王俊偉 楊學(xué)財(cái) 李 瑋 李一穎 侯志軍 胡寧寧 宋 凱

唇腭裂是常見的先天性發(fā)育畸形，在我國發(fā)病率約為1.82/1000，在先天畸形的發(fā)生率中排第三位[1]。按照其是否伴有其他系統(tǒng)、器官畸形分為綜合征性唇腭裂和非綜合征性唇腭裂（non-syndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P）。唇腭裂的發(fā)生影響患者的發(fā)音、聽力、面部的發(fā)育，而且治療周期長、難度大、費(fèi)用高，給患者和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。因此對唇腭裂發(fā)病原因的研究就顯得格外重要。

外泌體是一種能被大多數(shù)細(xì)胞分泌的微小膜泡，具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，直徑大約30～100nm，內(nèi)部含有細(xì)胞特異的蛋白、脂質(zhì)和核酸，能作為信號分子傳遞給其他細(xì)胞從而改變其他細(xì)胞的功能，在很多生理、病理過程中起著重要的作用[2]。其中miRNA作為一種非編碼單鏈RNA 分子，廣泛參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖分化，并與腺體發(fā)育、腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移以及頜面部發(fā)育異常息息相關(guān)[3～6]。Li 等[7]通過提取皮膚組織中的miRNA 進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)miRNA 與NSCL/P易感性密切相關(guān)。Zou 等[8]通過分析NSCL/P 患者血漿來源的miRNA 的表達(dá)框架發(fā)現(xiàn)血漿中的某些miRNA 較對照組高表達(dá)，其可能作為一組診斷唇腭裂的標(biāo)記物。目前對于miRNA 的研究多為血漿總RNA，而血漿外泌體中miRNA 的純度更高，對結(jié)果的干擾更小，因此更適合作為目標(biāo)分子進(jìn)行研究。已知的研究證實(shí) miRNA 在 PDGF、TGF-β、BMP、wnt、SHH 等重要信號通路之中均發(fā)揮重要作用[9～12]，能夠介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的基因信息交流[13]。因此鑒定miRNA 分子對于理解NSCL/P 的調(diào)節(jié)機(jī)制是非常重要的，然而，NSCL/P 血漿外泌體源miRNA 的表達(dá)譜仍然很少被研究，同時，我們的另一項(xiàng)研究（未發(fā)表結(jié)果）表明，外周血血漿外泌體的濃度在患者和健康人之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此，本實(shí)驗(yàn)將研究方向放在外泌體內(nèi)部miRNA 的差異性表達(dá)，通過對NSCL/P患者和正常兒童外周血外泌體內(nèi)部miRNA 進(jìn)行分離提取，對miRNA 進(jìn)行測序來分析差異表達(dá)的血漿外泌體源miRNA，并對miRNA 的靶基因進(jìn)行Go 和KEGG 通路富集分析。

資料和方法

1.研究對象的選擇及血漿樣本收集：隨機(jī)選擇青島大學(xué)附屬醫(yī)院2016年～2018年典型病例作為研究對象：8 例NSCL/P 患者的外周血取自于青島大學(xué)附屬醫(yī)院口腔頜面外科手術(shù)患者（A 組），8 例正常兒童外周血取自于青島大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科新生兒（B 組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：NSCL/P 患者和健康兒童的年齡均在2～12 個月之間；患者經(jīng)臨床全面檢查及醫(yī)生確診，不合并其它先天性疾病或先天性畸形以及其它重要臟器疾病，無唇腭裂家族史；正常兒童符合新生兒健康標(biāo)準(zhǔn)，無全身遺傳性疾病，無家族遺傳性疾病史，在性別和出生地區(qū)與病例組匹配。研究方案經(jīng)青島大學(xué)機(jī)構(gòu)審查委員會批準(zhǔn)，與患者父母簽訂書面知情同意書后，進(jìn)行外周血樣品采集。將外周血收集到EDTAK2 管中，然后立即離心獲取等份的上清液（血漿）儲存在-80℃冰箱。

