俞忠明

1.浙江省中醫(yī)藥研究院 杭州 310007 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)

肝纖維化是病毒性肝炎、酒精性肝病、脂肪肝等多種慢性肝臟疾病發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)之路。肝硬化以門(mén)靜脈高壓和肝功能減退為臨床特征，最終以并發(fā)消化道出血、肝性腦病、繼發(fā)感染、癌變等而死亡[1]。因此，控制慢性肝臟疾病，特別是有效防治肝纖維化的進(jìn)展，對(duì)于控制病情進(jìn)展、降低死亡率具有重要意義。中醫(yī)認(rèn)為，肝纖維化的發(fā)生發(fā)展與痰瘀互結(jié)密切相關(guān)，本研究應(yīng)用名中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方“化痰行瘀湯”，在前期的臨床與實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)其治療肝纖維化具有較好療效。近幾年來(lái)，對(duì)肝纖維化發(fā)病機(jī)制有新的認(rèn)識(shí)，本課題重點(diǎn)研究脂質(zhì)過(guò)氧化在肝纖維化防治中的作用機(jī)制，期望進(jìn)一步闡明化痰行瘀湯抗纖維化作用的新途徑和新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量180～220g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011。實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地為浙江省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2014-0003。動(dòng)物飼養(yǎng)室溫度為22℃～26℃，濕度為40%～70%。12h日光燈照射，自由飲食飲水。

1.1.2 受試試劑和藥物 “化痰行瘀湯”方為：澤瀉30g，浙貝 15g，桃仁 10g，丹參 10g，赤芍 10g，郁金10g。由浙江省立同德醫(yī)院第二門(mén)診部提供，加水量8倍，溫度100℃，提取2次，每次1.5小時(shí)，提取液濃縮成生藥濃度為1g/mL的溶液。復(fù)方鱉甲軟肝片購(gòu)自內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase,AST）、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Ⅲ型前膠原（rocollagenⅢ，PCⅢ）、Ⅳ型膠原（collagen iv，Ⅳ-C）、透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）、層黏連蛋白（laminin，LN）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（lutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組、造模及干預(yù) 72只大鼠按體重隨機(jī)分為正常組、模型組、化痰行瘀湯高、中、低劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組共6組，每組12只。除正常組外，其余各組均用腹腔注射CCL4制備肝纖維化模型。腹腔注射約 0.6mL（按 2mL/kg）40%（v/v）的 CCL4（溶于蓖麻油中），每周2次，共10周。根據(jù)以往研究經(jīng)驗(yàn)，造模5周后即可形成肝纖維化。各治療組于第6周給藥，每天灌胃1次?；敌叙鰷锤?、中、低（17.85g/kg/d、8.925g/kg/d、4.464g/kg/d）劑量灌胃，模型組給予生理鹽水6.3mL/(kg·d)灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組給予復(fù)方鱉甲軟肝片8mg/(kg·d)灌胃。至第10周結(jié)束。實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠均給予相同標(biāo)準(zhǔn)的飼料和飲用水，并觀察記錄生存和一般狀況。

1.2.2 肝臟、脾臟指數(shù)測(cè)算及病理變化觀察 末次給藥后，禁食不禁水12h。大鼠處死前稱體重，取肝臟和脾臟，在濾紙上輕輕拭干后立即稱重，記錄肝重和脾重。肝臟指數(shù)（%）=肝臟質(zhì)量（mg）／體質(zhì)量（g）×100%，脾臟指數(shù)（%）=脾臟質(zhì)量（mg）／體質(zhì)量（g）×100%。

各組均取肝葉中部用甲醛溶液固定，伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色，觀察其病理變化。將肝纖維化分為0～4級(jí)，0級(jí)：無(wú)纖維化；1級(jí)：纖維結(jié)締組織僅局限于匯管區(qū)或匯管區(qū)擴(kuò)大有向小葉發(fā)展的趨勢(shì)；2級(jí)：纖維結(jié)締組織增生進(jìn)入肝小葉2／3并有1級(jí)同樣的改變；3級(jí)：纖維結(jié)締組織進(jìn)入肝小葉達(dá)中央靜脈周圍；4級(jí)：纖維結(jié)締組織在全小葉多處彌漫性增生，假小葉形成并有3級(jí)同樣改變。

