黃 杰， 張郎織， 邢玉芬， 鄒曉燕， 劉國道， 虞道耿*， 陳志堅*

(1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室， 海南 ?？?571101；2. 海南大學熱帶作物學院， 海南 ?？?570228)

磷(Phosphorus，P)是植物生長發(fā)育所必需的大量營養(yǎng)元素之一，是組成脫氧核糖核酸、腺苷三磷酸和脂質(zhì)等物質(zhì)的重要元素[1-2]。并且，磷參與植株光合作用、呼吸作用、能量代謝和信號傳遞等關鍵的生理生化過程，調(diào)控植物正常的生長發(fā)育[3-5]。在自然界中，土壤中的磷主要以難溶性無機磷和有機磷形式存在，不能被植物直接吸收和利用[6]。因此，缺磷脅迫會導致植物出現(xiàn)一系列的癥狀，如植株矮小，生長緩慢，葉色暗綠和根系發(fā)育受阻等，從而嚴重限制了作物的生長和產(chǎn)量[7]。在傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，雖然通過施用磷肥可以有效的促進作物生長和增加產(chǎn)量，但是，過量施肥可能會導致磷肥流失、水體富營養(yǎng)化和土壤生產(chǎn)力降低等問題[8]。因此，培育磷高效吸收和利用的作物品種是降低磷肥投入的重要舉措。

為了適應低磷脅迫環(huán)境，植物在進化過程中形成了多種調(diào)節(jié)磷吸收和磷平衡的策略。例如，通過改變根系形態(tài)和構(gòu)型增加與土壤的接觸面積[9-10]、通過誘導高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白的表達來提高根系對土壤磷的吸收[11]、通過分泌有機酸和酸性磷酸酶(Acid phosphatase，ACP)來活化利用土壤難溶性有機磷[12-13]、通過調(diào)控磷信號網(wǎng)絡維持細胞磷平衡[14]。ACP是一種能水解單磷酸酯鍵釋放無機磷的水解酶類，其活性的提高被認為是植物適應低磷脅迫的重要機制[15]。一般認為，植物根系分泌的酸性磷酸酶能夠水解土壤有機磷，增加植物對土壤有機磷的利用[16]。另外，酸性磷酸酶也能活化利用植物組織中的有機磷，促進磷的再利用[17]。研究表明，低磷脅迫顯著增加了水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)、鷹嘴豆(Cicerarietnum)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)等植物的酸性磷酸酶活性，從而有助于促進植物對磷的活化利用[18-21]。

‘崖州硬皮豆’(‘Macrotylomauniflorum(Lam.) Verdc. Yazhou’)為豆科硬皮豆屬一年生草本植物，莖葉柔軟，適口性好，營養(yǎng)價值高，是草食家畜的優(yōu)質(zhì)飼料?！轮萦财ざ埂?015年通過全國草品種審定委員會審定登記為地方品種?！轮萦财ざ埂哂懈蛋l(fā)達、抗旱和耐貧瘠等特點，被認為是優(yōu)良的豆科綠肥，也是常規(guī)和基因工程育種的潛在材料[22]。然而，以往研究主要對硬皮豆的生物學特性和栽培技術(shù)進行了摸索，對硬皮豆響應低磷脅迫的研究未見報道，對其適應低磷脅迫的生理機制了解甚少。因此，本研究以‘崖州硬皮豆’為材料，通過分析不同外源磷濃度處理對硬皮豆生長和酸性磷酸酶活性等生理特性的影響，以探討硬皮豆響應低磷脅迫的可能機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘崖州硬皮豆’種子由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1植物材料培養(yǎng)與處理 參考賈怡丹等[23]方法，將硬皮豆種子在濕潤的濾紙上萌發(fā)5 d后，長成的幼苗在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中預培養(yǎng)15 d，對幼苗進行3個不同磷濃度水培處理[24]，磷濃度分別為5 μM，100 μM和250 μM KH2PO4，每個處理包括4個生物學重復。處理21 d后，收獲地上部和根部樣品，測定生物量、根系性狀、磷含量和酸性磷酸酶活性。樣品于75℃烘干，待烘干到恒重時測定干重和磷含量。收取成熟葉片和根系材料，用液氮速凍，用于測定細胞壁磷含量以及酸性磷酸酶活性。

