方素芳　張宏英　黃明翔

【摘要】 目的：探討膠體金免疫層析法（LFA）檢測血清隱球菌多糖莢膜抗原（CrAg）在肺隱球菌病診斷中的應(yīng)用價(jià)值及其相關(guān)因素。方法：收集2017年3月-2018年3月在福建省福州肺科醫(yī)院就診的患者，診斷肺隱球菌病（PC）33例（A組），非PC30例（B組），均行LFA檢測血清CrAg，并對(duì)結(jié)果陽性患者行抗原半定量測定。結(jié)果：A組LFA陽性27例，B組LFA均為陰性，LFA檢測的敏感性為81.82%（27/33），特異性為100%（30/30），陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為100%和83.33%。LFA陽性率分別在臨床診斷分型為無癥狀、慢性、急性，三組患者陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004），三組半定量滴度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.085，P=0.030）;胸部影像分布為單側(cè)單發(fā)、單側(cè)多發(fā)、雙側(cè)多發(fā)，三組陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），單側(cè)、雙側(cè)多發(fā)組半定量滴度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.007，P=0.056）;胸部影像病灶為孤立結(jié)節(jié)或腫塊<2 cm，多發(fā)結(jié)節(jié)或腫塊≥2 cm，斑片實(shí)變浸潤影，混合病變，四組陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），后三組陽性檢出者抗原滴度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.050，P=0.152）。結(jié)論：LFA-CrAg對(duì)肺隱球菌病的診斷具有重要的臨床意義，其陽性率與臨床及影像學(xué)表現(xiàn)有關(guān)，其半定量滴度受到臨床表現(xiàn)的影響。

【關(guān)鍵詞】 隱球菌抗原; 膠體金免疫層析法; 肺隱球菌病; 診斷價(jià)值; 因素

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.21.001 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1674-6805（2019）21-000-04

Diagnostic Value and Related Factors of Serum CrAg Detected by LFA in Patients with Pulmonary Cryptococcal Disease/FANG Sufang，ZHANG Hongying，HUANG Mingxiang.//Chinese and Foreign Medical Research，2019，17（21）：-4

【Abstract】 Objective：To discuss the application and the relevant factors of using LFA to test Serum-CrAg in diagonizing pulmonary cryptococcosis.Method：Samples of patients who were treated from March 2017 to March 2018 in Fuzhou Lung Hospital in Fujian Province were collected.33 patients were diagonised Pulmonary Cryptococcosis （Group A），30 patients non-Pulmonary Cryptococcosis （Group B）.LFA was used to test their Serum CrAg.Semi-quantitative determination of antigen was given to those patients with Positive Result.Result：In group A，LFA was positive in 27 cases，and LFA in group B was negative.The suspectivity of LFA test was 81.82%（27/33） and its specificity was 100%（30/30）.The positive and negative predictive values were 100% and 83.33% respectively.The positive rate of LFA in clinical diagnosis was asymptomatic，chronic，acute，there was significant difference in the positive rate among the three groups（P=0.004），and there was significant difference in the semi-quantitative titer among the three groups（F=4.085，P=0.030）.The distribution of chest images was unilateral，multiple and bilateral，there was significant difference in the positive rate among the three groups（P<0.001）.There was no significant difference in the semi-quantitative titers between unilateral and bilateral multiple groups（t=2.007，P=0.056）.The chest imaging lesions were solitary nodules or masses<2 cm，multiple nodules or masses≥2 cm，spot consolidation infiltration，mixed lesions，there was significant difference in the positive rate among the four groups（P<0.001），but there was no significant difference in the antigen titer among the latter three groups （F=2.050，P=0.152）.Conclusion：LFA-CrAg is of clinical significance to the diagnosis of pulmonary cryptococcosis.Its positive rate is related to the clinical and imaging manifestations.Its semi-quantitative titer is affected by clinical manifestations.

