李威霖，鐘江斌，趙乙樺，陳成標(biāo)，達(dá)娃央宗，都玉蓉，馬建濱

(青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青海省青藏高原藥用動植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧810000)

寬葉獨(dú)行菜(LepidiumlatifoliumL.)是十字花科獨(dú)行菜屬多年生草本植物，全草入藥，有清熱燥濕的作用[1]。因它有較強(qiáng)的抗逆性，國外研究者常把寬葉獨(dú)行菜視為外來侵略性雜草[2]。目前研究顯示，利用GC-MS技術(shù)對寬葉獨(dú)行菜的脂肪酸成分進(jìn)行分析，其中乙醇提取物的石油醚萃取部位的棕櫚酸含量達(dá)到53.98%，硬脂酸含量在17%以上[7]；寬葉獨(dú)行菜具有驅(qū)蟲、抗菌的作用，對胃腸道疾病具有一定治療作用[3-6]。主要因其富含生物活性化合物，如山奈酚、槲皮素、槲皮素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等黃酮類化合物[8-9]。黃酮類化合物具有抑菌、抗疲勞、抗氧化、降血脂、抗腫瘤等生物活性，已廣泛運(yùn)用于臨床醫(yī)療[10-14]。

超聲波提取技術(shù)具有耗時短、提取率高、過程方便及費(fèi)用低等特點(diǎn)，在植物學(xué)和天然產(chǎn)物化學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[15-16]，本實(shí)驗(yàn)利用溶劑乙醇對寬葉獨(dú)行菜進(jìn)行超聲波輔助提取。此法可以顯著地縮短提取時間提高黃酮的提取率。通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法，篩選超聲輔助提取寬葉獨(dú)行菜總黃酮的最優(yōu)提取工藝，以期為寬葉獨(dú)行菜中有效成分的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

原料：寬葉獨(dú)行菜(2017年6月采自青海省海西州烏蘭縣農(nóng)田及周邊)，樣品標(biāo)本由中國科學(xué)院西北高原生物研究所吳玉虎研究員鑒定。寬葉獨(dú)行菜樣品自然陰干后粉碎，過15目篩。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；亞硝酸鈉(分析純)：天津市東華試劑廠；硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇(分析純)：天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司。

G-9紫外分光光度計(jì)：南京菲勒；CA-1115A冷卻水循環(huán)機(jī)、N-1100V-WD旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：東京理化；D2021高速離心機(jī)：北京刻薄賽爾上海萌睿生物科技有限公司；mL204/02萬分之一天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；JP-060ST超聲波清洗器：深證市潔盟清洗設(shè)備有限公司；ZN-200A微型高速粉碎機(jī)：中南制藥機(jī)械廠。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取經(jīng)75℃干燥的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5 mg于燒杯中，70%乙醇溶解并定容至50 ml容量瓶中，配制成濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液：0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于10 mL試管中，加入30%乙醇溶液至6 mL，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，震蕩搖勻后放置5 min，加入10%AgNO3溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，加入2 mL 1.0 mol/LNaOH溶液，用30%乙醇定容至10 mL，搖勻后放置15 min，從中吸取一定量的溶液加入比色皿，檢測蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液510 nm波長的吸光度。圖中橫軸為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的不同濃度值，縱軸為不同濃度值對應(yīng)的吸光度值，計(jì)算相關(guān)系數(shù)(R)。

2.2 黃酮含量計(jì)算

總黃酮含量M(mg/g)=a×c×V/W

(公式1)

其中a為稀釋倍數(shù)，c為黃酮濃度(mg/mL)，V為提取液體積(mL)，W為寬葉獨(dú)行菜草粉質(zhì)量(g)。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取10份質(zhì)量為2.0 g的寬葉獨(dú)行菜粉末，分別加入體積濃度為50%乙醇溶液，密封后在70℃超聲輔助萃取60 min；按照NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法測定最吸光度，由回歸方程及公式1計(jì)算出其中總黃酮含量。