2.血漿中外泌體的分離提取：采用QIAGEN exoEasyMaxiKit 試劑盒，通過使用超濾法分離提取血漿中的外泌體[14，15]。將血漿過濾去掉大于0.8μm的顆粒；加入與樣本等體積的XBP 緩沖液混勻，并讓溶液升至室溫后加入16ml 的Sample/XBP 的混合物到exoEasy 離心柱中并500×g 離心1min，棄流出液并將離心柱放回收集管中；向離心柱中加入10mlXWP 并 5000×g 離心 5min 去除殘余的緩沖液，棄流出液，并將離心柱從收集管中取出，將離心柱放入一個新的收集管中并加入400μlXE 緩沖液到膜上并孵育1min，500×g 離心5min 收集洗脫液；將洗脫液重新吸出加回離心柱中，孵育1min，5000×g 離心5min 洗脫外泌體到一個新的離心管中。

3.外泌體鑒定—電鏡觀察：吸取外泌體樣品10μl 加于200 目銅網(wǎng)上沉淀10min，濾紙吸去浮液；將醋酸雙氧鈾10μl 滴加于銅網(wǎng)上沉淀1min，濾紙吸去浮液，常溫干燥數(shù)分鐘，上機(jī)，80kv 成像。

4.外泌體表面標(biāo)記物檢測：采用Automated Capillary Western Blot（WES）對外泌體表面蛋白TSG01、CD81 進(jìn)行鑒定。

5.血漿外泌體蛋白BCA 法定量：配制工作液、標(biāo)準(zhǔn)品及待測外泌體樣品，利用BCA 定量法對外泌體蛋白進(jìn)行測定，計(jì)算出外泌體樣本的濃度。

6.外泌體源miRNA 抽提與質(zhì)量檢測：吸取等量外泌體樣品加Trizol，室溫放置5min，以12000rpm離心10min，棄沉淀，按200ul 氯仿/mlTrizol 加入氯仿，混勻后冰上放置5min。以4℃12000xg 離心15min，吸取上層水相至另一離心管中，按0.5ml 異丙醇/mlTrizol 加入異丙醇混勻，冰浴放置10min。以4℃12000xg 離心 10min，棄上清，RNA 沉于管底，按1ml75%乙醇/mlTrizol 加入75%乙醇懸浮沉淀。以4℃8000xg 離心 5min，棄上清，室溫晾干 10min，以30ulDEPC 處理水溶解RNA 樣品。使用Agilent2100測定 miRNA 在分光光度計(jì) 260、280 和 230nm 的吸光度值，以計(jì)算濃度并評估純度。

7.miRNA 測序分析：使用Agilent2100 miRNA微陣列芯片對16 個外泌體miRNA 分別進(jìn)行分析，其中包括8 個非綜合征性唇腭裂血漿樣品和8 個正常血漿樣品。使用GeneSpring 軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)分析，篩選顯示出兩倍或更大變化的差異表達(dá)的miRNA。

8.GO和 KEGG通路富集分析：使用TARGETMINER，miRDB，microRNA，TarBase 數(shù)據(jù)庫中的至少兩個同時進(jìn)一步分析差異表達(dá)的miRNA 的預(yù)測靶基因，并對差異表達(dá)的miRNA 的預(yù)測靶標(biāo)進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析。靶基因的KEGG 和GO 分析采用R 軟件的超幾何分布檢驗(yàn)，P 值經(jīng)Benjamini ＆ Hochberg 多重檢驗(yàn)糾正。

結(jié) 果

1.血漿中外泌體的鑒定：本研究成功從16 例血漿樣本中分離外泌體，各組獲得的外泌體沉淀量無明顯差異，并在透射電鏡下觀察到30～100nm 大小不一的囊泡狀結(jié)構(gòu)，符合外泌體的電鏡表現(xiàn)，且可觀察到其典型的茶托狀形態(tài)（圖1）。