1.2.2葉片及根系性狀分析 通過掃描儀12000XL(EPSON，中國)掃描葉片和根系圖片，采用圖像分析軟件WinRhizo Pro(Regent Instruments，加拿大)計算葉面積、總根長、根表面積和根體積[25]。

1.2.3植株磷含量測定 將硬皮豆地上部和根系樣品置于烘箱中105℃殺青30 min，75℃烘干至恒重，將樣品磨碎，稱取0.1 g干樣，加入3 mL濃硫酸靜置過夜，375℃消煮2 h，然后參照Murphy和Riley[26]方法測定磷含量，即取500 μL上清液，加入0.5 mL鉬銻抗顯色液，再用ddH2O定容到5 mL，室溫反應30 min后，于分光光度計(Hitachi，日本)中測定OD700吸光值。

1.2.4可溶性磷含量測定 稱取0.16 g地上部或根部系樣品，加入預冷的1.2 mL 100 mM Tris-HCl(pH 7.0)提取液，充分研磨，4℃下12 000 rpm離心20 min，收集上清液。然后參照Murphy和Riley[26]用鉬銻抗顯色法測定磷含量。

1.2.5細胞壁分離和細胞壁磷含量測定 參考Zhu等[27]方法分離細胞壁，并作適當修改，即稱取0.15 g葉片和根系樣品，加入預冷的1 mL 75%乙醇充分研磨破碎組織細胞，冰浴20 min，4℃下12 000 rpm離心15 min后，去上清，收集沉淀。然后，依次用預冷的丙酮、乙醇/三氯甲烷混合液(v/v=1/1)、甲醇洗滌沉淀。每一步洗滌完成后，4℃下12 000 rpm離心15 min，并最終收集沉淀為細胞壁提取物。稱取5 mg細胞壁提取物，加入1 mL 2 mM HCl，于搖床上震蕩混勻48 h。4℃下14 000 rpm離心30 min，收集上清液。取100 μL上清液用鉬銻抗顯色法測定細胞壁磷含量。細胞壁磷含量以單位鮮重細胞壁(mg CW)所含的磷(μg P)來計算。

1.2.6細胞壁蛋白的提取以及酸性磷酸酶(ACP)活性測定 參照Farhadi等[21]方法提取細胞壁蛋白，稱取0.16 g樣品，加入預冷的1.5 mL 25 mM TES/KOH緩沖液(含10 mM MgCl2，1 mM EDTA，1 mM二硫酥糖醇，1% Triton X-100，1%聚乙烯吡咯烷酮，pH 7.4)充分研磨，4℃下14 000 rpm離心30 min收集沉淀，然后用TES/KOH緩沖液重復洗滌沉淀3次。4℃下14 000 rpm離心30 min收集沉淀。加入預冷的1.5 mL 0.5 mM醋酸/NaOH緩沖液(含0.2 M CaCl2，pH4.6)充分研磨，4℃下18 000 rpm離心30 min，收集蛋白上清液。參照Mehdi等[13]方法測定ACP活性，取100 μL蛋白上清液，加入1.8 mL磷酸酶底物緩沖液，緩沖液含有45 mM醋酸/醋酸鈉(pH 5.0)和1 mM對硝基苯磷酸環(huán)己胺(ρ-NPP)，補充ddH2O至反應體積2 mL，充分混勻，37℃反應15 min，然后加入1 mL 1 M NaOH溶液終止反應。12 000 rpm離心5 min，收集上清液，測定OD405吸光值，ACP活性以每分鐘每毫克蛋白水解ρ-NPP的量(μmol)計算。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進行平均數(shù)和標準誤計算，采用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件(V23.0，SPSS Institute，美國)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同磷濃度處理對硬皮豆地上部生長的影響