2.4 加樣回收實(shí)驗(yàn)

取5份質(zhì)量為2.0 g的寬葉獨(dú)行菜粉末分別加入體積濃度為50%的水-乙醇溶液，密封后在40℃超聲輔助萃取30 min；在70℃下超聲提取60 min，抽濾、減壓蒸餾濃縮至一定體積；按照NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法，在最大吸收波長510 nm下測定吸光度，由回歸方程計(jì)算出其中總黃酮濃度c1，之后，往其中加入預(yù)先配置好的濃度(c0)30.00 mg/L標(biāo)準(zhǔn)液等體積，混合均勻之后測得其吸光度，依據(jù)回歸方程及公式1求出其中總黃酮含量(c2)，換算后可依據(jù)計(jì)算加樣回收率。

加樣回收率計(jì)算公式：

s=(c1-c2)/cn×100%

(公式2)

其中c1為提取液中總黃酮的濃度；c2為加入標(biāo)準(zhǔn)液之后溶液的濃度；cn為加入的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度；s為回收率。

2.5 單因素實(shí)驗(yàn)

2.5.1 乙醇濃度對寬葉獨(dú)行菜總黃酮提取效果的影響

稱取2.0 g的寬葉獨(dú)行菜待測樣品7份，在料液比1:15(mL/g)，提取溫度60℃，提取時間60 min，超聲功率為360 W的固定條件下，考察不同濃度(30%、40%、50%、60%、70%、80%和95%)的乙醇溶液對寬葉獨(dú)行菜總黃酮提取量的影響。

2.5.2 提取時間對寬葉獨(dú)行菜總黃酮提取效果的影響

稱取2.0 g的寬葉獨(dú)行菜5份，在料液比1∶15(mL/g)，乙醇濃度60%，提取溫度60℃，超聲功率為360W的固定條件下，考察不同提取時間(30 min、60 min、90 min、120 min、150 min)對寬葉獨(dú)行菜黃酮提取量的影響。

2.5.3 液料比對寬葉獨(dú)行菜中總黃酮提取效果的影響

稱取2.0 g的寬葉獨(dú)行菜5份，在乙醇濃度60%，提取時間60 min，提取溫度60℃，超聲功率為360 W固定條件下，考察不同液料比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)對寬葉獨(dú)行菜黃酮提取量的影響。

2.5.4 提取溫度對寬葉獨(dú)行菜中總黃酮提取效果的影響

稱取2.0 g的寬葉獨(dú)行菜5份，液料比1∶15(mL/g)，在乙醇濃度60%，提取時間60 min，超聲功率為360 W的固定條件下，考察不同提取溫度(40℃、50℃、60℃、70℃、80℃)對寬葉獨(dú)行菜黃酮提取量的影響。

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化寬葉獨(dú)行菜總黃酮提取實(shí)驗(yàn)

參照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇黃酮的提取量為響應(yīng)值，提取時間、乙醇濃度、提取時間、液料比為自變量；意單因素分析的不同實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定不同單因素的最佳實(shí)驗(yàn)條件。利用Expert Design 8.0.3進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)，設(shè)計(jì)四因素三水平的實(shí)驗(yàn)方案(表1)。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface design

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

在波長510 nm處測得吸光度值為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=12.165x+0.0007，R2=0.9996。結(jié)果表明，黃酮含量在0-0.06 mg/mL范圍內(nèi)，線性擬合良好。

圖1 蘆丁溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of rutin solution

3.2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 寬葉獨(dú)行菜中總黃酮的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of precision test in Lepidium latifolium L.

