孔程祥　王飛玲　李莉　金萍　吳麗娟　謝紅波

【摘要】 目的：分析兒童重癥肺炎鏈球菌肺炎的感染狀況、血清學(xué)分型及耐藥現(xiàn)狀，為預(yù)防和控制肺炎鏈球菌感染提供依據(jù)。方法：回顧性分析2013年6月-2018年6月筆者所在醫(yī)院PICU收治的重癥肺炎鏈球菌肺炎患兒的臨床資料，進(jìn)行病原菌培養(yǎng)及藥敏試驗，并采用多重PCR對肺炎鏈球菌血清型體系進(jìn)行檢測。結(jié)果：共分離出肺炎鏈球菌86株（28.86%），位居首位;對抗菌藥物的耐藥率總體呈上升趨勢，對紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明均有較高的耐藥性，多數(shù)肺炎鏈球菌對青霉素類、頭孢類藥物敏感，對萬古霉素、利奈唑胺的耐藥率為0，未發(fā)現(xiàn)對喹諾酮類藥物耐藥;血清學(xué)分型檢測以19F（29.07%）、23F（15.12%）、6型（15.12%）和19A（11.63%）為主。結(jié)論：肺炎鏈球菌仍是本地區(qū)兒童重癥肺炎的主要病原菌，耐藥問題日益顯著，應(yīng)正確合理使用抗生素，有效提高兒童重癥肺炎的救治成功率。

【關(guān)鍵詞】 兒童; 重癥肺炎; 肺炎鏈球菌; 耐藥性; 血清型

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.20.021 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 B 文章編號 1674-6805（2019）20-00-03

Study on Infection Status，Drug Resistance and Serotype of Severe Streptococcus Pneumoniae Pneumonia in Children/KONG Chengxiang，WANG Feiling，LI Li，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2019，17（20）：-52

【Abstract】 Objective：To analyze the infection status，serological classification and drug resistance of severe Streptococcus pneumoniae infection in children，so as to provide evidence for the prevention and control of Streptococcus pneumoniae infection.Method：The clinical data of children with severe Streptococcus pneumoniae admitted to PICU from June 2013 to June 2018 were analyzed retrospectively.The pathogen culture and drug sensitivity test were carried out，and the serotype system of Streptococcus pneumoniae was detected by multiplex PCR.Result：A total of 86 strains（28.86%） of streptococcus pneumoniae was isolated，ranking the first.The drug resistance rate of antibiotics was on the rise，and erythromycin，clindamycin，tetracycline and SMZ were all highly resistant.Most streptococcus pneumoniae were sensitive to penicillin and cephalosporins，while vancomycin linezolid and quinolones had no resistance.Serotype was mainly composed of 19F（29.07%），23F（15.12%），type 6（15.12%），and 19A（11.63%）.Conclusion：Streptococcus pneumoniae is still the main pathogen of severe pneumonia in children in our region，and drug resistance is becoming increasingly significant.Therefore，antibiotics should be used correctly and rationally to effectively improve the success rate of treatment for severe pneumonia in children.

【Key words】 Children; Severe pneumonia; Streptococcus pneumoniae; Drug resistance; Serological typing

First-authors address：Shenzhen Baoan Maternal and Child Health Hospital，Shenzhen 518106，China

社區(qū)獲得性肺炎（community acquired pneumonia，CAP）是全球5歲以下兒童死亡的重要原因，細(xì)菌感染是主要原因之一，據(jù)統(tǒng)計，肺炎鏈球菌（streptococcus pneumoniae，SP）是引起CAP的主要細(xì)菌。本文通過總結(jié)筆者所在醫(yī)院不同時期兒童重癥肺炎鏈球菌肺炎的感染狀況、細(xì)菌血清型，并分析其對抗菌藥物的耐藥性，為兒童重癥肺炎鏈球菌肺炎得到有效預(yù)防和治療，并減少多重耐藥菌株的產(chǎn)生提供有力依據(jù)，具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以2013年6月-2018年6月在筆者所在醫(yī)院PICU住院治療的469例兒童重癥肺炎患者為研究對象，所有患者均符合小兒重癥肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。其中男320例，女149例，0～1歲339例，1～3歲93例，3～7歲34例，7歲以上3例。所有菌株均為連續(xù)分離的非重復(fù)株，同一患兒只取其第一次分離的菌株。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集和送檢 所有重癥肺炎患兒的痰（或肺泡灌洗液）標(biāo)本均在患兒入住PICU并確診為重癥肺炎時采集。痰液標(biāo)本采集前均給予清潔口腔后誘導(dǎo)吸痰，肺泡灌洗液的取材均為經(jīng)消毒過的纖維支氣管鏡在無菌操作下取得，所有標(biāo)本均裝入無菌痰標(biāo)本杯內(nèi)中密封送檢。