【Key words】 Cryptococcal antigen; Lateral flow immunoehromatographieas say; Pulmonary cryptococcosis; Diagnostic value; Factor

First-authors address：Fujian Medical University Teaching Hospital，F(xiàn)uzhou 350008，China

近年，隨著隱球菌抗原檢測技術(shù)發(fā)展，隱球菌抗原一膠體金免疫層析法（cryptococcal antigen lateral flow immunoehromatographieas say，CrAg.LFA）已成為診斷隱球菌病的重要手段;但其在HIV抗體陰性PC患者及對(duì)其結(jié)果的影響因素相關(guān)研究報(bào)道較少。本研究應(yīng)用LFA檢測HIV抗體陰性PC患者的血清CrAg，探討其對(duì)PC的早期診斷價(jià)值及影響其結(jié)果的相關(guān)因素，具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年3月-2018年3月就診于福建省福州肺科醫(yī)院經(jīng)病理活檢、隱球菌莢膜多糖抗原等診斷明確PC患者33例為觀察組（A組）;并同期選擇臨床明確診斷的肺結(jié)核、肺癌及普通細(xì)菌性肺炎30例為對(duì)照組（B組）。排除標(biāo)準(zhǔn)：HIV感染或確診AIDS患者。PC組患者，男19例，女14例，年齡18～70歲，平均47.2歲。非PC患者，男17例，女13例，年齡20～75歲，平均51.4歲，其中肺結(jié)核、肺炎及普通細(xì)菌性肺炎分別為13、8、9例。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 試劑 隱球菌抗原檢測膠體金試劑由美國Immuno-Mycologies有限公司生產(chǎn)。

1.2.2 標(biāo)本采集 常規(guī)無菌操作抽取靜脈血約4 ml于無菌干燥采血管中，并于水平離心儀3 000 r/min離心 ，10? min后取血清。

1.2.3 標(biāo)本測定 將1滴樣本稀釋液加入到無菌試管中，加入40 μl血清樣本進(jìn)行混合，將隱球菌抗原檢測試紙條檢測端插入混合樣本液中，10 min后讀取結(jié)果。結(jié)果判讀：檢測條帶和對(duì)照條帶均出現(xiàn)為陽性;僅出現(xiàn)對(duì)照條帶為陰性;若對(duì)照條帶未出現(xiàn)，說明檢測無效，應(yīng)重新檢測。結(jié)果陽性則進(jìn)行半定量滴度檢測，向1號(hào)試管中加入4滴樣本稀釋液，分別向標(biāo)號(hào)2～10號(hào)的試管中加入2滴滴定液;將40 μl樣本加入1號(hào)試管并混勻。從1號(hào)試管中吸取80 μl樣本混合轉(zhuǎn)移到2號(hào)試管并混勻。依次進(jìn)行稀釋檢測，直到測量結(jié)果為陰性。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

觀察兩組LFA檢測血清CrAg定性情況，并對(duì)定性陽性患者行抗原半定量測定;通過兩組抗原定性情況統(tǒng)計(jì)分析其靈敏度、特異度及陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值。并觀察PC組LFA檢測CrAg的定性及半定量結(jié)果與其基礎(chǔ)疾病、臨床診斷分型及胸部CT影像表現(xiàn)進(jìn)行相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析[1]，判斷LFA檢測血清CrAg定性及半定量值對(duì)PC診斷價(jià)值及其影響因素。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件及Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以（x±s）表示，非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)表示，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示。組間比較采用Fish精確概率及Bonferroni法校正多重比較，對(duì)LFA半定量測定值通過幾何均數(shù)后再將其滴度倒數(shù)進(jìn)行常用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，并對(duì)轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行成組配對(duì)t檢驗(yàn)及單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PC組與非PC組血清LFA檢測情況比較

63例患者均行LFA檢測，33例PC患者其中經(jīng)支氣管鏡肺活檢術(shù)（TBLB）11例、行胸腔鏡手術(shù)6例、行CT引導(dǎo)下肺穿刺術(shù)16例，LFA檢測陽性27例;非PC組30例患者均為陰性。對(duì)27例陽性患者進(jìn)行半定量測定，其滴度為1∶5～1∶5 120;

LFA診斷PC的敏感度為81.82%（27/33），特異度為100%（30/30），陽性預(yù)測值100%，陰性預(yù)測值83.33%（30/36）。

2.2 PC組血清LFA檢查結(jié)果及其相關(guān)的因素

2.2.1 基礎(chǔ)疾病對(duì)PC組血清的LFA檢測結(jié)果的影響 33例PC患者有基礎(chǔ)疾病15例，其中腎移植術(shù)后1例，糖尿病4例，惡性腫瘤4例，腎病綜合征及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎各2例，支氣管擴(kuò)張伴陳舊性肺結(jié)核1例，慢性阻塞性肺部疾病1例，慢性乙型肝炎1例，高血壓病2例;無基礎(chǔ)疾病者18例。兩組患者LFA陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.185）;有無基礎(chǔ)疾病組患者半定量幾何均數(shù)分別為1∶76.1、1∶116.2，兩者陽性檢出者抗原滴度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.597，P=0.556），見表1及圖1。

