史偉國，白國棟，宗希明，袁 寰，佟德成，高慶東

(1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯市中醫(yī)醫(yī)院，黑龍江佳木斯 154002)

多根硬皮馬勃[SclerodermaPolyrhizum(J.F.Gmel.)Pers.]，為擔(dān)子菌亞門，硬皮馬勃目，硬皮馬勃科，硬皮馬勃屬的大型真菌，具有消腫、止血等藥用功效[1-2]。它是藥食兩用真菌的典型代表[3-6]。其作為藥用時可以單獨入藥，水煎液用于治療老年外陰濕疹[7]及痔瘡手術(shù)后的排便困難[8]、其發(fā)酵物對慢性肺損傷具有治療作用[9]。與其他藥物處方連用，可治療慢性咳嗽、咽痛、亞急性甲狀腺炎、緩解鼻咽癌放化療副反應(yīng)、治療壓瘡等疾病[10-15]。

目前對多根硬皮馬勃的研究主要是關(guān)于其化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)分析方面，對其液體發(fā)酵工藝及抑菌活性研究鮮有報道。本研究采取星點設(shè)計-響應(yīng)面法(Central composite design-response surface methodology，CCD-RSM)對其液體發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，在搖床轉(zhuǎn)速一定的情況下研究發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和接種量對多根硬皮馬勃胞外粗多糖(Polysaccharides fromSclerodermaPolyrhizum，PSP)含量的影響，同時對不同濃度的PSP溶液體外抑菌效果進行考察，以期能為多根硬皮馬勃的進一步研究提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多根硬皮馬勃，中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所；大腸埃希菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，由佳木斯市中醫(yī)醫(yī)院化驗室提供。葡萄糖、硫酸鎂、苯酚、硫酸、氯化鈉、氫氧化鈉，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀，上海浩洋生物科技技術(shù)有限公司；瓊脂、牛肉膏、蛋白胨北京奧博生物技術(shù)有限責(zé)任公司；土豆購于當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。

馬勃真菌斜面培養(yǎng)基(1 L)：取馬鈴薯：200 g，葡萄糖：20 g，瓊脂：20 g，pH自然，高壓蒸汽滅菌(121℃，30 min)，待用；液體種子培養(yǎng)基(1 L)：取馬鈴薯：200 g，葡萄糖：30 g，蛋白胨：30 g，KH2PO4：1 g，MgSO4：1 g，pH自然，高壓蒸汽滅菌(121℃，30 min)，待用；液體發(fā)酵培養(yǎng)基(1 L)：取葡萄糖：28 g，蛋白胨：18 g，KH2PO4：1 g，MgSO4：1 g，pH自然，高壓蒸汽滅菌(121℃，30 min)，待用；細菌斜面培養(yǎng)基(1 L)：取牛肉膏：3 g，蛋白胨：10 g，NaCl：5 g，瓊脂：20 g，pH 7.0～7.2，高壓蒸汽滅菌(121℃，30 min)，待用；細菌液體培養(yǎng)基(1 L)：取牛肉膏：3 g，蛋白胨：10 g，NaCl：5 g，pH 7.0～7.2，高壓蒸汽滅菌(121℃，30 min)，待用；平板培養(yǎng)基(1L)：取牛肉膏：3 g，蛋白胨：10 g，NaCl：5 g，瓊脂：20 g，pH 7.0～7.2，高壓蒸汽滅菌(121℃，30 min)，待用。

1.2 儀器與設(shè)備

AUW220D型電子分析天平(島津公司)；XY-X3恒溫搖瓶機(山東大學(xué)制造)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；YM50立式高壓滅菌鍋(上海三申有限公司)；DN-360型電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京科偉永興儀器有限公司)；ZHJH-C1214B垂直流超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；PHS-3DW型pH計(安徽合肥卓爾儀器儀表有限公司)；UV-2550型紫外可見分光光度計(島津公司)；Vir Tis wizard 2.0型真空冷凍干燥機(美國SP INDUSTRIES INC公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 液體種子的制備

將4℃保存的多根硬皮馬勃菌種用斜面培養(yǎng)基27℃，48 h活化，再將活化后的菌種切成大小相同的5 mm×5 mm見方的菌塊，移至滅菌后的研缽中，加10 mL無菌水研磨均勻，轉(zhuǎn)入到滅菌后的液體種子培養(yǎng)基內(nèi)，27℃，搖床轉(zhuǎn)速150 rpm/min，培養(yǎng)72 h備用。

1.3.2 葡萄糖標準曲線的制備

精密稱取干燥至恒重葡萄糖粉末10 mg，定容至100 ml，待葡萄糖完全溶解,得0.1 mg/ml的葡萄糖標準溶液。精密稱取葡萄糖標準溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ml分別置于試管中，分別加水2、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8 ml，加5%苯酚溶液1.0 ml，震勻，快速加入濃硫酸5.0 ml，放置10 min，震勻，置100℃水浴15 min后，取出室溫放涼，測定吸光度，在490 nm波長處出現(xiàn)最高值，以葡萄糖的濃度(C)為橫坐標，吸光度(A490)為縱坐標繪制曲線。