3.3 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3可以看出，其回收率在95%-102%之間，具有較好的回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合準(zhǔn)確度的要求。

表3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Additive recovery test results

3.4 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.4.1 不同乙醇濃度對寬葉獨(dú)行菜總黃酮提取量的影響

從圖2看出，當(dāng)乙醇濃度在30%-70%時，寬葉獨(dú)行菜中總黃酮提取量隨著乙醇度的提高而增大；當(dāng)達(dá)到80%-90%時，總黃酮提取量下降，可能是由于乙醇濃度過高，黃酮苷類在高濃度乙醇中溶解性降低，進(jìn)而導(dǎo)致總黃酮提取量減少；因此70%的乙醇濃度為提取總黃酮的最佳濃度[17]。

圖2 不同乙醇濃度下寬葉獨(dú)行菜黃酮的提取量Fig.2 Extraction yield of flavonoids from lonicera chinensis with different ethanol concentrations in Lepidium latifolium L.

3.4.2 不同提取時間對寬葉獨(dú)行菜總黃酮提取量的影響

從圖3可以看出，當(dāng)提取時間在30-90 min時，寬葉獨(dú)行菜中總黃酮提取量隨時間增加而增加，而當(dāng)提取時間超過90 min時提取的總黃酮含量有所下降。因此推斷，適當(dāng)?shù)奶崛r間可以使寬葉獨(dú)行菜中總黃酮充分溶解到提取液中，但提取時間過長時，部分黃酮類物質(zhì)在高溫環(huán)境下會發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，從而導(dǎo)致提取效果降低[18]。因此提取時間選擇90 min左右。

圖3 提取時間對寬葉獨(dú)行菜黃酮提取量的影響Fig.3 Effects of extraction time on extraction yield of flavonoids in Lepidium latifolium L.

3.4.3 不同液料比對寬葉獨(dú)行菜總黃酮提取量的影響

營運(yùn)能力可從市場營銷能力和產(chǎn)品/服務(wù)能力兩個方面來衡量。企業(yè)的營銷能力主要指企業(yè)是否能夠吸引新客戶、維持老客戶。B2C企業(yè)的產(chǎn)品存在于虛擬網(wǎng)站空間，未直接面向客戶，因此對消費(fèi)者的推廣營銷、對于顧客的消費(fèi)偏好、潛在消費(fèi)者的挖掘等對企業(yè)成長方向確定產(chǎn)生關(guān)鍵性的作用。產(chǎn)品服務(wù)能力是影響B(tài)2C企業(yè)最關(guān)鍵的要素，是企業(yè)價(jià)值構(gòu)造和品牌認(rèn)知形成的主要手段。因?yàn)楫a(chǎn)品和服務(wù)是B2C企業(yè)同顧客之間發(fā)生關(guān)系的紐帶和橋梁，企業(yè)通過產(chǎn)品和服務(wù)的全面性、優(yōu)質(zhì)性、獨(dú)特性來吸引消費(fèi)者產(chǎn)生偏好和忠誠進(jìn)而對企業(yè)認(rèn)識、認(rèn)同和支持，從而擴(kuò)大市場份額，給企業(yè)帶來利潤。

從圖4中可以看出，當(dāng)液料比從10:1(mL/g)增加到25:1時，寬葉獨(dú)行菜總黃酮的提取率有顯著提升，可能是由于當(dāng)液料比較低時，少量的提取溶劑無法完全將寬葉獨(dú)行菜中的總黃酮完全溶解出，隨著提取液中總黃酮的濃度不斷提高，樣品中總黃酮向提取溶劑的轉(zhuǎn)移速率下降。當(dāng)提取液中總黃酮濃度飽和時，或樣品中總黃酮濃度小于提取液中總黃酮濃度時，其提取效果變無法進(jìn)一步提高。當(dāng)液料比在20:1-30:1時，總黃酮的提取量略有下降，但變化幅度不大，因此可認(rèn)為基本達(dá)到完全提取的效果。故液料比選擇25:1。

圖4 不同液料比對寬葉獨(dú)行菜黃酮提取量的影響Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on extraction yield of flavonoids in Lepidium latifolium L.