2.2.2 臨床診斷類型對(duì)PC組血的LFA檢測結(jié)果影響 33例均為單純PC患者，其中體檢時(shí)發(fā)現(xiàn)肺部陰影9例（27.3%）;臨床癥狀24例（72.7%），其中咳嗽23例，咳痰21例，氣喘7例，胸痛2例，發(fā)熱2例，乏力1例。急性確診、慢性確診與無癥狀確診三組患者陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004），其中慢性組檢出率顯著高于無癥狀組，Bonferroni法校正P=0.029。三組半定量滴度的幾何均數(shù)分別為1∶353.3、1∶45.6、1∶160.0，其平均水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.085，P=0.030）;使用Bonferroni法進(jìn)行多重比較，急性組滴度與慢性組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.032），見表2及圖2。

2.2.3 胸部CT影像學(xué)表現(xiàn)對(duì)PC組血清的LFA檢測結(jié)果的影響 根據(jù)胸部CT病灶分布分為單側(cè)單發(fā)、單側(cè)多發(fā)、雙側(cè)多發(fā)，三組陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）;各組間兩兩比較使用Bonferroni法校正，顯示雙側(cè)多發(fā)組陽性率高于單側(cè)單發(fā)組（P<0.001），單側(cè)多發(fā)組陽性率高于單側(cè)單發(fā)組（P=0.008）。LFA半定量滴度單側(cè)單發(fā)者僅1例為1∶5，而單側(cè)、雙側(cè)多發(fā)組半定量滴定的幾何均數(shù)分別為1∶31.7、1∶149.3，兩組滴度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.007，P=0.056），見表3、圖3。按胸部影像特點(diǎn)分為肺部孤立結(jié)節(jié)或腫塊<2 cm（即單側(cè)單發(fā)者），多發(fā)或結(jié)節(jié)、腫塊≥2 cm，斑片實(shí)變浸潤影，混合病變，四組陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）;各組間兩兩比較使用Bonferroni法校正，結(jié)果顯示多發(fā)組、斑片組與混合組陽性檢出率均高于孤立組（P<0.001、P=0.015、P=0.001）。其后三者LFA半定量滴度幾何均數(shù)分別為1∶58.4、1∶367.6、1∶105.6，三組陽性檢出者抗原滴度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.050，P=0.152），見表3、圖4。

其伴隨影像表現(xiàn)：伴隨空洞征8例、支氣管充氣征5例、磨玻璃影5例、胸腔積液1例、縱隔淋巴結(jié)腫大1例的患者，其血清LFA檢測均為陽性。由于病例數(shù)較少及分散未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 討論

肺隱球菌病是由隱球菌感染引起的一種急性、亞急性或慢性的呼吸系統(tǒng)真菌病。隱球菌侵襲機(jī)體感染后，其菌體的莢膜多糖抗原釋放入血，通過乳膠凝集試驗(yàn)（CrAg-latex）、膠體金免疫層析法（LFA）檢測莢膜多糖抗原是隱球菌病診斷的首選方法[2]。但因LFA檢測不需要對(duì)樣品進(jìn)行修飾、對(duì)各種隱球菌亞種血清型的高敏感度特異度、設(shè)備要求低、快速、低成本等因素[3]，近年LFA在臨床上得到廣泛的應(yīng)用，據(jù)國內(nèi)外報(bào)道針對(duì)HIV感染或免疫受損為主的隱球性腦膜炎或隱球菌敗血癥患者，其LFA檢測的特異度達(dá)95.0%～99.1%、靈敏度達(dá)95%～99.3%[4-6]。

但對(duì)非HIV的PC患者報(bào)告，靈敏度則較前降低，Kohno等[7]研究顯示157例患者其LFA檢測靈敏度為78.8%;國內(nèi)學(xué)者李小華等[8]及胡群等[9]通過兔肺隱球菌感染模型及非HIV的PC研究顯示其血清LFA敏感度為80.0%～89.4%，特異度均為100%;黃佳斯等[10]從547例患者血清LFA檢測其靈敏度為80.0%;特異性為99.4%，陽性預(yù)測值為72.7%和陰性預(yù)測值為99.6%。本研究顯示在非HIV感染的患者其血清CrAg的LFA測定的敏感性為81.82%，特異性為100%，陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為100%和83.33%，與前面報(bào)道是相一致的;比LFA在感染HIV的隱球菌病患者的檢測在特異度相當(dāng)，而其靈敏度偏低;分析考慮與患有HIV感染或機(jī)體免疫受損患者免疫狀態(tài)較差，隱球菌感染后患者病情較重及病灶較廣泛所致抗原入血較快較多，以致檢測陽性率更高的可能。