2.Automated Capillary Western Blot 結(jié)果：檢測外泌體標(biāo)記蛋白TGS101、CD81 的表達(dá)情況，見圖2，非綜合征性唇腭裂患者和正常對照者的血漿外泌體中均表達(dá)TSG101 和CD81。

圖1 透射電鏡下外泌體形態(tài)

圖2 外泌體WES 膠圖

3.外泌體濃度檢測及外泌體miRNA 質(zhì)量檢測：使用Agilent2100 檢測個樣品中的外泌體濃度并進(jìn)行組間比較，未發(fā)現(xiàn)差異（P＜0.05），如表1所示。在上機(jī)測序前用Agilent 2100 進(jìn)行文庫質(zhì)控，圖3為電泳圖，五個樣本均有smear 條帶，可以進(jìn)行后續(xù)測序流程。

表1 外泌體濃度

圖3 miRNA Agilent2100 電泳圖

4.miRNA 測序結(jié)果：利用T-test 分析A 組與B組兩樣本間顯著差異表基因后，以log2（FoldChange） 為橫坐標(biāo)，以 T-test 顯著性檢驗(yàn)p-Value 的負(fù)對數(shù) -log10（p-Value）為縱坐標(biāo)，得出火山圖（圖4），圖中彩色點(diǎn)表示篩選出的相應(yīng)基因；并對差異表達(dá)miRNA 進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類（圖5）：經(jīng)過篩選A 組與B 組出現(xiàn)差異表達(dá)的miRNA 共18條，P值均＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，A 組較 B 組表達(dá)上調(diào)的14 條，表達(dá)下調(diào)的4 條。

5.失調(diào)的miRNA 的潛在靶基因的功能分析：我們對NSCL/P 患者外周血外泌體中差異表達(dá)的miRNA 的預(yù)測靶標(biāo)進(jìn)行了GO 和KEGG 通路富集分析，包括 14 種上調(diào)的 miRNA 和 4 種下調(diào)的miRNA，共產(chǎn)生6747 種可能的靶基因。富集的GO術(shù)語在圖中列出（圖6），其靶基因功能富集于多細(xì)胞生物發(fā)育、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)結(jié)合及外泌體等30 個生物學(xué)過程。異常表達(dá)的miRNA 靶基因通過KEGG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路富集分析，其靶基因信號通路富集于賴氨酸降解、Wnt 信號傳導(dǎo)、MAPK信號傳導(dǎo)、TGF-β 信號傳導(dǎo)及鈣信號傳導(dǎo)等304個信號通路（圖7）。

圖4 實(shí)驗(yàn)組與對照組miRNA 差異表達(dá)（火山圖）

圖5 差異miRNAheatmap圖

圖6 GO 富集TOP30 條目圖

圖7 KEGG 富集TOP20 氣泡圖

討 論

外泌體是包含核酸和蛋白質(zhì)的囊性小泡，特異性膜結(jié)構(gòu)及其內(nèi)部多種遺傳物質(zhì)廣泛參與、調(diào)控Wnt/β-catenin 信號及TGF-β 信號通路的表達(dá)。Hopper 等[19]研究發(fā)現(xiàn)Wnt 信號通路的組成成分通過外泌體這一載體作用于遠(yuǎn)處細(xì)胞，同時外泌體可通過TGFβ1 和Smad 信號通路介入腭中嵴上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸，從而影響腭裂的發(fā)生[9，20～22]。外泌體內(nèi)部含有 mRNA、miRNA 等信號分子，miRNA 是一類具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA 分子，通過堿基互補(bǔ)配對識別靶基因，參與基因的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。研究差異表達(dá)的血漿外泌體源miRNA 在NSCL/P 患者中的表達(dá)譜將進(jìn)一步提高我們對這種疾病的認(rèn)識、診斷和管理。在NSCL/P 患者組織中miRNA 差異表達(dá)的研究中，蘇艷國[23]、李曼達(dá)[12]及王鑫[10]通過提取結(jié)締組織中的miRNA 進(jìn)行芯片雜交研究發(fā)現(xiàn)254 條表達(dá)差異，均采用4 例病例樣本與4 例正常樣本，并在實(shí)驗(yàn)中得以驗(yàn)證。另外研究人員發(fā)現(xiàn)組織中的總miRNAs 表達(dá)水平高于血漿來源的外泌體，此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)了在外泌體內(nèi)選擇性富集的miRNAs[24]。這些結(jié)果表明，由于miRNA 的差異變化，外泌體miRNA 的測量不能被組織中miRNA 的測量所代替，反之亦然。綜上此次研究使用miRNA測序分析來評估NSCL/P 患者血漿樣本中外泌體源miRNA 與健康兒童的差異表達(dá)，實(shí)驗(yàn)中采用8 例病例樣本與8 例正常樣本對比完成。

