鄧聰 ，楊志敏，徐福平 ，孫玉姣，陳玉狀，賴艷嫻，岑美婷

(1.廣州市第一人民醫(yī)院南沙醫(yī)院，廣東 廣州 511457；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510120)

衰老對(duì)所有生物而言都是不可避免的，社會(huì)人口老齡化已是各國(guó)面臨的嚴(yán)峻問(wèn)題。據(jù)2011～2015年統(tǒng)計(jì)，我國(guó)≥60歲老年人口比重由13.3%增加到16%，并以每年3%的速度增長(zhǎng)，是同期其他人口增長(zhǎng)速度的5倍[1]。隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體的骨骼肌質(zhì)量也隨之減少，主要表現(xiàn)為肌肉體積、橫斷面積以及肌纖維數(shù)量的變少，出現(xiàn)老年性骨骼肌減少癥，又稱肌肉減少癥(Sarcopenia)。肌肉減少癥是衰老過(guò)程中發(fā)生的主要變化[2]，因此，從骨骼肌萎縮角度研究人體衰老的防治具有重要意義[3]。黃芪具有益氣生肌的作用，廣泛用于各補(bǔ)益類方劑中，黃芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)是其主要生物活性成分之一?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪有良好的抗氧化、增強(qiáng)免疫、抗衰老等作用[4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究APS對(duì)骨骼肌成肌細(xì)胞的增殖作用，為課題組的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小鼠C2C12骨骼肌細(xì)胞(中科院細(xì)胞庫(kù))；APS(美國(guó)泛華生物公司)；新生胎牛血清(四季青生物工程研究所)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)；地塞米松、MTT(Sigma公司)。

1.2 細(xì)胞制備

C2C12骨骼肌細(xì)胞用含10%新生胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)(37℃，5% CO2，95%濕度)，觀察細(xì)胞肌管分化情況，以兩核以上呈串珠樣的肌管達(dá)80%以上為肌管分化成功。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將分化成功的C2C12骨骼肌成肌細(xì)胞(以下稱成肌細(xì)胞)以5×104個(gè)/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板，每實(shí)驗(yàn)組6個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，按APS不同濃度分為0.1、0.2、0.4、0.8和1 mg/mL 5組；按DEX不同濃度分為1、10、100和1 000 μM 4組，并設(shè)正常對(duì)照組。培養(yǎng)12 h、24 h。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的APS、DEX濃度，再分為3組進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)(DEX組、DEX+APS組、正常對(duì)照組)培養(yǎng)24 h。

1.4 成肌細(xì)胞增殖率和抑制率

用MTT法檢測(cè)，將每孔的上清吸棄，分別加入50 μL MTT，放置于37 ℃溫育4 h，然后吸棄上清，每孔加入200 μL DMSO，振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上用570 nm波長(zhǎng)測(cè)各孔OD值。并設(shè)調(diào)零孔。

細(xì)胞增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-調(diào)零組OD值)/(對(duì)照組OD值-調(diào)零組OD值)×100%

細(xì)胞抑制率(%)=(1-細(xì)胞增殖率)×100%

1.5 成肌細(xì)胞肌管橫徑

成肌細(xì)胞用玻片培養(yǎng)，甲醛固定，HE染色，用200倍光鏡隨機(jī)依次選取左上、右上、左下、右下和中間5個(gè)視野進(jìn)行觀察，結(jié)果用Image Pro-Plus 6.0軟件分析。橫徑為細(xì)胞核到肌管邊緣的最短距離。

1.6 成肌細(xì)胞凋亡率

用AnnexinV-FITC凋亡試劑盒檢測(cè)。胰酶消化細(xì)胞后，PBS洗滌2次，計(jì)數(shù)取1×106個(gè)/mL細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL碘化丙啶，避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 APS對(duì)成肌細(xì)胞增殖的影響

兩時(shí)間段OD值，除0.8 mg/mL APS組外，其余APS濃度組與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。兩時(shí)間段增殖率，與對(duì)照組比較，APS分別為0.1、0.2、0.4、0.6 mg/mL時(shí)增殖率均升高(P<0.05)；APS為0.8 mg/mL時(shí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；APS為1 mg/mL時(shí)增殖率下降(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。圖1 不同濃度APS對(duì)成肌細(xì)胞OD值的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。圖2 不同濃度APS對(duì)成肌細(xì)胞增殖率的影響