LFA檢測結(jié)果是否與機(jī)體基礎(chǔ)疾病、臨床表現(xiàn)、影像學(xué)變化等相關(guān)，目前研究較少。McKenney及Souleymane等[11-12]報(bào)道在HIV感染的人群中其CD4計(jì)數(shù)與LFA陽性率有關(guān)。國內(nèi)王麗芳等[13]曾報(bào)告LA檢測隱球菌抗原在重癥及累及2個(gè)以上臟器者的陽性率高，其半定量的滴度與肺部病灶范圍和疾病嚴(yán)重程度有相關(guān)性。并結(jié)合Anupop等[14]報(bào)道LFA與LA檢測比較，顯示其一致性及其滴度值有相關(guān)性;所以，綜合分析LFA檢測血清-CrAg其結(jié)果可能受到類似因素的影響。

從本研究發(fā)現(xiàn)患有糖尿病、惡性腫瘤、器官移植、長期使用免疫抑制劑等患者與無基礎(chǔ)疾病患者在LFA陽性率及半定量抗原測定值方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），支持Kohno等[7]報(bào)告的PC患者LFA抗原檢測結(jié)果與有無基礎(chǔ)疾病無關(guān);對(duì)于急性確診、慢性確診、無癥狀PC患者LFA陽性率及半定量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示臨床表現(xiàn)對(duì)于LFA陽性及其半定量值是有影響的;其中急性確診比慢性確診在兩者檢測結(jié)果方面影響更顯著。也支持了病情較重的患者其抗原檢測陽性率及半定量滴度更高的可能。

從影像學(xué)病變累及范圍及影像特點(diǎn)是否與LFA結(jié)果陽性及半定量分析來看，發(fā)現(xiàn)病灶分布為單側(cè)多發(fā)、雙側(cè)多發(fā)及特點(diǎn)為多發(fā)或結(jié)節(jié)、腫塊≥2 cm，斑片實(shí)變浸潤影，混合病變陽性檢出率及半定量滴定值均顯著高于單側(cè)孤立的病灶為14.28%的陽性率及1∶5半定量值;而其他組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。并其伴隨空洞、支氣管充氣征、磨玻璃影、胸腔積液、縱隔淋巴結(jié)腫大特點(diǎn)的患者，其血清LFA檢測均為陽性，考慮此類患者的臨床表現(xiàn)一般較重或病情較急需。從影像結(jié)果分析支持Baddley等[15]及Pappas等[16]曾報(bào)道PC病灶局限的患者血清中通常難以檢測到隱球菌抗原，存在敏感性不足的，可能是隱球菌在肺部局限性浸潤生長，隱球菌抗原較難釋放人血有關(guān)，而病灶多或累及較廣的患者，其隱球菌抗原釋放入血較快較多;所以，肺部病灶表現(xiàn)與其釋放入血的隱球菌莢膜抗原量有關(guān)。

本研究從臨床癥狀、影像學(xué)表現(xiàn)與傅順金等[17]報(bào)道PC患者中其血隱球菌莢膜多糖抗原檢測陽性占63.46%，而其中咳嗽咳痰占75.00%，影像表現(xiàn)為浸潤實(shí)變者占79.17%，結(jié)節(jié)或腫塊型者僅占41.00%相符。分析患者的咳嗽、咳痰、氣急、發(fā)熱等癥狀及影像的多發(fā)、斑片實(shí)變影、空洞等，其存在其機(jī)體細(xì)菌負(fù)荷量更大、細(xì)菌菌壁多糖莢膜抗原更易釋放入血及入血量更多可能，以致LFA檢測陽性率及半定量測定值更高[18]。

綜上所述，具有快速、方便、對(duì)設(shè)備要求低的LFA檢測方法因其高特異性、對(duì)臨床表現(xiàn)或肺部多發(fā)病灶的PC患者的高靈敏度等特點(diǎn)，以及有報(bào)道實(shí)現(xiàn)未梢血的床旁快速檢測的開展，其無疑成為PC患者的臨床上最重要最早的檢測方法;并且其陽性結(jié)果以及半定量滴定與病情輕重存在相關(guān)性，對(duì)臨床有一定指導(dǎo)意義。本文對(duì)探索LFA檢測其結(jié)果涉及的相關(guān)因素上存在病例數(shù)較少，今后將擴(kuò)大樣本量繼續(xù)其相關(guān)性的研究。

參考文獻(xiàn)

[1]曾能永，徐云歡，孔晉亮.肺隱球菌病診治進(jìn)展[J].國際呼吸雜志，2016，36（3）：218-223.