從圖6及圖7可以看出這差異的miRNA 靶基因涉及大量的信號通路，反映了唇腭裂基因調(diào)控的復(fù)雜性，同時也反映出唇腭裂的發(fā)生時多基因的變異造成的。同時我們還發(fā)現(xiàn)圖中一些miRNA 的條數(shù)雖少，但其差異表達(dá)的倍數(shù)卻很高，最具代表性的為miRNA-133a-3p，是Wnt 通路重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，上調(diào)達(dá)到182 倍，基于Hopper[19]的研究推測miRNA-133a-3p 的高表達(dá)對Wnt 通路起到抑制作用，導(dǎo)致WNT 相關(guān)基因的缺乏，使細(xì)胞的定向遷移消失，協(xié)同其他上調(diào)miRNA 最終導(dǎo)致唇腭裂的發(fā)生。同時，Vincenzo[25]等通過對NSCL/P 患者的唾液中外泌體的研究發(fā)現(xiàn)miR-150、miR-128 在唇腭裂的發(fā)生中發(fā)生了重要作用，這兩種miRNA 在本研究中也得到了驗(yàn)證。

基于GO 分析，NSCL/P 患者血漿外泌體中上調(diào)和下調(diào)的miRNA 的預(yù)測靶基因主要參與多細(xì)胞生物發(fā)育、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)結(jié)合及外泌體的分泌等。通過KEGG 富集分析，檢查前20 個富集通路顯示，靶基因與多種通路相關(guān)，包括維生素的代謝通路[26]、轉(zhuǎn)化生長因子（TGFs）[27]、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）[28]、WNTs 基因家族[29]以及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）[30]，既往研究結(jié)果表明這些通路均參與NSCL/P 的發(fā)生。

NSCL/P 的發(fā)病受到多種因子的調(diào)控，miRNA作為新發(fā)現(xiàn)的基因調(diào)節(jié)小分子，在個體發(fā)育及生理病理過程中發(fā)揮重要作用，其在疾病篩查和防治等方面的研究越來越多的受到關(guān)注[31]。目前，唇腭裂領(lǐng)域關(guān)于miRNA 的研究尚少，僅個別miRNA 的作用已明確，對于人體組織中血漿外泌體源miRNA 在腭裂或唇腭裂的發(fā)病機(jī)制中的作用，特別是在唇、腭的發(fā)育及顱面結(jié)構(gòu)的影響，需要進(jìn)一步探索。

通過miRNA 測序分析，我們發(fā)現(xiàn)NSCL/P 患者與健康兒童相比，外周血血漿外泌體內(nèi)部的存在差異表達(dá)的miRNA，使用GO 和KEGG 通路富集分析，我們發(fā)現(xiàn)了外泌體源miRNA 參與的諸多生物過程及信號傳導(dǎo)通路，其可能作為新的NSCL/P 的篩查和防治靶點(diǎn)，進(jìn)一步研究潛在靶基因的機(jī)制，為未來的唇腭裂臨床預(yù)防和治療提供新的途徑。