未發(fā)酵的74.2%最高增加至83.1%，而高分子質量（mw＞4×107Da）部分隨發(fā)酵時間的延長波動變化，其發(fā)生原因是在發(fā)酵過程中，微生物的豐富度隨發(fā)酵時間的延長而增加，所積累一定的酶、有機酸類物質，其中發(fā)酵液中所積累的淀粉酶類物質，而發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機酸先作用于支鏈淀粉分子外側鏈，使之降解生成短支鏈與或直鏈淀粉，使發(fā)酵后的高粱淀粉分子質量降低[16]，隨著發(fā)酵時間的延長淀粉酶等物質進一步將直鏈淀粉水解成支鏈淀粉或短直鏈淀粉，分子質量小幅度增加，而在發(fā)酵后期有機酸等物質積累達到高值，使高粱淀粉的α-1,4鍵和α-1,6鍵進行水解成葡萄糖使分子質量降低。而直鏈淀粉比例的相對增加，可能會導致回生值增加。分散指數(shù)即mw/mn的降低表示發(fā)酵體系中的組分變得單一，分子質量分布情況逐漸簡單化，發(fā)酵使淀粉中的長支鏈部分發(fā)生降解，形成短支鏈等中間組分，使支鏈淀粉與直鏈淀粉的比例相對降低，使發(fā)酵后的高粱淀粉更易老化，形成凝膠結構[17]。

2.1.2 發(fā)酵對高粱淀粉官能團的影響

圖2 自然發(fā)酵高粱淀粉傅里葉紅外圖譜Fig. 2 FTIR spectra of naturally fermented sorghum starch

傅里葉近紅外光譜因對淀粉分子構象變化敏感，可分析淀粉分子結構而被廣泛應用[18]。利用紅外光譜研究自然發(fā)酵過程中高粱淀粉分子官能團及化學鍵的變化，如圖2所示，在峰1和峰3處出現(xiàn)的較強吸收峰為C—H面內彎曲振動，峰2處為C—O伸縮振動吸收峰，峰4處為C＝O伸縮振動吸收峰，峰5處為C—H伸縮振動吸收峰，峰6處為O—H伸縮振動吸收峰。Park等[19]研究發(fā)現(xiàn)，淀粉分子在1 022 cm-1處的紅外吸收代表淀粉無定形區(qū)的結構特征，在1 047 cm-1處的紅外吸收代表淀粉分子結晶區(qū)的結構特點，而由圖2可知不同發(fā)酵時間的淀粉分子在結晶區(qū)和不定型區(qū)的敏感程度較小。在本研究中4 種不同發(fā)酵時間淀粉樣品的紅外吸收光譜峰形沒有明顯差異，沒有新吸收峰的出現(xiàn)，但是吸收峰強度在一定程度上發(fā)生變化，其中吸收峰強度大小順序為發(fā)酵3 d＞發(fā)酵8 d＞發(fā)酵0 d＞發(fā)酵14 d。因此發(fā)酵過程中未產(chǎn)生新的化學鍵或者基團，未破壞淀粉的分子的基本結構。

2.1.3 發(fā)酵對高粱支鏈淀粉鏈長分布的影響

支鏈淀粉的聚合度，即為支鏈淀粉鏈的長度，通常以脫水葡萄糖基元的個數(shù)表示[20]。根據(jù)Jaiswal等[21]研究可知支鏈淀粉的鏈長分布、分支簇及其排列的不同直接影響著淀粉的顆粒形態(tài)及理化性質，并最終導致物種間、品種及組織間淀粉的功能性質差異。

支鏈淀粉通過異淀粉酶去支化，并利用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測發(fā)酵前后高粱支鏈淀粉的鏈長分布情況，由表2可知，發(fā)酵前后的支鏈淀粉鏈長分布顯著變化，其中發(fā)酵使短支鏈淀粉即聚合度分布在DP 6～24的含量較未發(fā)酵的降低1.8%～3.89%，長支鏈淀粉即聚合度分布在DP不小于60的含量較未發(fā)酵長支鏈淀粉含量高0.9%～2.01%，其發(fā)生原因是隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵底物有機酸和淀粉酶的積累，先作用于支鏈淀粉最外側非還原性末端，使支鏈淀粉的外側短支鏈進行降解，使其含量降低，長支鏈淀粉含量相對增加，使大分子長支鏈淀粉得到純化，平均聚合度增加。

表2 自然發(fā)酵對直鏈淀粉鏈長分布的影響Table 2 Effect of natural fermentation on amylose chain length distribution

2.1.4 發(fā)酵對高粱淀粉結晶度的影響

圖3 自然發(fā)酵高粱淀粉的X-衍射圖譜Fig. 3 X-diffraction pattern of naturally fermented sorghum starch

由圖3可知，自然發(fā)酵前后高粱淀粉峰形沒有改變，僅衍射強度發(fā)生一定變化，表現(xiàn)仍為典型的A型結晶結構，發(fā)酵高粱淀粉均在2θ為15°、17°、18°、23°處有特殊衍射峰（峰序號1～4），即發(fā)酵未改變高粱淀粉的晶型，只改變了淀粉的特征峰的衍射強度。淀粉為部分結晶物，包括結晶區(qū)、部分結晶區(qū)及非結晶區(qū)，其中非結晶區(qū)為短程有序，長程無序的區(qū)域，主要由直鏈淀粉構成，且呈明顯的彌散衍射特征；部分結晶區(qū)及結晶區(qū)域為晶粒粒度較大且完整有序的結構，由支鏈淀粉構成[22-23]。