[2] World Health Organization.Rapid advice on the diagnosis，prevention and management of cryptococcal disease in Hiv-infected adults，adolesents and children[EB].2011，Geneva：WHO.

[3] Vidal J E，Boulware D R.Lateral flow assay for cryptococcal antigen：An important advance to improve the cintinuum of hiv care and reduce cryptococcalmeningitts-related mortality[J].Rev Inst Med Trop Sao Paulo，2015，57（Suppl 19）：38-45.

[4] Huang H R，F(xiàn)ang L C，Rajbanshi B，et al.Evaluation of a new cryptococcal antigen lateral flow immunoassay in serum，cerebrospinal fluid and urine for the diagnosis of cryptococcsis：A meta-analysis and systematic review[J].PLOS One，2015，10（5）：e0127117.

[5]季淑娟，倪玲紅，張俊麗，等.不同莢膜抗原檢測方法對(duì)隱球菌腦膜腦炎診斷和療效評(píng)估的價(jià)值[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2015，95（46）：3733-3736.

[6]浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì).肺隱球菌病診治浙江省專家共識(shí)[J].中華臨床感染病志，2017，10（5）：321-326.

[7] Kohno S，Kakeya H，Izumikawak K，et al.Clinical features of pulmonany cryptococcosis in no-HIV patients in Japan[J].Infect Chemother，2015，21（1）：23-30.

[8]李小華，賴國祥，許昌聲，等.兔肺隱球菌感染模型制作及莢膜多糖膠體金免疫層析法的診斷價(jià)值[J].國際呼吸雜志，2018，38（10）：725-730.

[9]胡群，徐禮裕，張雷，等.血膠體金免疫層析法對(duì)非人免疫缺陷病毒感染的肺隱球菌病患者的診斷價(jià)值[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2018，41（8）：651-653.

[10]黃佳斯，石磊，唐愛國，等.膠體金免疫層析法檢測血清隱球菌抗原在肺隱球菌病診斷中的應(yīng)用價(jià)值[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2017，35（7）：518-519.

[11] McKenney J，Bauman S，Neary B，et al.Prevalence，Correlates，and Outcomes of Cryptococcal Antigen Positivity Among Patients With AIDS，United States，1986-2012[J].Clin Infect Dis，2015，60（6）：959-965.

[12] Souleymane S，Boniface M，Anne P，et al.Estimated Prevalence of Cryptococcus Antigenemia（CrAg） among HIV-Infected Adults with Advanced Immunosuppression in Namibia Justifies Routine Screening and Preemptive Treatment[J].PLoS One，2016，11（10）：e0161830.

[13]王麗芳，施毅，丁媛，等.65例肺隱球菌病回顧分析[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2014，37（10）：764-768.

[14] Anupop J，Anil A.Panackal Peter R.Williamson etal.Performance of the Cryptococcal Antigen Lateral Flow Assay in Non-HIV-Related Cryptococcosis[J].Clin Microbiol，2016，54（2）：460-463.

[15] Baddley J W，Perfect J R，Oster R A，et al.PulmonarycrptococcosisinpatientswithoutHIV infection：factor eyrycryptococcosisin patientswithoutHIVinfection：factorsassociatedwithdisseminated disease[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2008，27（10）：937-943.

[16] Pappas P G，Perfect J R，Cloud G A，et al.Cryptococcosis in human imnlunodeficiency virus-negative patients in the era of effective azole therapy[J].Clin Infect Dis，2001，33（5）：690-699.

[17]傅順金，許攀峰，周華，等.52例肺隱球菌病的臨床及影像特點(diǎn)與隱球菌莢膜抗原檢測結(jié)果的關(guān)系[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2018，28（22）：3397-3400，3409.

[18] Admasu T M，Ethan B，Obsie T.Point-of-Care Testing for Cryptococcal Disease among Hospitalized Human Immunodeficiency virus-Infected Adults in Ethiopia[J].Am J Trop Med Hyg，2016，95（4）：786-792.

（收稿日期：2019-06-12） （本文編輯：馬竹君）