1.2.3 大鼠血清 ALT、AST、ALP及肝組織中 CAT、GSH-Px、SOD及MDA水平檢測(cè) 采用生化分析法。腹主動(dòng)脈采血，將全血靜置2h，4000r/min離心10min，分離血清。按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定血清ALT、AST、ALP活性；取大鼠肝臟相同部位組織制備肝勻漿，按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定大鼠肝組織CAT、GSH-Px、SOD及MDA水平。

1.2.4 大鼠血清中PCⅢ、IV-C、HA、LN檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme-linked Immune Sorbent Assay,ELISA）法，按ELISA試劑盒提供說(shuō)明書(shū)操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)各組大鼠血清中PCⅢ、Ⅳ-C、HA、LN含量。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行分析，各組數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，數(shù)據(jù)以±s表示。兩組間比較時(shí)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較方差齊性時(shí)采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法；多組間比較方差不齊時(shí)采用Kruskal-wallis H檢驗(yàn)。等級(jí)資料采用ridit分析。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化痰行瘀湯對(duì)肝纖維化大鼠生存狀態(tài)的影響

空白對(duì)照組大鼠皮毛光滑亮澤，飲食正常，活動(dòng)正常，體格健壯，無(wú)死亡。模型組表現(xiàn)為體重增長(zhǎng)緩慢，精神不振，反應(yīng)遲緩，飲食攝水量逐漸減少，大便溏泄，皮毛凌亂、稀疏，缺乏光澤?；敌叙鰷?、中、低劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組表現(xiàn)為不同程度體重增長(zhǎng)下降，精神不振，個(gè)別大便溏泄，皮毛晦暗、柔順。其中，化痰行瘀湯高劑量組表現(xiàn)較其它治療組明顯改善，部分皮毛晦暗、柔順，活動(dòng)、飲食攝水量尚可，整體情況較好。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型對(duì)照組大鼠死亡2只，化痰行瘀湯中、低劑量組大鼠各死亡 1只，其他各組無(wú)死亡。

2.2 各組大鼠肝組織病理學(xué)變化 取各組大鼠肝臟，10%甲醛固定制成石蠟切片，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織學(xué)病理變化。正常組大鼠肝臟匯管區(qū)及肝小葉架構(gòu)清晰完整，肝索整齊排列，肝細(xì)胞無(wú)炎癥壞死。模型組大鼠肝臟匯管區(qū)周圍纖維膠原大量增生，肝小葉及肝索正常排列遭到破壞，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞大量壞死、出現(xiàn)氣球樣病變。陽(yáng)性對(duì)照組和化痰行瘀湯高、中劑量組大鼠肝臟纖維化程度有所改善，纖維增生和細(xì)胞病變壞死情況減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 化痰行瘀湯對(duì)肝纖維化大鼠肝組織病理學(xué)影響Fig.1 Effect of Huatan Xingyu Decoction on liver histopathology in rats with liver fibrosis

2.3 各組大鼠肝組織肝纖維化分期比較 各組大鼠肝組織肝纖維化分期情況結(jié)果見(jiàn)表1。與正常對(duì)照組比較，模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），肝纖維化明顯，提示造模成功。與模型組比較，化痰行瘀湯各個(gè)劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示各治療組具有一定的治療作用。與陽(yáng)性對(duì)照藥比較，化痰行瘀湯高、中劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表 1。

表1 化痰行瘀湯對(duì)肝纖維化大鼠對(duì)肝纖維化分期影響（n）Tab.1 Effect of Huatan Xingyu Decoction on staging of liver fibrosis in rats with liver fibrosis(n)

2.4 各組大鼠肝臟、脾臟指數(shù)比較 與正常組比較，模型組肝臟指數(shù)與脾臟指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，化痰行瘀湯高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組肝臟指數(shù)與脾臟指數(shù)都顯著下降（P＜0.01），化痰行瘀湯中劑量組肝臟指數(shù)與脾臟指數(shù)明顯下降（P＜0.05），化痰行瘀湯低劑量組肝、脾臟指數(shù)均無(wú)明顯差異。見(jiàn)表2。

表2 化痰行瘀湯對(duì)肝纖維化大鼠肝臟、脾臟指數(shù)影響（±s，n=10）Tab.2 Effect of Huatan Xingyu Decoction on liver and spleen index in rats with liver fibrosis（±s，n=10）