1.2.2 菌株的分離培養(yǎng)和鑒定 將采集的標(biāo)本分別接種于哥倫比亞血瓊脂平板、嗜血巧克力平板和麥康凱平板上，放于35 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。對可疑肺炎鏈球菌菌落采用手工法奧普托欣試驗或質(zhì)譜儀MALDI-TOF Biotyper（德國bruker公司）進(jìn)行細(xì)菌鑒定。具體操作流程按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》執(zhí)行。

1.2.3 藥敏試驗 肺炎鏈球菌采用Kirby-Bauer（K-B）法紙片擴(kuò)散法對青霉素、頭孢曲松、萬古霉素、四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星和復(fù)方新諾明等抗菌藥物（英國OXOID公司產(chǎn)品）進(jìn)行體外藥敏試驗，藥敏平板選用M-H血瓊脂平板（溫州市康泰生物科技有限公司產(chǎn)品），操作和結(jié)果判讀依據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會（clinical and laboratory standards institute，CLSI）每年更新的抗菌藥物敏感性標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 血清學(xué)分型 采用多重PCR對SP血清型進(jìn)行檢測，將凍存的SP菌種復(fù)蘇轉(zhuǎn)至哥倫比亞血平板（廣州迪景），置35 ℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)24 h，獲得新鮮SP菌落。按以下步驟進(jìn)行檢測：（1）引物設(shè)計。參照文獻(xiàn)[2]對PCR引物，包括SP莢膜多糖基因的保守序列cpsA，血清型4、6、9V、14、18、19A、19F、23F特異性引物，由Invitrogen公司合成。（2）DNA提取和PCR擴(kuò)增。將新鮮純SP菌落刮入1 ml生理鹽水，按Axygen細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒（柱提取法）步驟提取模板DNA。PCR反應(yīng)體系為ExTaqDNA聚合酶0.1 μl，10×ExTaq buffer 2 μl，模板DNA 2 μl，dNTPs 1.6 μl，9種混合引物（每種引物200 μm）

0.75 μl，重蒸水補(bǔ)足至20 μl。循環(huán)參數(shù)：94 ℃ 15 min，94 ℃

30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)，72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠電泳成像系統(tǒng)觀察產(chǎn)物條帶。（3）DNA測序。在紫外燈下切割有條帶的膠塊，按DNA純化試劑盒說明書對DNA 進(jìn)行純化后，按TA載體試劑盒說明書與pMD18-T載體進(jìn)行連接，平板克隆。完成后送華大基因公司測序，測序結(jié)果經(jīng)Blast檢索與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比較分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，將所有數(shù)據(jù)錄入SPSS 22.0內(nèi)，對其采用頻數(shù)分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果

2.1 肺炎鏈球菌檢出情況

469例患兒共采集標(biāo)本1 185份，陽性標(biāo)本273份，細(xì)菌檢出率為23.04%（273/1 185）;其中72份標(biāo)本為肺泡灌洗液，

1 113份標(biāo)本為痰液;少數(shù)標(biāo)本查出混合菌感染，最終共培養(yǎng)出298株病原菌。其中前五位細(xì)菌分別為：肺炎鏈球菌（86/298，占28.86%）、流感嗜血桿菌（71/298，占23.83%）、金黃色葡萄球菌（39/298，占13.09%）、肺炎克雷伯菌（22/298，占7.38%）、大腸埃希菌（20/298，占6.71%）。其他細(xì)菌數(shù)量相對較少，分別為鮑曼不動桿菌（15/298，占5.03%）、銅綠假單胞菌（10/298，占3.36%）、卡他布拉漢氏菌（7/298，占2.35%）、陰溝腸桿菌（5/298，占1.68%）、洋蔥伯克霍爾德氏菌（5/298，占1.68%）、腸桿菌科（4/298，占1.34%）、產(chǎn)氣腸桿菌（3/298，占1.01%）;醫(yī)院不動桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌均只有2株（占0.67%）;而陰溝腸桿菌、坂崎腸桿菌、粘金黃桿菌、柯氏檸檬酸桿菌、腦膜炎敗血性黃桿菌、解尿氨酸克雷伯菌、糞腸球菌均僅有1株

