夏雯，雷杰，段剛峰，鄭瓊莉

(武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，湖北 武漢 430022)

動(dòng)脈粥樣硬化(Atheroschlerosis,AS)是心、腦血管疾病的重要病因，以脂質(zhì)沉積，內(nèi)膜增厚及斑塊形成為主要表現(xiàn)。而內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷是AS形成初期的重要環(huán)節(jié)。內(nèi)皮細(xì)胞功能異常會(huì)引發(fā)血管損傷,引起AS的發(fā)生發(fā)展。B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白(Bcl-2)作為凋亡調(diào)控基因,對(duì)AS過程中的脂質(zhì)氧化應(yīng)激和炎癥發(fā)生起到重要作用。而過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與了脂質(zhì)代謝、炎癥及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生?！侗静菥V目》記載：蔥白治療“心急痛，牙關(guān)緊閉欲絕”，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)冠心病癥狀相近。蔥白提取物是從蔥科植物細(xì)香蔥(BulbusAlliiFistulosi)成熟莖下端蔥白中提取的活性成分，前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),蔥白提取物對(duì)急性心肌缺血大鼠心肌損傷具有保護(hù)作用[1-2]。本實(shí)驗(yàn)基于以上研究，擬建立動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型，觀察蔥白提取物對(duì)AS大鼠血管脂質(zhì)沉著及Bcl-2、PPARγ蛋白表達(dá)的影響，為進(jìn)一步闡明蔥白提取物抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)支撐。

1 材料

1.1 動(dòng)物

健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，40只，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供(動(dòng)物合格證編號(hào)：No.42000600000069)。動(dòng)物飼養(yǎng)于塑料籠內(nèi),每籠4只,自由飲用去離子水,室內(nèi)溫度為25℃,溫度為60%,水及飼料均經(jīng)過輻照消毒處理。

1.2 藥品及試劑

蔥白提取物(批號(hào)：20150326，武漢市中醫(yī)西結(jié)合醫(yī)院提供，經(jīng)微波干燥和超臨界萃取得到，干燥蔥白超臨界萃取的總得率在1.85%左右，主要含有含硫化合物、甾體、皂苷、不飽和脂肪酸等化合物，濃度為25%，配置成最終濃度為0.10 mg/mL的溶液)；辛伐他汀片(舒降之,批號(hào)：02001697，杭州默沙東制藥有限公司，配置成最終濃度為10 mg/mL的溶液)；膽固醇、膽酸鈉、丙基硫氧嘧啶和維生素D3粉劑(武漢宇陽(yáng)鋒銳生物科技有限公司)；其余試劑均為市售分析純。

1.3 儀器

低溫高速離心機(jī)(Sorvall Stratos，賽默飛，美國(guó))；超低溫冰箱(MDF-390AT， SANYO，日本)；組織包埋機(jī)(Leica公司，德國(guó))；組織切片機(jī)(Leica公司，德國(guó))；熒光顯微鏡(CX22，OLYMPUS公司，日本)；全自動(dòng)生化分析儀(AU2700，貝克曼公司，美國(guó))；垂直電泳儀(JY-SCZ，北京六一儀器廠)；凝膠圖像分析儀(EBOX CX5，Viber Lourmat公司，法國(guó))。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及模型制備

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、蔥白提取物組和辛伐他汀組,每組10只。大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液(3 mL/kg)麻醉，仰位固定，備皮后酒精消毒,頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎其遠(yuǎn)心端，向心臟方向插入1.5 F球囊，進(jìn)入4 cm后，向球囊內(nèi)注水使球囊充盈后回拉約2～3 cm，反復(fù)3次，使內(nèi)皮充分剝脫，完成后拔出球囊，結(jié)扎近心端血管，縫合切口。假手術(shù)組只進(jìn)行手術(shù)操作，但不插入球囊損傷，其他操作同各實(shí)驗(yàn)組。術(shù)后腹腔注射青霉素3天預(yù)防感染。假手術(shù)組正常飲水，模型組及各治療組給予高脂飼料(10%豬油、4%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶加入85.3%的全價(jià)基礎(chǔ)飼料)，并于手術(shù)后第3天于右下肢肌肉注射維生素D3針劑(3萬U/kg)。

