范冬茹 范瑞紅 馬 珂 王丹麗

（伊春林業(yè)科學(xué)院，黑龍江伊春153000）

木醋液為天然生物制劑，以農(nóng)林廢棄物為原料，通過熱裂解技術(shù)提取粗煉得到。木醋液含有多種化合物及K、Ca、Mg、Zn、Mn、Fe等礦物質(zhì)，此外還含有維生素B1和B2，是一種天然的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[1]。木醋液加入食用菌的培養(yǎng)基中，對(duì)食用菌的菌絲體、子實(shí)體的生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用[2]。

羊肚菌（Morchella denta）又名美味羊肚菌，俗稱羊雀菌、包谷菌等，隸屬于子囊菌亞門（Aseomycoti—na）、盤菌（Diseomyeetes）、盤菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌屬（Morchella）[3]。羊肚菌具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，是一種大型的食用兼藥用真菌。野生羊肚菌產(chǎn)量極小，近年來人工栽培技術(shù)有所突破，但目前仍供不應(yīng)求，價(jià)格仍然偏高，從而限制了羊肚菌的開發(fā)及應(yīng)用。液體發(fā)酵技術(shù)具有培養(yǎng)條件易控制、菌絲體生長(zhǎng)速度快、量大等優(yōu)點(diǎn)，為羊肚菌的開發(fā)利用提供了很好的途徑。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于羊肚菌的液體深層發(fā)酵技術(shù)有一定的研究，木醋液在金針菇等食用菌液體發(fā)酵上也有應(yīng)用，但木醋液在羊肚菌液體發(fā)酵中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。為此，筆者研究了木醋液對(duì)羊肚菌液體培養(yǎng)時(shí)菌絲生長(zhǎng)的影響，以期為羊肚菌發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

羊肚菌菌株:六妹羊肚菌（Morchella sextelata），伊春林業(yè)科學(xué)院保存。

菌種活化培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加水1000 mL，pH自然。

液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基[4]:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨0.5 g，牛肉膏0.5 g，pH自然，加水1000 mL。

木醋液:山東潤(rùn)益生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

將馬鈴薯洗凈、去皮、切塊，煮至熟而不爛為止，四層紗布過濾后，加入葡萄糖、瓊脂，加熱使之融化混合均勻，加水定容，分裝在試管中。121℃滅菌30 min，擺斜面放涼備用。無菌環(huán)境下，取4℃下保存的斜面羊肚菌菌種，接種于斜面上，在20℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d。

1.2.2 液體培養(yǎng)基制備

按照液體培養(yǎng)基配方制作培養(yǎng)基，分裝在容量為250 mL三角瓶中，每瓶100 mL。并將木醋液分別按濃度（g∕100 mL）0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%添加到三角瓶中，以空白為對(duì)照，滅菌。

1.2.3 液體培養(yǎng)

在無菌條件下，從斜面培養(yǎng)基上挑取羊肚菌菌絲體，接入裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，每瓶10個(gè)接種點(diǎn)，置20℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速140 r∕min，培養(yǎng)8 d。

1.2.4 觀察測(cè)定內(nèi)容及方法

1.2.4.1 菌絲體形態(tài)特征觀察

培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)菌絲體形態(tài)特征進(jìn)行觀察描述:菌絲球形態(tài)、菌絲球大小、菌絲密度、培養(yǎng)液顏色，記錄菌絲萌發(fā)時(shí)間。

1.2.4.2 菌絲干重測(cè)定方法

接種后，分別于第2天、4天、6天、8天測(cè)量菌絲干重。培養(yǎng)液經(jīng)過濾網(wǎng)過濾，所得菌絲體用蒸餾水再反復(fù)洗滌2～3次后，置于80℃干燥箱中烘干至恒重，電子天平稱量菌絲體干重。并計(jì)算出每100 mL發(fā)酵液中的菌絲體生物量（g∕100 mL），計(jì)算3次重復(fù)的平均值。

菌絲生物量（g∕100 mL）=菌絲干質(zhì)量（g）∕發(fā)酵液總體積（100 mL）

1.2.4.3 培養(yǎng)液pH測(cè)定

分別對(duì)培養(yǎng)前及培養(yǎng)8 d后的不含菌絲的培養(yǎng)基測(cè)定pH。取每組3次重復(fù)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度木醋液液體培養(yǎng)基中羊肚菌菌絲體形態(tài)特征

如表1所示，羊肚菌在木醋液濃度為0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的液體培養(yǎng)基中均可生長(zhǎng)，同時(shí)羊肚菌菌絲體和培養(yǎng)基狀態(tài)存在較明顯的差異。菌絲萌發(fā)時(shí)間:除了木醋液濃度0.6%、0.8%的培養(yǎng)基中菌絲第3天萌發(fā)，其他均在第1天萌發(fā)；木醋液濃度為0.05%、0.1%、0.2%的培養(yǎng)基中菌絲球比對(duì)照大，但菌絲密度相當(dāng)，木醋液濃度04%、0.6%、0.8%培養(yǎng)基中菌絲球大小及菌絲密度都不及對(duì)照，且長(zhǎng)勢(shì)越來越差，說明木醋液超過一定濃度對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)具有抑制作用。培養(yǎng)8 d后各培養(yǎng)基的顏色也存在明顯不同，對(duì)照培養(yǎng)基呈紅棕色，木醋液濃度0.05%、0.1%、0.2%、0.4%培養(yǎng)基呈橘黃色，而木醋液濃度0.6%、0.8%培養(yǎng)基呈褐色。

