孫厚靜 諶金吾* 閆 靜 王 杰 謝 永 王正文 姜發(fā)洋 吳鳳蓮

（1貴州省黔東南州農業(yè)科學院，貴州凱里556000；2杭州市農業(yè)科學研究院，浙江杭州310024）

灰樹花（Grifola frondosa）俗稱栗蘑、舞茸菇、蓮花菇等，又名貝葉多孔菌，屬于擔子菌亞門、層菌綱、非褶菌目，多孔菌科，樹花屬[1]?；覙浠ㄊ且环N珍貴的食藥用菌，其子實體香味濃郁，味道鮮美，口感極佳，富含灰樹花多糖、多種維生素和人體所需的必需氨基酸，具有降“三高”及增強人體免疫力的作用[2-3]。

近20年來，國內對于灰樹花的栽培技術、生態(tài)習性與營養(yǎng)物質提取等進行了大量的研究。張一帆等研究表明灰樹花栽培配方的碳氮比對灰樹花菌絲體的生長速度有顯著影響，菌絲體的生長速度隨栽培配方料碳氮比的上升而加快[4]。為探明灰樹花菌絲生長最佳C∶N，筆者進行不同碳氮比的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)灰樹花菌絲試驗，比較灰樹花菌絲生長狀況。現將試驗結果總結如下。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

灰1、灰江、灰山、慶灰151、慶灰152共計5個菌株，引自杭州市農業(yè)科學研究院蔬菜所菌種站。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 母種培養(yǎng)基

加富PDA:在1000 mL普通PDA培養(yǎng)基中加入蛋白胨10 g、MgSO41.5 g、KH2PO43 g、瓊脂 20 g[5]。

1.2.2 不同碳氮比的試驗培養(yǎng)基

配方①（C∶N=15∶1）:蔗糖 3.1000%，蛋白胨0.6667%，MgSO40.1500%，KH2PO40.3000%，瓊脂2.0000%，VB110 mg∕L，VB210 mg∕L；配方②（C∶N=20∶1）:蔗 糖 3.1000%，蛋 白 胨 0.5000%，MgSO40.1500%，KH2PO40.3000%，瓊 脂 2.0000%，VB110 mg∕L，VB210 mg∕L；配方③（C∶N=25∶1）:蔗糖3.1000%，蛋白胨0.4000%，MgSO40.1500%，KH2PO40.3000%，瓊脂2.0000%，VB110 mg∕L，VB210 mg∕L；配 方 ④（C∶N=30∶1）:蔗 糖 3.1000%，蛋 白 胨0.3333%，MgSO40.1500%，KH2PO40.3000%，瓊脂2.0000%，VB110 mg∕L，VB210 mg∕L；配方⑤（C∶N=35∶1）:蔗 糖 3.1000%，蛋 白 胨 0.2857%，MgSO40.1500%，KH2PO40.3000%，瓊 脂 2.0000%，VB110 mg∕L，VB210 mg∕L；配方⑥（C∶N=40∶1）:蔗糖3.1%，蛋白胨 0.2500%，MgSO40.1500%，KH2PO40.3000%，瓊脂2.0000%，VB110 mg∕L，VB210 mg∕L。

按以上配方配制好培養(yǎng)基后，放入高壓滅菌鍋中121℃滅菌0.5 h，降溫至60～70℃后，即可以在超凈工作臺上進行分裝平板，冷卻后接種。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株間的拮抗試驗

為檢驗5個灰樹花菌株是否存在同種異名的情況，進行了五個菌株拮抗試驗，把灰1、灰江、灰山、151、152兩兩組合，共計10組試驗，使用直徑為7 cm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)觀察。接種時過培養(yǎng)皿圓心畫一條直線為平板中心線，標記為Y軸，在Y軸兩側接入約黃豆粒大小兩塊試驗菌株菌塊，每個平板重復3次。然后放置25℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，觀察菌絲接觸區(qū)有無對峙反應。如果無條帶，表示兩菌株基因極相似或相同，種源關系近；如若有條帶則表示種源關系遠，為不同菌株。