2.2 DEX對(duì)成肌細(xì)胞抑制的影響

與兩個(gè)時(shí)間段對(duì)照組比較，DEX為100、1 000 μM時(shí)OD值均降低而抑制率均升高(P<0.05)；DEX為10 μM時(shí)OD值及抑制率，24 h時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，12 h時(shí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；DEX為1μM時(shí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。圖3 不同濃度DEX對(duì)成肌細(xì)胞OD值的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。圖4 不同濃度DEX對(duì)成肌細(xì)胞抑制率的影響

2.3 各組成肌細(xì)胞OD值和成肌細(xì)胞肌管橫徑的比較

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，選取APS 0.2 mg/mL，DEX 100 μM為干預(yù)濃度。與對(duì)照組OD值比較，12 h內(nèi)DEX組、APS+DEX組及24 h內(nèi)DEX組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，24h內(nèi)APS+DEX組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

與對(duì)照組比較，DEX組肌管橫徑下降(P<0.05)，APS+DEX組無(wú)差異(P>0.05)。APS+DEX組與DEX組肌管橫徑比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 各組對(duì)成肌細(xì)胞凋亡率的比較

與對(duì)照組比較，DEX組和APS+DEX組細(xì)胞凋亡率均上升(P<0.05)。APS+DEX組和DEX組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1和圖5。

3 討論

衰老是一個(gè)綜合表現(xiàn)，包括身體、認(rèn)知及精神等方面。人體的肌肉骨骼系統(tǒng)，如肌肉、骨頭和關(guān)節(jié)等均受到衰老的影響，萎縮的骨骼肌會(huì)影響身體機(jī)能[5]。肌肉減少癥是一種以老年人骨骼肌質(zhì)量、肌量、功能下降為主要表現(xiàn)的病癥。隨著機(jī)體年齡增長(zhǎng)，骨骼肌的結(jié)構(gòu)和功能也發(fā)生退變，從而加速了神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)以及其他組織器官的衰老[6]。研究已證實(shí)肌肉減少癥與不良結(jié)局相關(guān)，如跌倒、殘疾、住院、長(zhǎng)期護(hù)理、生活質(zhì)量變差和死亡率等，這些都表明防治肌肉減少癥對(duì)老年人保健的重要性[2]。

表1 各組成肌細(xì)胞OD值、凋亡率、肌管橫徑的比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與DEX組比較，#P<0.05。

圖5 各組凋亡圖

目前體育鍛煉和營(yíng)養(yǎng)支持被認(rèn)為是預(yù)防和治療與年齡相關(guān)的肌肉異常的基礎(chǔ)[7],但缺乏有效的治療方法[8]。肌肉減少癥可歸屬于中醫(yī)學(xué)“虛弱”“痿證”等范疇，以年老體弱，脾腎氣虛為主要病機(jī)，而益氣健脾、補(bǔ)養(yǎng)后天是關(guān)鍵。補(bǔ)氣藥黃芪見(jiàn)于各經(jīng)典補(bǔ)益方中，具有補(bǔ)氣生肌、固表、托毒排膿等功效。APS是黃芪的主要活性成分，含量高達(dá)50%以上。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，APS對(duì)正常成肌細(xì)胞有良好的增殖作用。在0.6 mg/mL濃度以下增殖率顯著提高，并在0.2 mg/mL達(dá)到峰值，提示0.2 mg/mL是APS的最佳實(shí)驗(yàn)濃度，而在0.8 mg/mL之后則出現(xiàn)抑制，這可能與濃度過(guò)高產(chǎn)生細(xì)胞毒性有關(guān)。

成肌細(xì)胞萎縮模型的建立，動(dòng)物模型主要通過(guò)去神經(jīng)或代謝營(yíng)養(yǎng)等因素實(shí)現(xiàn)，細(xì)胞模型則主要通過(guò)化學(xué)或生物制劑干預(yù)，如TNF-α、DEX和睪丸酮等。研究表明,在誘導(dǎo)C2C12肌管萎縮時(shí)，DEX的效果可能更優(yōu)[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，100 μM以上濃度的DEX對(duì)成肌細(xì)胞有顯著的抑制作用，24 h抑制率分別為100 μM 38%、1 000 μM 54%，本實(shí)驗(yàn)選取100 μM濃度進(jìn)行成肌細(xì)胞萎縮模型造模。在給予0.2 mg/mL APS干預(yù)24 h后，細(xì)胞OD值和肌管橫徑均升高(P<0.05)，凋亡率下降(P<0.05)，提示APS對(duì)防治肌肉減少癥有一定的作用，但具體的機(jī)制有待下一步的研究。