從圖1A可以看出，相對100 μM和250 μM磷處理，5 μM低磷處理抑制了硬皮豆地上部的生長和發(fā)育，主要表現(xiàn)為植株矮小、復葉數(shù)減少、葉片發(fā)育受阻。與100 μM和250 μM磷處理相比較，低磷(5 μM)處理下的硬皮豆株高分別降低31.2%和19.7%，復葉數(shù)減少47.4%和60%，葉面積減少28.4%和22.4%(圖1B-D)。另外，在100 μM磷處理下的株高和葉面積最大，而250 μM磷處理下的復葉數(shù)最多(圖1B-D)。以上結(jié)果表明，5 μM低磷脅迫顯著抑制了硬皮豆地上部的生長，而100～250 μM磷濃度處理能維持硬皮豆正常生長。

圖1 不同磷濃度處理對硬皮豆地上部生長的影響

2.2 不同磷濃度處理對硬皮豆根系生長的影響

由圖2A所示，5 μM磷處理抑制了硬皮豆根系的生長，主要抑制了總根長、根表面積和根體積。與100 μM和250 μM磷處理相比，5 μM磷處理下硬皮豆總根長分別下降30.7%和35.9%，根表面積減少32.4%和36.8%，根體積下降31.9%和37.9%(圖2B-D)。然而，5 μM磷處理促進了硬皮豆主根的生長，5 μM磷處理下的主根長是100 μM和250 μM磷處理下的1.2 倍(圖2E)。

圖2 不同磷濃度處理對硬皮豆根系生長的影響

2.3 不同磷處理對硬皮豆干重及磷含量的影響

由圖3所示，5 μM低磷處理顯著降低了硬皮豆地上部和根部干重。在5 μM磷處理下，硬皮豆地上部和根部干重分別只有250 μM磷處理下的37.7%和68.9%，而硬皮豆地上部或根部干重在100 μM和250 μM磷處理下，差異不顯著(圖3A和B)。此外，5 μM磷處理顯著降低了地上部和根部磷含量。與250 μM磷處理相比，5 μM磷處理下的地上部和根系含量分別減少了80.3%和77.3%(圖3C和D)。100 μM和250 μM磷處理間，地上部磷含量差異不顯著；然而，在250 μM磷處理下根部的磷含量是100 μM磷處理下的1.4倍(圖3C和D)。

圖3 不同磷處理對硬皮干重及磷濃度的影響

2.4 不同磷濃度處理對硬皮豆葉片和根系可溶性磷及細胞壁磷濃度的影響

本研究進一步比較分析了不同磷濃度處理對硬皮豆葉片和根系可溶性磷及細胞壁磷濃度的影響。結(jié)果表明，5 μM低磷處理顯著降低了硬皮豆葉片和根系的可溶性磷濃度(圖4)。5 μM磷處理下的葉片和根系可溶性磷濃度分別為250 μM磷處理下的10.4%和9.7%，然而，葉片或根系可溶性磷濃度在100 μM和250 μM磷處理下差異不顯著(圖4A和B)。同樣，5 μM磷處理顯著降低了葉片和根系細胞壁磷濃度。5 μM磷處理下的葉片和根系細胞壁濃度分別為250 μM磷處理下的2.1%和20.9%(圖4C和D)。此外，250 μM磷處理下葉片和根系細胞壁磷濃度顯著高于100 μM磷處理下的葉片和根系細胞壁磷濃度(圖4C和D)。

圖4 不同磷處理對硬皮豆可溶性磷及細胞壁磷濃度的影響

2.5 不同磷濃度處理對硬皮豆葉片和根系及其細胞壁ACP活性的影響

由圖5A和B可知，隨著磷處理濃度的增加，硬皮豆葉片和根系總ACP活性逐漸降低，5 μM磷處理顯著提高了葉片和根系ACP活性。在5 μM磷處理下，葉片、根系ACP活性分別是100 μM和250 μM磷處理下的1.4，1.6倍和1.4，1.5倍。硬皮豆葉片和根系細胞壁ACP活性隨磷處理濃度的增加而降低。在5 μM磷處理下，葉片細胞壁ACP活性最高，是250 μM磷條件下的1.2倍，而根系細胞壁ACP活性是250 μM磷條件下的1.3倍(圖5C和D)。