表1 不同濃度木醋液液體培養(yǎng)基中羊肚菌菌絲體特征

因?yàn)槟敬滓罕旧沓噬詈稚栽诰z培養(yǎng)之前各培養(yǎng)基的顏色是隨著木醋液濃度的增加而加深。而木醋液濃度0.05%、0.1%、0.2%、0.4%的培養(yǎng)基隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，顏色變淺，可能是因?yàn)檠蚨蔷z對(duì)培養(yǎng)基成分和木醋液分解利用的緣故。而木醋液濃度0.6%、0.8%的培養(yǎng)基羊肚菌菌絲生長(zhǎng)受到抑制，對(duì)培養(yǎng)基成分和木醋液的分解利用較少，所以培養(yǎng)液顏色變化不明顯。

2.2 不同濃度木醋液液體培養(yǎng)基中羊肚菌的菌絲生物量

接種后第2天、4天、6天、8天測(cè)定的羊肚菌菌絲生物量見圖2。此圖2可見，在一定培養(yǎng)溫度，羊肚菌菌絲生物量與發(fā)酵時(shí)間有一定的正相關(guān)性，即發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)，菌絲產(chǎn)量越大[5]。接種第2天時(shí)，木醋液濃度0.05%、0.1%菌絲生物量高于對(duì)照，木醋液濃度0.2%、0.4%菌絲生物量小于對(duì)照，而木醋液濃度0.6%、0.8%菌絲未萌發(fā)，培養(yǎng)基中僅見數(shù)個(gè)接種點(diǎn)。由此可見，與對(duì)照相比，較高濃度的木醋液（高于0.2%）對(duì)羊肚菌菌絲萌發(fā)及生長(zhǎng)有抑制作用。接種4 d、6 d、8 d時(shí)，木醋液濃度0.05%、0.1%、0.2%菌絲生物量均高于對(duì)照，而木醋液濃度0.4%、0.6%、0.8%菌絲生物量均少于對(duì)照，其中木醋液濃度為0.2%，在第4天、6天、8天菌絲生物量均為各處理中的最大值，培養(yǎng)第8天時(shí)，菌絲生物量比對(duì)照提高13.1%，說明木醋液濃度0.2%為試驗(yàn)最佳添加濃度。

圖1 培養(yǎng)基顏色對(duì)比

圖2 不同濃度木醋液培養(yǎng)基中羊肚菌菌絲生物量

2.3 培養(yǎng)液pH變化測(cè)定結(jié)果

分別對(duì)培養(yǎng)前培養(yǎng)基及培養(yǎng)8 d后的不含菌絲的培養(yǎng)基進(jìn)行pH測(cè)定。如圖3。培養(yǎng)前pH隨著木醋液濃度的增大而降低，原因是木醋液具有一定的酸性，濃度越大，培養(yǎng)基pH越低。劉偉指出，羊肚菌菌絲生長(zhǎng)的適宜pH為6.4～8.7，最適宜為7.7[6]。而當(dāng)木醋液濃度為0.4%、0.6%、0.8%時(shí)，pH均小于6.4，這可能是這三組羊肚菌菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)較差的主要原因。培養(yǎng)后各組中的pH較培養(yǎng)前pH均略有升高，但差異不顯著，可能是因?yàn)檠蚨蔷z在發(fā)酵過程中對(duì)木醋液中的酸性化學(xué)物質(zhì)分解利用，從而使酸性降低[5]。其中當(dāng)木醋液濃度為0.2%時(shí)，培養(yǎng)前后pH相差最大，可能是因?yàn)檠蚨蔷鷮?duì)木醋液中的酸性化學(xué)物質(zhì)利用最多，或許可以解釋為何該培養(yǎng)基羊肚菌菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好。

圖3 羊肚菌培養(yǎng)前后培養(yǎng)基pH變化

3 小 結(jié)

試驗(yàn)結(jié)果表明，在羊肚菌液體培養(yǎng)基中添加木醋液，對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)存在一定在影響。當(dāng)木醋液濃度為0.05%～0.2%時(shí)，對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，其中當(dāng)濃度達(dá)到0.2%時(shí)，菌絲萌發(fā)快，生長(zhǎng)狀態(tài)最好，生物量最高。當(dāng)木醋液濃度為0.4%～0.8%時(shí)，對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)具有抑制作用，結(jié)合培養(yǎng)前后的pH變化情況分析，可能是酸度過高，超過羊肚菌菌絲生長(zhǎng)的最適范圍的原因，其機(jī)理有待于進(jìn)一步試驗(yàn)研究。