（占0.34%）。

2.2 抗菌藥物耐藥性檢測結(jié)果

肺炎鏈球菌對紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明均有較高的耐藥性，且呈逐年上升趨勢;多數(shù)肺炎鏈球菌對青霉素類、頭孢類藥物敏感，對萬古霉素、利奈唑胺的耐藥率為0，未發(fā)現(xiàn)對喹諾酮類藥物耐藥，見表1。

2.3 血清學(xué)分型結(jié)果

86株臨床分離的肺炎鏈球菌中，檢出19F最多，占29.07%（25株），其次為23F，占15.12%（13株），6型占15.12%（13株），19A型占11.63%（10株），其他為：15B型占4.65%（4株），14型占2.33%（2株），15A、18型、9V、4型各占1.16%（1株），另外檢出兩種血清型混合感染占11.63%（10株），未檢出相關(guān)血清型5.81%（5株）。

3 討論

肺炎鏈球菌（streptococcus pneumoniae，SP）是人類最早認(rèn)識的革蘭陽性雙球菌，人群對其普遍易感，全球兒童肺炎鏈球菌的感染率及感染相關(guān)病死率高。據(jù)報道，據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計，2008年全球5歲以下兒童死亡約880萬例，5%死于肺炎鏈球菌性疾?。╬neumococcal diseases，PD）[3];2010年WHO估計全球全年5歲以下肺炎鏈球菌肺炎患兒共258.50萬例，占全球5歲以下肺炎患兒的18.30%，兒童肺炎鏈球菌肺炎現(xiàn)況不容樂觀。

本研究發(fā)現(xiàn)筆者所在醫(yī)院兒童重癥肺炎以肺炎鏈球菌感染為首，與陸蕓蕓等[4]報道的重癥肺炎患兒細(xì)菌檢出以流感嗜血桿菌為首不同，與劉霞等[5]報道的重癥肺炎患兒細(xì)菌檢出以肺炎克雷伯菌為首亦不相同，也不完全等同于De Schutter等[6]報道的肺炎以流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、肺炎鏈球菌為主要細(xì)菌病原，提示不同地域、不同病情，肺炎病原菌普可發(fā)生不同的變遷。準(zhǔn)確掌握本地區(qū)重癥肺炎病原菌普的變遷情況，可指導(dǎo)臨床醫(yī)生選擇有效抗生素，有助于提高重癥肺炎的搶救成

功率。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌對紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明等藥物耐藥性較高，與李立群等[7]報道一致，也可能與大環(huán)內(nèi)酯類藥物不合理使用有關(guān)。多數(shù)肺炎鏈球菌對青霉素類、頭孢類藥物還是比較敏感的，筆者尚未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素、替考拉寧和利奈唑胺耐藥的菌株，與國內(nèi)其他報道類似[8]。但國外Sanaei等[9]報道肺炎鏈球菌對萬古霉素的耐藥率為1.5%?？偟膩碚f，肺炎鏈球菌的耐藥菌率是呈上升趨勢的，臨床工作中應(yīng)予以重視。

現(xiàn)實中肺炎鏈球菌存在90多種血清型，具有強(qiáng)大的致病力和定植力，決定血清型特異性的是其細(xì)胞外包繞的莢膜多糖，也是最重要的毒力因子和致病關(guān)鍵，可作為宿主抗體的作用靶點，這也是疫苗應(yīng)用的基礎(chǔ)。肺炎鏈球菌的血清型與其致病性、耐藥性和疫苗有效性等均密切相關(guān)，是防治種肺炎鏈球菌相關(guān)性疾?。╬neumococcal disease，PD）相關(guān)研究的核心。多項研究顯示肺炎鏈球菌多重耐藥菌在全球廣泛流行，亞洲國家最顯著，我國則高達(dá)80%～90%[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，筆者所在醫(yī)院肺炎鏈球菌感染引起的兒童重癥肺炎，血清學(xué)分型以19F為主，這與陳巧君等[11]報道較為類似，也與歐美發(fā)達(dá)國家廣泛應(yīng)用PCV疫苗之前的結(jié)果及亞洲多個國家監(jiān)測結(jié)果相似[12]，但與王啟等[13]有關(guān)報道略有不同，與李曉等[14]有關(guān)報道亦有不同;Xue等[15]對中國兒童171株侵襲性肺炎鏈球菌菌株采用傳統(tǒng)方法檢測血清型結(jié)果顯示以19 F、14、19A、未檢出型、6、23F為主，與本文亦略有差異，這說明肺炎鏈球菌的血清型分布存在地區(qū)差異，具有區(qū)域性?？赡芘c各地區(qū)人群的組成、疫苗的接種情況不同有關(guān)。