1.3.2 菌絲長速、長勢試驗

將擴繁后的母種分別接種于相同的加富PDA固體培養(yǎng)基中，每個菌株5次重復。然后置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)（直到菌絲長滿平板）。每4 d測量一次菌絲長速，每天觀察長勢，并記錄。

1.3.3 不同碳氮比培養(yǎng)基培養(yǎng)試驗

供試培養(yǎng)基為1.2.2所述的6種培養(yǎng)基，加富PDA為對照組。將培養(yǎng)基分裝在9 cm的平板中，每個平板加入15～20 mL培養(yǎng)基。待其自然冷卻后，將供試菌株分別接種到不同碳氮比的固體培養(yǎng)基中。采用5 mm的打孔器打孔接種，將菌種塊盡量接種于平板正中心（圓心位置），每個試驗3組重復。然后置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。每4 d測量一次長速，每天觀察長勢，并記錄。

2 結果與分析

2.1 供試灰樹花菌株之間的拮抗

5個菌株拮抗培養(yǎng)結果見表1。由表1可見，5個受檢菌株之間均出現了拮抗反應，菌絲都不融合，除了灰1與151、灰1與152、151與152三組拮抗線不明顯以外，其余組合都有明顯拮抗線，菌絲接觸后都形成溝狀，沒有出現隆起。供試菌株菌絲相互接觸后長勢有強弱之分。5個供試灰樹花菌株中，灰1與慶灰151、慶灰152之間親緣關系較近?；?與灰山、灰江，慶灰151與灰山、灰江，慶灰152與灰山、灰江，灰山與灰江之間拮抗線明顯，親緣關系比較遠。

2.2 加富PDA培養(yǎng)基上供試灰樹花菌株菌絲生長勢、長速

5個供試菌株在25℃恒溫培養(yǎng)，其菌絲生長勢與生長速度見表2。由表2可見，灰山長勢最佳，菌絲呈白色，菌絲邊緣整齊，菌臺略厚，呈絨毛狀、乳白色?；?長速僅次于灰山，長勢與慶灰151、慶灰152相近，都較強，菌絲邊緣整齊，顏色邊緣為乳白色，菌臺較厚，呈淺綠色，絨毛狀。慶灰151與慶灰152長勢及長速都比較相近僅次于灰1，菌絲生長整齊，菌臺微厚，邊緣乳白色，接種塊附近淺綠色、絨毛狀?；医L勢最差，長速最慢，乳白色，菌臺厚，絨毛狀。

2.3 不同碳氮比培養(yǎng)基中供試灰樹花菌株菌絲長勢、長速

5個供試灰樹花菌株在供試培養(yǎng)基上菌絲長勢與長速見表3、圖1。由圖1可見，灰山的長勢、長速比其他菌株好、快，且與表2結果相符。碳氮比為30∶1的培養(yǎng)基上，供試灰樹花菌株菌絲生長都比較好，長勢最佳，長速最快。

表1 供試灰樹花菌株拮抗

表2 供試灰樹花菌株菌絲長速、長勢比較（加富PDA）

表3 不同碳氮比培養(yǎng)基上供試灰樹花菌株菌絲生長情況

圖1 供試灰樹花菌株在不同碳氮比培養(yǎng)基上菌絲生長情況

3 小 結

在加富PDA培養(yǎng)基上，供試5個灰樹花菌株中灰山長勢最佳，長速最快，灰1、慶灰151、慶灰152菌絲長勢與長速差異不大，而灰江菌絲長勢弱，長速最慢，顏色基本都呈邊緣乳白色，近接種塊淺綠色。在相同的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基碳氮比能夠影響菌絲生長，而本試驗能夠明確看出，碳氮比為30∶1時，供試灰樹花菌株菌絲長勢良好、生長快，與張一帆等灰樹花菌絲體的生長速度隨栽培料碳氮比上升而加快的結論相一致[4]。但是當氮源逐漸減少時，菌絲體的生長也會受到一定的限制。