3.4.4 不同提取溫度對寬葉獨(dú)行菜總黃酮提取量的影響

從圖5中可以看出，當(dāng)提取溫度為40℃-70℃時，寬葉獨(dú)行菜中總黃酮的提取量隨著溫度的升高而增加，當(dāng)溫度超過70℃時，總黃酮的提取率略有下降，可能是因?yàn)闇囟冗^高對部分黃酮類物質(zhì)起到一定的分解破壞作用而導(dǎo)致提取效果下降，因此提取溫度選擇70℃。

圖5 不同提取溫度對寬葉獨(dú)行菜黃酮提取量的影響Fig.5 Effects of different extraction temperature on extraction rate of falvonoids in Lepidium latifolium L.

3.5 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

使用Design Expert 8.0.3軟件，依照響應(yīng)面Box-Behnken方法設(shè)計(jì)出實(shí)驗(yàn)方案，測定每組實(shí)驗(yàn)條件下寬葉獨(dú)行菜黃酮提取量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头讲罘治鲆姳?。

表4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Scheme and results of response surface design

表5 方差分析表Table 5 Analysis of variance

注：P<0.01，差異極顯著**。

從表5可以看出：該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷姆讲顬?9.01，且差異極其顯著，表明該二次多項(xiàng)模型極顯著；F失擬項(xiàng)= 0.68，P失擬項(xiàng)=0.6893>0.05，表明該模型的失擬性不顯著；該模型的校正決定系數(shù)Adj R2=0.9778，表明該模型可以解釋97.78%總黃酮紫外吸收值的變化，有變異總數(shù)的2.22%不能被該模型解釋；該模型的確定系數(shù)R2=0.9889，表明該模型擬合度較好，存在的實(shí)驗(yàn)誤差小，可應(yīng)用該模型分析和預(yù)測從寬葉獨(dú)行菜提取總黃酮的工藝條件。使用DesignExpert8.0.3軟件對表2-7中實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，最終得到不同自變量的一次效應(yīng)，二次效應(yīng)和交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)方程；即得寬葉獨(dú)行菜中總黃酮的提取量(Y)與自變量乙醇濃度(A)、提取時間(B)、液料比(C)、提取溫度(D)的二次方模型：

Y=35.39-0.057×A+1.13×B+1.22×C+2.33×D-1.74×AB-1.90×AC+1.82×AD+1.17×BC+0.095×BD-1.58×CD-2.40×A2-3.92×B2-1.23×C2-2.32×D2

3.5.2超聲輔助提取寬葉獨(dú)行菜總黃酮響應(yīng)面法優(yōu)化

利用Design Expert 8.0.3軟件對回歸方程和各因素之間的相互作用進(jìn)行擬合分析，利用擬合出的響應(yīng)面形狀，分析提取條件，即A濃度、B時間、C液料比、D溫度對黃酮提取量的影響，擬合結(jié)果如圖6至圖10所示。

由圖6可知，乙醇濃度和提取時間交互作用結(jié)果顯示，提取時間變化曲面比乙醇濃度變化曲面陡峭說明提取時間對寬葉獨(dú)行菜黃酮含量的影響比乙醇濃度大；等高線呈橢圓形表明二者交互作用顯著。在同一乙醇濃度下，隨著提取時間的增加，黃含量也增加，在60-96 min時，升高較明顯。在同一提取時間下，黃酮含量隨著乙醇濃度的升高而增加，在60%-75%時，升高較明顯[19]。

由圖7可知，液料比變化曲面和乙醇濃度變化曲面相對比較平緩說明液料比和乙醇濃度對寬葉獨(dú)行菜黃酮含量的影響不顯著；等高線呈橢圓形表明二者交互作用顯著。在同一乙醇濃度下，隨著液料比的減少，黃酮含量也增加。在同一液料比下，黃酮含量隨著乙醇濃度的升高先增加后減少，在65%-70%時有最大值。