2.2 給藥方法

造模后第1天起開始給藥，假手術(shù)組和模型組灌胃等量蒸餾水(10 mL/kg)，中藥組大鼠給予蔥白提取物1 mg/kg灌胃，西藥組給予辛伐他汀混懸液100 mg/kg灌胃，連續(xù)8周。

2.3 標(biāo)本取材與制備

實(shí)驗(yàn)第12周，各組動(dòng)物禁食過夜后麻醉動(dòng)物，腹主動(dòng)脈取血分離血清，保存在-80 ℃低溫冰箱備用。打開胸腔，在主動(dòng)脈弓起始段剪取1 cm主動(dòng)脈標(biāo)本，10%多聚甲醛溶液固定12 h。另取3 cm胸主動(dòng)脈標(biāo)本，去除脂肪組織，生理鹽水沖洗后置于-80 ℃低溫冰箱中凍存。

2.4 血脂水平檢測(cè)

采用全自動(dòng)生化分析儀，分析血清標(biāo)本，檢測(cè)血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)。

2.5 主動(dòng)脈脂質(zhì)沉積情況觀察

將固定的胸主動(dòng)脈標(biāo)本用蒸餾水沖洗后，用油紅O脂肪染色法，分析組織切片中的中性甘油三酯、脂質(zhì)以及脂蛋白等脂質(zhì)狀況。

2.6 Bcl-2、PPARγ蛋白表達(dá)的檢測(cè)

將凍存?zhèn)溆玫臉?biāo)本取出提取組織總蛋白,并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用 5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h, 分別加入對(duì)應(yīng)一抗,4 ℃搖床孵育過夜, 次日棄去一抗, 洗滌后加入山羊兔二抗，室溫孵育1 h, 洗滌后滴加HRP化學(xué)發(fā)光底物，孵育5 min,用計(jì)算機(jī)圖形分析軟件(Uvpgr32掃描，Gelw4d分析)自動(dòng)分析圖形的大小和灰度。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血脂水平比較

結(jié)果如表1所示，與假手術(shù)組比較，模型組血清TC、TG、LDL-C的濃度明顯升高，而HDL-C濃度則顯著降低，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，蔥白提取物組能夠降低血清TC、TG、LDL-C濃度水平而升高血清中HDL-C的濃度，同時(shí)陽(yáng)性對(duì)照組與蔥白提取物組結(jié)果一致，也能顯著改善血清血脂代謝水平，兩組與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05)。蔥白提取物組與辛代他汀組之間未見顯著性差異(P>0.05)。

表1 蔥白提取物對(duì)大鼠血脂水平的影響

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

3.2 病理組織學(xué)檢測(cè)

如圖1所示，與假手術(shù)組比較，模型大鼠胸主動(dòng)脈血管壁有大量的脂質(zhì)沉積，血管壁脂肪含量顯著增加。和模型組比較，蔥白提取物組和辛伐他汀組血管壁中脂質(zhì)沉積顯著減少，其中蔥白提取物組減少更顯著。

注:A.假手術(shù)組；B.模型組；C.辛伐他汀組；D.蔥白提取物組。圖1 各組大鼠血管壁檢查(油紅染色，×400)

3.3 蔥白提取物對(duì)Bcl-2、PPARγ蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果如表2、圖2所示，模型組胸主動(dòng)脈組織中Bcl-2、PPARγ蛋白表達(dá)水平均顯著低于假手術(shù)組(P<0.05),而蔥白提取物組和辛伐他汀組能夠上調(diào)Bcl-2、PPARγ蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，蔥白提取物組和辛伐他汀組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。

表2 蔥白提取物對(duì)大鼠Bcl-2、PPARγ表達(dá)的比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