SP的血清型分布流行特點具有地域、年齡差別，并隨時間、環(huán)境變遷、人群流動、抗菌素壓力、細(xì)菌進(jìn)化和重組等多種因素出現(xiàn)不同時期流行血清型的飄移[16]，因此，持續(xù)監(jiān)測SP的血清型流行分布及改變特征，與研究SP的致病機(jī)制、耐藥性傳播、血清型置換等實驗和臨床研究都息息相關(guān)，對防治PD具有重要的流行病學(xué)意義。

綜上所述，肺炎鏈球菌仍是本地區(qū)兒童重癥肺炎的主要病原菌，血清型分類以19F為主，肺炎鏈球菌臨床耐藥問題值得大家關(guān)注，應(yīng)提高肺炎鏈球菌的鑒定能力，及早發(fā)現(xiàn)，正確合理使用抗生素，有效提高兒童重癥肺炎的救治成功率。

參考文獻(xiàn)

[1]中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組.兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南（2013修訂）（上）[J].中華兒科雜志，2013，51（10）：745-752.

[2]吳麗娟，鄒建話，劉小月，等.多重PCR檢測肺炎鏈球菌血清型方法及臨床應(yīng)用[J].微循環(huán)學(xué)雜志，2012，22（4）：31-33.

[3] Walker C L，Rudan I，Liu L，et al.Global burden of childhood pneumonia and diarrhoea[J].Lancet，2013，381（9875）：1405-1416.

[4]陸蕓蕓，羅蓉，符州.兒童重癥社區(qū)獲得性肺炎病原體分布及細(xì)菌耐藥情況分析[J].中國當(dāng)代兒科雜志，2017，19（9）：983-988.

[5]劉霞，馬靜，張忠曉，等.兒童重癥肺炎2044例肺泡灌洗液細(xì)菌病原學(xué)分析[J].中國實用兒科雜志，2014，29（6）：438-441.

[6] De Schutter I，De Wachter E，Crokaert F，et al.Microbiology of bronchoalveolar lavage fluid in children with acute nonresponding or recurrent community-acquired pneumonia：identification of nontypeable Haemophilus influenzae as a major pathogen[J].Clin Infect Dis，2011，52（12）：1437-1444.

[7]李立群，胡靜，周凱，等.兒童下呼吸道肺炎鏈球菌感染臨床特征及耐藥性[J].中國感染控制雜志，2016，15（8）：576-582.

[8]沙文光，戴本啟，葉發(fā)展.兒童重癥社區(qū)獲得性肺炎病原體分布及細(xì)菌耐藥情況分析[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2019，36（1）：24-27.

[9] Sanaei D A，Abdinia B，Karimi A.Nasopharyngeal carrier rate of Streptococcus pneumoniae in children：serotype distribution and antimicrobial resistance[J].Arch Iran Med，2012，15（8）：500-503.

[10]黎全華，楊永弘.兒童肺炎鏈球菌感染的防治進(jìn)展[J].臨床藥物治療雜志，2013，11（1）：27-30.

[11]陳巧君，王婷.兒童呼吸道肺炎鏈球菌的感染狀況、血清學(xué)分型及耐藥性研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2018，28（7）：809-812.

[12] Kim S H，Song J H，Chung D R，et al.Changing trends in antimicrobial resistance and serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates in Asian countries：an Asian Network for Surveillance of Resistant Pathogens （ANSORP） study[J].Antimicrobial Agents & Chemotherapy，2012，56（3）：1418-1426.

[13]王啟，張菲菲，趙春江，等.2010-2011年中國肺炎鏈球菌耐藥性和血清型研究[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2013，36（2）：106-112.

[14]李曉.肺炎鏈球菌臨床分離株的臨床特點、血清分型及耐藥性分析[J].系統(tǒng)醫(yī)學(xué)，2018（9）：58-62.

[15] Xue L，Yao K，Xie G，et al.Serotype Distribution and Antimicrobial Resistance of Streptococcus pneumoniae Isolates That Cause Invasive Disease among Chinese Children[J].Clinical Infectious Diseases，2010，50（5）：741-744.

[16]吳麗娟.新型多重?zé)晒馓结樂z測常見肺炎鏈球菌血清型的臨床應(yīng)用研究[D].廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2014：1-101.