由圖8可知，提取溫度比乙醇濃度對寬葉獨(dú)行菜黃酮含量的影響大。在同一乙醇濃度下，隨著提取溫度的升高，黃酮含量也增加。在同一提取溫度下，黃酮含量隨著乙醇濃度的升高而增加。

由圖9可知，液料比變化曲面比提取時間變化曲面陡峭說明液料比比提取時間對寬葉獨(dú)行菜黃酮含量的影響大；等高線呈橢圓形表明二者交互作用顯著。在同一提取時間下，隨著液料比的減少，黃酮含量增加。在同一液料比下，黃酮含量隨著提取時間的升高先增加后減。

由圖10可知，提取溫度變化曲面比液料比變化曲面陡峭說明提取溫度比液料比對寬葉獨(dú)行菜黃酮含量的影響大；等高線呈橢圓形表明二者交互作用顯著。在同一液料比下，隨著提取溫度的升高，黃酮含量增加。在同一提取溫度下，黃酮含量隨著液料比的較少而增加。

圖6 不同乙醇濃度和提取時間對寬葉獨(dú)行菜黃酮提取量的交互影響Fig.6 The interactive effect of different ethanol concentration and extraction time on extracting flavonoids content in Lepidium latifolium L.

圖7 不同乙醇濃度和液料比對寬葉獨(dú)行菜黃酮提取量的交互影響Fig.7 The interactive effect of different ethanol concentrations and liquid-solid ratio on flavonoids content in Lepidium latifolium L.

圖8 不同乙醇濃度和提取溫度對寬葉獨(dú)行菜黃酮提取量的交互影響Fig.8 The interactive effect of different ethanol concentration and extraction temperature on flavonoids content in Lepidium latifolium L.

圖9 不同提取時間與液料比對寬葉獨(dú)行菜黃酮提取量的交互影響Fig.9 The interactive effe9t of different extraction temperature and solid-liquid ratio on flavonoids content in Lepidium latifolium L.

圖10 提取溫度與液料比對寬獨(dú)行菜黃酮提取量的交互影響Fig.10 The interactive effect of extraction temperature and solid-liquid ratio on flavonoids content in Lepidium latifolium L.

3.6 反應(yīng)條件的優(yōu)化驗(yàn)證

以DesignExpert 8.0.3軟件計(jì)算二次方程模擬，將提取寬葉獨(dú)行菜中總黃酮的實(shí)驗(yàn)參數(shù)確定為：75.36%乙醇、時間88.80 min，液料比22.48∶1，溫度78.84℃；在該實(shí)驗(yàn)參數(shù)下，寬葉獨(dú)行菜總黃酮提取量為36.71 mg/g。

由于實(shí)際操作條件與理論數(shù)據(jù)存在一定的差異，根據(jù)預(yù)測模型的理論最佳提取工藝條件將實(shí)際最佳工藝條件調(diào)整為：乙醇濃度75%，提取時間89 min，液料比22.5 mL/g，提取溫度79℃。以調(diào)整后的工藝條件進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，所得的總黃酮提取量為36.5 mg/g，與模型預(yù)測的理論值存在0.25%的誤差，證明使用相應(yīng)面法所得到的最佳工藝條件具有一定的實(shí)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Box-Benhnken中心組合的試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理建立寬葉獨(dú)行菜總黃酮提取工藝的優(yōu)化回歸方程模型，經(jīng)方差分析該模型擬合度較好。響應(yīng)面法結(jié)果顯示，提取溫度、液料比、提取時間對總黃酮提取量影響極顯著，而乙醇濃度的影響不顯著。根據(jù)回歸模型與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，建立寬葉獨(dú)行菜中總黃酮的最優(yōu)提取工藝：料乙醇濃度75%，提取時間89 min，液料比22.5 mL/g，提取溫度79℃，所得的總黃酮提取量為36.5 mg/g。