張 蕊，常 娜，陳 超，趙 萌，李 博

(1.唐山市人民醫(yī)院藥劑科，河北 唐山 063000； 2.唐山市人民醫(yī)院放化五科，唐山市腫瘤放射治療學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山 063000； 3.遵化市人民醫(yī)院病理科，河北 遵化064299)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)為常見的消化道腫瘤，手術(shù)、化療和放療是治療CRC的主要方法，但是臨床發(fā)現(xiàn)CRC患者機(jī)體可能處于高凝狀態(tài)，并且手術(shù)和化療均可能誘導(dǎo)高凝狀態(tài)，這不但會(huì)影響預(yù)后，還會(huì)增加肺栓塞的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[1]。辛伐他汀能夠通過抑制3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)而降低膽固醇，被廣泛用于治療高膽固醇血癥，且安全性良好。近年來，有研究報(bào)道HMGCR與腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)[2]。細(xì)胞和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，辛伐他汀可以抑制CRC細(xì)胞的增殖和血管生成能力[3]。但其分子機(jī)制仍不清楚。此外，有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀具有緩解高凝狀態(tài)的作用[4]。但其是否具有緩解CRC高凝狀態(tài)的作用仍不明確。核因子κB(NF-κB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活均會(huì)誘導(dǎo)其靶基因的過表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)血管生成，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移；同時(shí)，NF-κB通路與機(jī)體凝血過程和高凝狀態(tài)密切相關(guān)[5-6]。微小RNA(miRNA)可以通過靶向信使RNA(mRNA)的3′非翻譯區(qū)(UTR)誘導(dǎo)mRNA降解，研究結(jié)果已證實(shí)miR-181在CRC中具有促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用[7]；并且，miR-181也可以靶向抑制NF-κB通路[8]。本研究主要探討辛伐他汀對(duì)CRC模型小鼠腫瘤生長(zhǎng)、血液高凝狀態(tài)和血管生成情況的影響，并檢測(cè)miR-181/NF-κB的變化，初步分析分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞：BALB/C裸鼠購(gòu)自中國(guó)上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；人CRC細(xì)胞系SW480(CCL-228細(xì)胞，美國(guó)ATCC公司)。

1.1.2 儀器：MVIS-2035型全自動(dòng)血液流變分析儀(重慶天海醫(yī)療設(shè)備有限公司)；ABI7900型PCR儀(美國(guó)ABI公司)；CX31型顯微鏡[奧林巴斯(中國(guó))有限公司]。

1.1.3 藥品與試劑：DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；ECL顯色試劑盒購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TRIzol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；MiScript SYBR-Green PCR和miScript kit試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN GmbH公司；SYBR Premix Ex Taq和PrimeScript-RT試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；細(xì)胞周期蛋白 D1(CyclinD1)、Ki67和B細(xì)胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體和相應(yīng)的二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；辛伐他汀(江西大地制藥有限責(zé)任公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20059672)。

1.2 分組和建模

將BALB/C裸鼠分為三組，即對(duì)照組、辛伐他汀低劑量組和辛伐他汀高劑量組。將DMEM培養(yǎng)基中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞重新配置成濃度為1×107個(gè)/mL的溶液，所有小鼠于左側(cè)前肢皮下注射細(xì)胞溶液0.2 mL，給藥后第7日可以觸摸到有瘤體生成提示建模成功。第8日，辛伐他汀低、高劑量組小鼠分別腹腔注射辛伐他汀50、100 mg/kg，1日1次。第28日，小鼠稱重后記錄體重，然后于小鼠眼眶靜脈取血，頸椎脫臼處死小鼠，取出腫瘤組織。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.3.1 腫瘤生長(zhǎng)情況：觀察并記錄腫瘤生長(zhǎng)情況，第28日統(tǒng)計(jì)腫瘤體積。用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體長(zhǎng)徑和短徑，腫瘤體積= [(長(zhǎng)徑×短徑)/2]3×0.523 6。建模后28 d處死小鼠，收集腫瘤組織稱取重量。