圖2 各組大鼠主動(dòng)脈Bcl-2、PPARγ蛋白表達(dá)水平

4 討論

中醫(yī)學(xué)中沒有動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可歸屬于“胸痹”的范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,胸痹病因多樣，病機(jī)復(fù)雜，漢代張仲景提出其病機(jī)為“陽(yáng)微陰弦”,“陽(yáng)微”即本質(zhì)屬陽(yáng)氣不足，血行不暢，“陰弦”即痰濁、瘀血等病理產(chǎn)物為患。AS過程中斑塊形成多與脂質(zhì)代謝異常相關(guān)，屬于中醫(yī)學(xué)“痰濁”范疇，而“辛溫通陽(yáng)”是治療胸痹的根本方法，陽(yáng)氣一通，痰瘀得散，則心痛可除。蔥白作為辛溫通陽(yáng)的代表中藥，《本草綱目》言：“卒心急痛，牙關(guān)緊閉欲絕，以老蔥白五莖去皮須，搗膏，以匙送入咽中，灌以麻油四兩，但得下咽即蘇。”指出單用蔥白一味即可治療胸痹，緩解心痛?！侗静萁?jīng)集注》也記載：“蔥白以升陽(yáng)，云通者，一以溫之而令陽(yáng)氣得入，一以發(fā)之而令陰氣易散也?！?/p>

在AS形成的過程中，血脂水平異常對(duì)于AS發(fā)展以及心血管病發(fā)生有重要的預(yù)測(cè)意義。臨床最常見的TC、TG、LDL-C和HDL-C血脂指標(biāo)在AS斑塊的形成及進(jìn)展中較為關(guān)鍵。LDL-C水平可以加速AS的發(fā)展，LDL-C作為TC的主要載體，血清中升高的LDL-C經(jīng)過氧化后形成氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)，會(huì)促進(jìn)AS的發(fā)生[3-4]。而HDL-C可以影響膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能、抗炎、抗血栓和促纖溶等多途徑共同發(fā)揮抗AS的作用[5-6]。TC自身在血液循環(huán)中極易沉積在動(dòng)脈壁上，并隨著動(dòng)脈壁細(xì)胞增生和纖維細(xì)胞堆積形成粥樣硬化斑塊[7]。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，AS大鼠的血脂水平出現(xiàn)明顯異常，表現(xiàn)為血清中TC、TG、LDL-C的濃度明顯升高，而HDL-C濃度則顯著降低，同時(shí)油紅O染色發(fā)現(xiàn)AS大鼠胸主動(dòng)脈血管壁有大量的脂質(zhì)沉積，血管壁脂肪含量顯著增加。而蔥白提取物可以改善AS大鼠血脂水平，降低TC、TG、LDL-C的濃度而升高HDL-C濃度，同時(shí)減少血管壁脂質(zhì)沉積，說明辛溫通陽(yáng)中藥蔥白可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，減少內(nèi)膜脂質(zhì)的形成, 起到抑制AS形成的作用。

Bcl-2作為一種細(xì)胞因子，主要參與細(xì)胞凋亡的線粒體途徑，其表達(dá)增加可引起細(xì)胞增殖，表達(dá)下調(diào)則導(dǎo)致凋亡[8]。研究表明,在AS斑塊中，Bcl-2參與血管平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的凋亡過程，特別是對(duì)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要作用[9-10]。而過氧化物酶體增殖物激活受體 (PPARγ) 近年來也被發(fā)現(xiàn)與AS發(fā)生密切相關(guān)，主要表現(xiàn)在血管炎癥反應(yīng)和影響血管硬化的病理過程，主要通過調(diào)控脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝, 調(diào)控糖穩(wěn)態(tài)及胰島素敏感性以及抗炎、抗增殖活性來發(fā)揮作用[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，AS大鼠胸主動(dòng)脈組織中Bcl-2、PPARγ蛋白表達(dá)水平是明顯降低的，而通過蔥白提取物干預(yù)后，AS大鼠Bcl-2、PPARγ蛋白表達(dá)水平明顯升高，與陽(yáng)性對(duì)照組辛伐他丁的作用結(jié)果一致，說明蔥白提取物調(diào)節(jié)脂代謝，改善AS進(jìn)展水平可能與調(diào)控Bcl-2、PPARγ蛋白表達(dá)水平有關(guān)。但蔥白提取物發(fā)揮作用的具體機(jī)制仍未明確，這將是實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)下一步的研究目標(biāo)。