表3 自然發(fā)酵高粱淀粉X-衍射2θ角和峰寬Table 3 X-diffraction angle and peak width of naturally fermented sorghum starch

由表3可知，通過不同發(fā)酵時間的處理，高粱淀粉的結晶度發(fā)生變化，較未發(fā)酵高粱淀粉結晶度增加1.94%、1.3%和1.96%，在自然發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌代謝產(chǎn)生的有機酸或酶類物質作用于淀粉結構較松散的非結晶區(qū)，使無定型區(qū)即非結晶區(qū)遭到削弱或破壞，直鏈淀粉溶出，回生值增加，而由于淀粉結晶區(qū)中糖構象的固定化以及淀粉鏈的緊密結合使H3O+不容易滲透到淀粉結晶區(qū)內部[24]，但會使結晶區(qū)較外側的短支鏈淀粉降解，支鏈淀粉的短支鏈聚合度降低，使淀粉分子的結晶區(qū)比例相對增加，即發(fā)酵使淀粉的結晶度增加。

2.1.5 發(fā)酵對高粱淀粉顆粒表面形態(tài)的影響

圖4 自然發(fā)酵高粱淀粉顆粒形態(tài)Fig. 4 Observation of naturally fermented sorghum starch granules

由圖4可以看出，高粱淀粉顆粒多數(shù)為不規(guī)則球體，表面內凹，少數(shù)表面為類蜂窩狀結構[25]。通過不同時間的發(fā)酵處理與未發(fā)酵淀粉進行對比可知發(fā)酵后的淀粉顆粒表面有較明顯的被腐蝕的空洞，顆粒形狀不完整，顆粒表面的小顆粒淀粉比例增加，說明發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機酸、酶類物質使淀粉分子發(fā)生一定程度的降解，使直鏈淀粉從顆粒內部溶出。在發(fā)酵14 d時，淀粉顆粒形態(tài)較光滑，大小形狀較均一，而顆粒均勻的淀粉是獲得良好凝膠性能的重要因素之一[26]，因此此時的高粱淀粉較適合生產(chǎn)米粉等老化特征較明顯的產(chǎn)品。

2.2 自然發(fā)酵對高粱淀粉老化性質的影響

Aggarwala等[27]研究發(fā)現(xiàn)RVA老化特征曲線特點與原料顆粒形態(tài)、粒徑、相對分子質量、直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例有關。高粱在一定溫度、加糖量的條件下進行自然發(fā)酵與未發(fā)酵高粱淀粉的老化特征值比較，如表4所示，與未發(fā)酵高粱淀粉相比，峰值黏度和衰減值先增加后降低，最終黏度及回生值升高，凝膠強度增加，結論與袁美蘭等[28]研究結果相同。

淀粉分子以葡萄糖聚合物的形式存在，包埋于高粱顆粒中的蛋白球體中，此時顆粒的空間位阻較大，抗剪切能力增強，通過自然發(fā)酵處理，所產(chǎn)生的有機酸、酶等物質降解高粱中的蛋白質與脂肪，使淀粉分子充分暴露，吸水膨脹，因此峰值黏度增加，隨著發(fā)酵時間的延長，有機酸、酶類物質的不斷積累，使高粱的支鏈淀粉發(fā)生降解斷鏈或脫支，使支鏈淀粉的平均聚合度和平均鏈長降低，因此發(fā)酵后期淀粉分子的峰值黏度降低，而通過Camargo[29]、Chang[30]、Han[31]等研究可知支鏈淀粉的長鏈含量與衰減值呈高度正相關，因此發(fā)酵使衰減值增加?；厣到沂镜矸酆鋮s過程中直鏈淀粉形成凝膠的能力或老化的趨勢，反映了淀粉冷糊的穩(wěn)定性和老化趨勢，自然發(fā)酵使高粱淀粉的回生值增加，其原因發(fā)酵使高粱中的溶出的直鏈淀粉分子含量增加[32]，隨著發(fā)酵時間的延長，淀粉分子內部結構發(fā)生變化，分子間的氫鍵發(fā)生斷裂，淀粉分子由有序晶體向無序晶體轉化。

表4 自然發(fā)酵對高粱淀粉老化性質的影響Table 4 Effect of natural fermentation on retrogradation properties of sorghum starch mPa·s

3 結 論

高粱自然發(fā)酵0～15 d，探討發(fā)酵過程中淀粉顆粒形態(tài)、分子結構及老化性質的變化規(guī)律，通過與未發(fā)酵淀粉進行對比可知：發(fā)酵使淀粉顆粒表面發(fā)生侵蝕形成孔洞，而利用紅外光譜檢測可知發(fā)酵后未形成新化學鍵及化學結構，但使高粱淀粉的mw降低，低分子質量物質的增多及高分子物質的減少，說明發(fā)酵使長支鏈淀粉分子發(fā)生降解，生成短支鏈或直鏈淀粉，有利于淀粉分子聚集形成致密有序化結構進一步形成凝膠，因此發(fā)酵使淀粉的回生值增加，糊化溫度熱晗值降低。本研究不僅通過不同角度探討發(fā)酵對淀粉分子的影響機理，還通過控制發(fā)酵條件生產(chǎn)老化高粱產(chǎn)品如粉絲等，進一步擴大高粱的應用范圍，提高其應用價值。