1.3.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白水平：腫瘤組織研磨后收集總蛋白并通過BCA試劑盒檢測(cè)濃度。應(yīng)用SDS-PAGE(110 V，100 min)分離30 μg的總蛋白。PVDF膜轉(zhuǎn)移，添加對(duì)應(yīng)的抗體(1∶500稀釋)，孵育過夜。室溫(25 ℃)下加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000稀釋)，4 ℃孵育2 h。采用ECL檢測(cè)蛋白印跡帶。GAPDH作為內(nèi)參。通過檢測(cè)灰度分析CyclinD1、Ki67、Bcl-2和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)水平。CyclinD1、Ki67表達(dá)水平反映腫瘤細(xì)胞增殖水平，Bcl-2、Bax表達(dá)水平反映腫瘤細(xì)胞凋亡水平。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色：采用免疫組化染色檢測(cè)血管標(biāo)志蛋白CD34，分析腫瘤組織中的微血管密度[9]。腫瘤組織固定脫水，石蠟包埋，切片(4 μm)。加入3%H2O2，室溫靜置20 min，加入CD34抗體(1∶400稀釋)，37 ℃孵育1 h；洗滌后加入山羊抗兔IgG聚合物100 μL于室溫下孵育50 min；洗滌后加入DAB顯色液，蘇木精染色孵育20 s，沖洗后顯微鏡觀察，檢測(cè)染色部位面積占總視野面積的比例，計(jì)算百分比為微血管密度。檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的方法同CD34，通過半定量法確定染色強(qiáng)度，根據(jù)染色深淺評(píng)分為0～3分，根據(jù)染色范圍評(píng)分為0～4分，兩者相乘得到最終免疫組化得分。

1.3.4 定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)miR-181、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)和NF-κB mRNA表達(dá)：通過TRIzol試劑盒提取腫瘤組織總RNA，利用miScript試劑盒將miR-181合成互補(bǔ)DNA，采用MiScript SYBR-Green PCR試劑盒進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，內(nèi)參為U6。采用SYBR Premix Ex TaqTM和PrimeScript-RT試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(反應(yīng)條件：60 min/42 ℃，5 min/70 ℃，4 ℃下保存)和qPCR(反應(yīng)條件：95 ℃/10 min，40個(gè)循環(huán)，94 ℃/15 s，60 ℃/1 min，60 ℃/1 min，4 ℃下保存)實(shí)驗(yàn)，內(nèi)參為GAPDH。通過比較循環(huán)閾值(ΔΔCt)分析RNA的表達(dá)水平。

1.3.5 CRC模型小鼠凝血功能檢測(cè)：留取小鼠血液樣本，采用全自動(dòng)動(dòng)物血液分析儀檢測(cè)活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)和全血黏度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 辛伐他汀對(duì)CRC模型小鼠腫瘤的影響

建模后第28日，辛伐他汀高劑量組小鼠的腫瘤體積和重量明顯低于辛伐他汀低劑量組，且辛伐他汀高、低劑量組小鼠的腫瘤體積和重量明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 辛伐他汀對(duì)CRC裸鼠腫瘤體積和重量的影響

2.2 辛伐他汀對(duì)CRC裸鼠模型細(xì)胞增殖的影響

辛伐他汀高劑量組小鼠Ki67、CyclinD1蛋白水平明顯低于辛伐他汀低劑量組，且辛伐他汀高、低劑量組小鼠Ki67、CyclinD1蛋白水平明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、表2。

表2 辛伐他汀對(duì)CRC裸鼠CyclinD1和Ki67蛋白的影響

A.對(duì)照組；B.辛伐他汀低劑量組；C.辛伐他汀高劑量組A. control grou; B. simvastatin low-dose group; C. simvastatin high-dose group

2.3 辛伐他汀對(duì)CRC模型裸鼠細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

抗凋亡蛋白Bcl-2和凋亡蛋白Bax檢測(cè)結(jié)果表明，辛伐他汀高劑量組小鼠腫瘤組織中Bax表達(dá)水平明顯高于辛伐他汀低劑量組，而Bcl-2表達(dá)水平明顯低于辛伐他汀低劑量組；且辛伐他汀高、低劑量組小鼠腫瘤組織中Bax表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，而Bcl-2表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2、表3。

A.對(duì)照組；B.辛伐他汀低劑量組；C.辛伐他汀高劑量組A.control grou; B.simvastatin low-dose group; C.simvastatin high-dose group