圖5 不同磷處理對崖州硬皮豆葉片和根系及其細胞壁ACP活性的影響

3 討論

磷是維持植物正常生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素之一，低磷脅迫抑制植物的生長和產(chǎn)量。本研究發(fā)現(xiàn)，相對100 μM和250 μM磷處理，5 μM低磷處理顯著抑制了硬皮豆的生長，降低了株高、復葉數(shù)和葉面積，并降低了植株干重(圖1-2)。同樣，低磷處理也抑制了小麥(Triticumaestivum)[28]、柳枝稷(Panicumvirgatum)[29]和玉米(Zeamays)[30]的生長，說明硬皮豆的生長受到外源磷有效性的影響。另外，100 μM和250 μM外源磷處理下硬皮豆地上部的磷含量差異不顯著，但是，100 μM磷處理下根部的磷含量顯著低于250 μM磷處理下的磷含量(圖3)。在玉米(Zeamays)中的研究也發(fā)現(xiàn)，磷被根系吸收后會向葉片轉(zhuǎn)運，并在葉片中積累[31]。因此，在低磷脅迫下，硬皮豆根系吸收的磷可能被轉(zhuǎn)運至地上部，優(yōu)先滿足地上部生長對磷素的需求。

在應對低磷脅迫過程中，植物形成了如改變根系形態(tài)構(gòu)型等適應性機制，進而增加了對土壤磷的吸收和利用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，在大豆和玉米中，低磷脅迫會促進主根的生長來擴大根系與土壤的接觸面積，從而提高磷的吸收效率[32-33]，而白羽扇豆(Lupinusalbus)會通過減少主根長度，增加側(cè)根數(shù)量和密度，并形成排根來應對低磷脅迫[34]。同樣，本研究發(fā)現(xiàn)，雖然5 μM低磷處理抑制了硬皮豆總根長、根表面積和根體積，但是，低磷處理促進了主根的生長(圖2)，這可能有利于硬皮豆吸收更多的磷。

在低磷脅迫下，植物可以通過分泌酸性磷酸酶來活化利用土壤和植物組織中的有機磷，從而增加細胞磷有效性[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，低磷處理顯著提高了硬皮豆葉片和根系總ACP活性(圖5)。同樣，低磷脅迫也顯著增加了水稻、大豆和鷹嘴豆等植物的ACP活性[18-20]。另外，隨著葉片和根系細胞壁磷有效性的降低，硬皮豆葉片和根系細胞壁ACP活性顯著提高(圖4和5)，暗示硬皮豆組織中的細胞壁磷可能被活化，并進一步被代謝活動所利用。在柱花草(Stylosanthesguianensis)中的研究發(fā)現(xiàn)，低磷脅迫顯著增加了葉片和根系細胞壁的ACP活性，且磷高效柱花草基因型中細胞壁ACP活性顯著高于磷低效柱花草基因型[35]。并且，在大豆和擬南芥中已經(jīng)鑒定到了多個細胞壁定位的ACP[19,36]。因此，增加ACP活性可能是硬皮豆適應低磷脅迫的重要生理變化。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)低磷脅迫抑制了硬皮豆的株高、復葉數(shù)、葉面積等，并降低了植株磷含量和細胞壁磷濃度，從而抑制植株的生長。在低磷脅迫條件下，硬皮豆可以通過促進主根生長、提高葉片和根系總酸性磷酸酶活性，以及增加葉片和根系細胞壁的酸性磷酸酶活性來適應低磷脅迫環(huán)境。增加酸性磷酸酶活性可能有利于硬皮豆對細胞中貯存磷的活化利用，從而滿足植株生長對磷元素的需求。本研究結(jié)果為選育磷高效利用的硬皮豆新品種提供了重要的理論依據(jù)。