1.3.3 胞外粗多糖含量的測定

精密吸取發(fā)酵液稀釋至合適濃度的樣品溶液2 mL，按照苯酚-硫酸法測定樣品溶液吸光度。根據(jù)樣品吸光度計算發(fā)酵液中多根硬皮馬勃胞外粗多糖含量。

1.3.4 發(fā)酵條件單因素試驗設(shè)計

在搖床轉(zhuǎn)速固定為150 rpm/min的條件下，在發(fā)酵溫度分別是25、26、27、28、29℃，發(fā)酵時間分別為24、48、72、96、120 h，接種量分別為3、6、10、15、20%的條件下將液體種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，考察發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和接種量對發(fā)酵液中PSP含量的影響。

1.3.5 星點設(shè)計-響應(yīng)面試驗設(shè)計

運用Design-Expert 8.0.6軟件進行3因素5水平CCD-RSM實驗設(shè)計，通過對單因素試驗結(jié)果的分析，以發(fā)酵溫度(X1)、發(fā)酵時間(X2)和接種量(X3)3個因素分別選取5個水平對PSP含量(Y)進行考察。試驗因素水平編碼見表1。

表1 液體發(fā)酵條件分析因素與水平Table 1 Factors and levels in response surface design of PSP liquidfermentation condition

1.3.6 多根硬皮馬勃胞外粗多糖的抑菌性考察

將浸泡于濃度為：0.1 mg/mL、0.01 mg/mL、0.001 mg/mL的PSP溶液中的濾紙片水分完全揮干，按“品”字形分貼于大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的平板培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基貼3片，以無菌水做陰性對照組，三氯新做陽性對照。37℃培養(yǎng)24 h。通過測量抑菌圈的直徑，來考察PSP的抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線線性考察結(jié)果

根據(jù)葡萄糖對照品濃度(C)與吸光度值(A)的線性關(guān)系，得回歸方程A=50.96C+0.0153，R2=0.9991，說明該方程線性關(guān)系良好。

即馬勃胞外粗多糖含量(mg/mL)=[(A-0.0153)/50.96×稀釋倍數(shù)×樣品溶液體積]/1000

式中：A為馬勃樣品的吸光度。

2.2 單因素試驗結(jié)果與分析

2.2.1 發(fā)酵溫度對馬勃胞外粗多糖含量的影響

如圖1所示，PSP的含量隨著溫度的升高而增大，當溫度超過27℃，含量小幅度下降，說明多根硬皮馬勃對溫度的變化比較敏感，隨著溫度的提升，馬勃真菌的活力增加，此時如果繼續(xù)增加溫度，會一定程度上抑制真菌活力，使其代謝能力降低。因此選擇27℃為CCD-RSM試驗發(fā)酵溫度的中心點。

圖1 發(fā)酵溫度對馬勃胞外粗多糖含量的影響Fig.1 Influence of fermentation temperature on PSP yield

2.2.2 發(fā)酵時間對馬勃胞外粗多糖含量的影響

如圖2所示，PSP含量的隨著時間的延長是呈上升趨勢，當發(fā)酵時間超過72 h，多糖含量變化不明顯。說明馬勃菌種的生物活力隨著時間的延長而逐漸曾強。隨著發(fā)酵的繼續(xù)，菌絲細胞進入穩(wěn)定期，生物活力逐漸降低，對發(fā)酵液中的多糖含量變化影響不大。如果繼續(xù)發(fā)酵，部分菌絲體可能會有自溶現(xiàn)象的發(fā)生，給發(fā)酵液中引入更多的其他成分，會對后續(xù)試驗的結(jié)果產(chǎn)生影響，因此選擇72 h為CCD-RSM試驗發(fā)酵時間的中心點。

圖2 發(fā)酵時間對馬勃胞外粗多糖含量的影響Fig.2 Influence of fermentation time on PSP yield

2.2.3 接種量對馬勃胞粗外多糖含的影響

如圖3所示，PSP的含量隨著接種量的增加而增多，后多糖含量變化不明顯。說明發(fā)酵液中的營養(yǎng)成分數(shù)量一樣，如果接種量過多，營養(yǎng)成分數(shù)量有限，養(yǎng)分消耗過大，馬勃真菌的活性降低，可能會抑制制多糖的合成，而且接種量過大，也會提高成本，造成菌種資源的浪費，因此選擇接種量10%為CCD-RSM試驗接種量的中心點。

圖3 接種量對馬勃胞外粗多糖含量的影響Fig.3 Influence of fermentation inoculum on PSP yield

2.3 星點設(shè)計-響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

2.3.1 CCD-RSM模型建立及結(jié)果

通過響應(yīng)面設(shè)計對PSP含量建立數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量為自變量，PSP含量為響應(yīng)值。試驗結(jié)果見表2。

2.3.2 響應(yīng)面回歸模型的建立及顯著項檢驗

將表2中PSP含量進行回歸分析，得到馬勃發(fā)酵液中PSP含量回歸方程為：Y=11.50-0.28X1-0.55X2-0.16X3+0.58X1X2-077X1X3-0.17X2X3-0.78X2X1-0.64X2X2-0.70X2X3(R2=0.9311)。