表3 辛伐他汀對(duì)CRC裸鼠Bcl-2和Bax蛋白的影響

2.4 辛伐他汀對(duì)CRC裸鼠模型微血管密度的影響

辛伐他汀高劑量組小鼠微血管密度明顯低于辛伐他汀低劑量組，且辛伐他汀高、低劑量組小鼠微血管密度均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3、表4。圖3中，藍(lán)色為細(xì)胞核，棕色為CD34陽(yáng)性染色，表示微血管。

A.對(duì)照組；B.辛伐他汀低劑量組；C.辛伐他汀高劑量組A.control grou; B.simvastatin low-dose group; C.simvastatin high-dose group

表4 辛伐他汀對(duì)CRC裸鼠微血管密度的影響

2.5 辛伐他汀對(duì)CRC裸鼠模型VEGF的影響

辛伐他汀高劑量組小鼠VEGF水平明顯低于辛伐他汀低劑量組，且辛伐他汀高、低劑量組小鼠VEGF水平均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4、表5。圖4中，藍(lán)色為細(xì)胞核，棕色為VEGF陽(yáng)性顏色。

A.對(duì)照組；B.辛伐他汀低劑量組；C.辛伐他汀高劑量組A. control grou; B. simvastatin low-dose group; C. simvastatin high-dose group

表5 辛伐他汀對(duì)CRC裸鼠VEGF水平的影響分)

2.6 辛伐他汀對(duì)CRC裸鼠模型血液流變學(xué)指標(biāo)的影響

三組小鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，辛伐他汀低、高劑量組小鼠的全血黏度降低，PT和APTT延長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且辛伐他汀高劑量組小鼠的全血黏度低于辛伐他汀低劑量組，PT和APTT長(zhǎng)于辛伐他汀低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表6。

表6 辛伐他汀對(duì)CRC裸鼠血液流變學(xué)指標(biāo)的影響

2.7 辛伐他汀對(duì)CRC裸鼠模型miR-181、IκBα和NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)的影響

三組小鼠miR-181、IκBα和NF-κB mRNA表述水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。辛伐他汀低、高劑量組小鼠的miR-181表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，IκBα和NF-κB mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；

且辛伐他汀高劑量組小鼠的miR-181表達(dá)水平顯著高于辛伐他汀低劑量組，IκBα和NF-κB mRNA表達(dá)水平顯著低于辛伐他汀低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表7。三組小鼠IκBα和NF-κB蛋白表述水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。辛伐他汀高劑量組小鼠NF-κB、IκBα蛋白表達(dá)水平低于低劑量組，辛伐他汀低、高劑量組小鼠的IκBα和NF-κB 蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5、表8。

表7 辛伐他汀對(duì)CRC裸鼠IκBα、NF-κB mRNA表達(dá)的影響

表8 辛伐他汀對(duì)CRC裸鼠IκBα、NF-κB蛋白表達(dá)的影響

A.對(duì)照組；B.辛伐他汀低劑量組；C.辛伐他汀高劑量組A.control grou; B.simvastatin low-dose group; C.simvastatin high-dose group

3 討論

一項(xiàng)全球性的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，2018年結(jié)腸和直腸原發(fā)性腫瘤患者分別為1 096 601例和704 376例，分別占所有腫瘤患者的6.1%和3.9%，分別居第4位和第8位；每年死于結(jié)腸癌和直腸癌的患者分別占所有腫瘤患者的5.8%和3.2%，分別居第5位和第10位[10]。雖然新的診斷和治療CRC的方法被不斷應(yīng)用于臨床，但是CRC患者的生存情況仍不能令人滿意。在臨床上，CRC轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致治療失敗的主要因素，會(huì)使生存率降低。此外，CRC患者的高凝狀態(tài)也會(huì)顯著影響手術(shù)預(yù)后[11]。但目前臨床上尚無可以有效抑制CRC和緩解高凝狀態(tài)的特效藥物。

有研究結(jié)果顯示，他汀類藥物具有抗腫瘤作用，與未使用他汀類藥物者相比，使用他汀類藥物者的全因死亡率和惡性腫瘤特異性死亡率降低了15%[12]。臨床前研究結(jié)果表明，辛伐他汀在抑制腫瘤增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移中起著重要的作用[13-14]。本研究通過皮下注射的方法構(gòu)建了CRC小鼠模型，并通過辛伐他汀干預(yù)，發(fā)現(xiàn)辛伐他汀能夠抑制細(xì)胞增殖，減少血管生成，抑制腫瘤組織生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，并存在一定的劑量依賴性。HMGCR為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留酶，研究結(jié)果顯示，其可以促進(jìn)腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移[15]。作為HMGCR抑制劑，辛伐他汀在CRC中也發(fā)揮抑癌作用。一項(xiàng)單臂Ⅱ期臨床研究結(jié)果顯示，在XELOX方案(卡培他濱+奧沙利鉑)和貝伐單抗的基礎(chǔ)上聯(lián)合辛伐他汀作為CRC患者一線化療方法，具有優(yōu)秀的抗腫瘤效果[16]。血管生成是CRC細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，腫瘤細(xì)胞會(huì)通過新生的血管系統(tǒng)進(jìn)入血液循環(huán)，并定植于肺部等部位[17]。Wang等[18]的研究結(jié)果顯示，辛伐他汀可激活A(yù)MP活化蛋白激酶通路和抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α的水平，抑制乳腺癌的血管生成。此外，辛伐他汀還具有抗凝作用。趙濤等[19]的研究結(jié)果顯示，辛伐他汀可以降低急性心肌梗死患者的全血黏度，延長(zhǎng)PT。有研究結(jié)果顯示，口服辛伐他汀會(huì)明顯降低接受結(jié)直腸手術(shù)患者的高凝狀態(tài)[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可以劑量依賴性地抑制CRC細(xì)胞的增殖和血管生成，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制小鼠模型的腫瘤生長(zhǎng)，并且可以劑量依賴性地緩解CRC模型小鼠的高凝狀態(tài)，但其分子機(jī)制仍需進(jìn)一步分析。

基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制是近年來的研究熱點(diǎn)，miRNA可通過堿基配對(duì)識(shí)別并結(jié)合mRNA，進(jìn)而誘導(dǎo)mRNA的降解或者抑制翻譯[21]。miR-181是近年來新發(fā)現(xiàn)的與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的miRNA，研究結(jié)果顯示，其具有抑制結(jié)直腸腫瘤進(jìn)展的作用[22]。體外研究結(jié)果也證實(shí)，miR-181會(huì)抑制CRC細(xì)胞的增殖[23]。miR-181具有靶向調(diào)控NF-κB通路的作用，如卵巢癌中，miR-181通過抑制NF-κB通路蛋白水平發(fā)揮抗腫瘤作用[24]。Zhu等[25]的研究結(jié)果顯示，miR-181通過抑制NF-κB通路調(diào)控炎癥反應(yīng)。研究結(jié)果顯示，在2型糖尿病患者中，血漿miR-181與凝血狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)，miR-181會(huì)調(diào)控D-二聚體的水平并緩解高凝狀態(tài)和減少血栓形成[26]。NF-κB信號(hào)通路參與脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凝血和纖溶因子表達(dá)異常，從而導(dǎo)致高凝狀態(tài)[27]。王慧蓮等[28]的研究結(jié)果顯示，NF-κB會(huì)通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)，引起類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血液高凝狀態(tài)，而miR-155通過靶向調(diào)控NF-κB通路緩解高凝狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，辛伐他汀可以促進(jìn)miR-181表述，抑制NF-κB通路中IκBα、NF-κB mRNA和蛋白的水平，且呈劑量依賴性。提示辛伐他汀可能通過誘導(dǎo)miR-181的表達(dá)和抑制NF-κB通路來抑制CRC小鼠模型的腫瘤生長(zhǎng)和血管生成，并緩解高凝狀態(tài)。

綜上所述，在CRC裸鼠模型中，辛伐他汀不但可以誘導(dǎo)CRC細(xì)胞的凋亡和抑制血管生成，還可以緩解高凝狀態(tài)，其作用可能與miR-181/NF-κB有關(guān)。但是，關(guān)于辛伐他汀在CRC中的作用和調(diào)控miR-181/NF-κB的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。