模型的F值為15.02，P<0.05，表明該試驗的回、歸模型較顯著；失擬誤差P>0.05，不顯著，表明該模型穩(wěn)定性較好，該模型=能較好的模擬PSP真實含量與各變量之間的關(guān)系。根據(jù)回歸模型方差分析可知：X1(F=5.39，P=0.0427);X2(F=20.65，P=0.0011)；X1X2(F=12.91，P=0.0049)；X2X1(F=46.93，P<0.0001)；X2X2(F=31.52，P=0.0002)；X2X3(F=37.67，P=0.0001)；可見，X2X1為極顯著項；X1、X2、X1X2、X2X2、X2X3為顯著項。

表2 響應(yīng)面設(shè)計模型及試驗值Table 2 CCD-RSM design matrix and the experimental values

2.3.3 工藝參數(shù)的優(yōu)化與驗證

使用Design-Expert 8.0.6軟件，對已得二項式擬合方程繪制3D響應(yīng)面與等高線，見圖4-6。各要素對響應(yīng)值大小的影響，體現(xiàn)在應(yīng)曲面的起伏高度，即曲面起伏高度越陡，等高線越密集，表示該因素對響應(yīng)值影響越明顯，其關(guān)系成正比。兩因素交互作用大，則等高線表示成橢圓形，反之，表示成圓形。根據(jù)3D響應(yīng)面與等高線圖分析，影響發(fā)酵液中馬勃胞外粗多糖含量的培養(yǎng)條件顯著性順序為：發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度>接種量.

通過各因素的優(yōu)化，得到馬勃液體發(fā)酵培養(yǎng)基最佳培養(yǎng)條件條件：發(fā)酵溫度26.6℃，發(fā)酵時間64.71 h、接種量9.98%，發(fā)酵液中馬勃胞外粗多糖的含量為11.73 mg/mL。按照上述條件，結(jié)合實驗室實際情況，采用發(fā)酵溫度 27℃、發(fā)酵時間65 h、接種量10%，重復(fù)試驗3次，粗多糖的平均含量為11.56 mg/mL，驗證的結(jié)果與模型預(yù)測值較吻合。因此，該方法可以考慮作為馬勃液體發(fā)酵培養(yǎng)基最佳培養(yǎng)條件的優(yōu)化與預(yù)測。

2.4 抑菌考察結(jié)果分析

本實驗采用濾紙片法研究PSP對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌效果。由表3可知，PSP對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌均有抑制作用。在高濃度時，對金黃色葡萄球菌的抑制能力最強，大腸埃希菌的抑制能力較弱，其抑制能力會隨著濃度的降低而減弱；對于銅綠假單胞菌，PSP溶液沒有抑制作用。通過對比可知，PSP對革蘭氏陽性菌的抑菌能力優(yōu)于對革蘭氏陰性菌，綜合分析PSP對三種常見致病菌的抑制能力為：金黃色葡萄球菌>大腸埃希菌>銅綠假單胞菌。

圖4 發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間對PSP含量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response Surface and contour plots of temperature and time on the content of PSP

圖5 發(fā)酵溫度與接種量對PSP含量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response Surface and contour plots of temperature and inoculum on the content of PSP

圖6 發(fā)酵時間與接種量對PSP含量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Response Surface and contour plots of time and inoculum on the content of PSP

表3 馬勃粗多糖的抑菌效果Table 3 Antibacterial effect of PSP

注：抑菌圈直徑單位：mm，抑菌圈直徑含濾紙片直徑6 mm，“-”表示無抑菌圈。

3 討論與結(jié)論

本次試驗是在pH自然、搖床轉(zhuǎn)速固定的條件下考察多根硬皮馬勃液體發(fā)酵的培養(yǎng)條件，研究是建立在單因素實驗的結(jié)果上，通過CCD-RSM建立模型，并對回歸方程、響應(yīng)面圖與等高線圖的分析可知：影響發(fā)酵液中馬勃胞外粗多糖含量的培養(yǎng)條件顯著性順序為：發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度>接種量。獲得多根硬皮馬勃粗多糖液體發(fā)酵最佳培養(yǎng)條件：發(fā)酵溫度26.6℃，發(fā)酵時間64.71 h、接種量9.98%，發(fā)酵液中PSP的含量為11.73 mg/mL。按照上述條件，結(jié)合實驗室實際情況，采用發(fā)酵溫度 27℃、發(fā)酵時間65 h、接種量10%，經(jīng)過3次驗證，PSP平均含量為11.56 mg/mL。同時采用濾紙片法考察PSP對三種常見致病菌的抑菌效果。抑制能力表現(xiàn)為：金黃色葡萄球菌>大腸埃希菌>銅綠假單胞菌。本結(jié)果可為多根硬皮馬勃胞外粗多糖的規(guī)模化生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支持和參考依據(jù)，為促進馬勃粗多糖的進一步的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

本次試驗在此基礎(chǔ)上得出了最佳的培養(yǎng)條件，但有關(guān)不同的pH值以及搖床轉(zhuǎn)速對馬勃胞外粗多糖含量的影響還需進一步深入研究。