表2 化痰行瘀湯對(duì)肝纖維化大鼠肝臟、脾臟指數(shù)影響（±s，n=10）Tab.2 Effect of Huatan Xingyu Decoction on liver and spleen index in rats with liver fibrosis（±s，n=10）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01Note：Compared with the normal group,△△P＜0.01;compared with the model group,*P＜0.05，**P＜0.01

組別 肝臟指數(shù) 脾臟指數(shù)正常組模型組化痰行瘀湯高劑量組化痰行瘀湯中劑量組化痰行瘀湯低劑量組陽(yáng)性對(duì)照組3.82±0.46 6.93±0.67△△4.74±0.55**6.18±0.61*6.75±0.57 4.56±0.69**0.77±0.19 1.69±0.67△△0.94±0.22**1.11±0.32*1.54±0.26 0.95±0.35**

2.5 各組大鼠血清中ALT、AST、ALP水平比較 與正常組比較，模型對(duì)照組ALT、AST、ALP都顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，化痰行瘀湯高及陽(yáng)性對(duì)照組 ALT、AST、ALP 顯著性下降（P＜0.01），化痰行瘀湯中劑量組 ALT、ALP 顯著性下降（P＜0.01）、AST顯著性下降（P＜0.05），化痰行瘀湯低劑量組ALT、AST、ALP均無(wú)明顯差異。見(jiàn)表3。

表3 化痰行瘀湯對(duì)肝纖維化大鼠血清中ALT、AST、ALP水平的影響（±s，n=10）Tab.3 Effect of Huatan Xingyu Decoction on serum ALT,AST and ALP levels in rats with liver fibrosis（±s，n=10）

表3 化痰行瘀湯對(duì)肝纖維化大鼠血清中ALT、AST、ALP水平的影響（±s，n=10）Tab.3 Effect of Huatan Xingyu Decoction on serum ALT,AST and ALP levels in rats with liver fibrosis（±s，n=10）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01Note：Compared with the normal group,△△P＜0.01;compared with the model group,*P＜0.05，**P＜0.01

組別 ALT（IU/L） AST（IU/L） ALP（IU/L）正常組模型組化痰行瘀湯高劑量組化痰行瘀湯中劑量組化痰行瘀湯低劑量組陽(yáng)性對(duì)照組57.73±6.78 318.84±34.38△△195.40±29.51**213.26±28.62**298.60±31.71 153.81±31.01**149.68±24.33 445.36±91.39△△336.40±26.30**353.35±68.11*410.32±35.90 293.81±31.01**77.80±12.30 339.06±38.65△△155.37±19.93**238.41±22.36**300.36±69.82 134.79±18.33**

2.6 化痰行瘀湯對(duì)肝纖維化大鼠脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)影響 檢測(cè)各組大鼠肝組織中CAT、GSH-Px、SOD及MDA等脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組CAT、GSH-Px及 SOD 水平顯著下降（P＜0.01），MDA水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，化痰行瘀湯高、中劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組CAT、GSH-Px及SOD水平顯著升高（P＜0.01），MDA 水平顯著下降（P＜0.01），化痰行瘀湯中劑量組CAT、GSH-Px及SOD水平明顯升高（P＜0.05），MDA 水平明顯下降（P＜0.05）。見(jiàn)表 4。

表4 化痰行瘀湯對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中CAT、GSH-Px、SOD、MDA的影響（±s，n=10）Tab.4 Effects of Huatan Xingyu Decoction on CAT,GSH-Px,SOD and MDA in liver tissues of rats with liver fibrosis（±s，n=10）

表4 化痰行瘀湯對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中CAT、GSH-Px、SOD、MDA的影響（±s，n=10）Tab.4 Effects of Huatan Xingyu Decoction on CAT,GSH-Px,SOD and MDA in liver tissues of rats with liver fibrosis（±s，n=10）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01Note：Compared with the normal group,△△P＜0.01;compared with the model group,*P＜0.05，**P＜0.01

組別 CAT（KU/gprot） GSH-Px（KU/gprot） SOD（KU/gprot） MDA（nmol/mgprot）正常組模型組化痰行瘀湯高劑量組化痰行瘀湯中劑量組化痰行瘀湯低劑量組陽(yáng)性對(duì)照組840.43±35.78 517.22±91.20△△656.38±25.37**608.55±93.18*545.51±72.78 685.11±29.48**809.87±40.08 473.88±91.58△△611.50±76.83**584.15±90.70*530.22±81.22 643.88±32.78**389.34±23.44 202.03±76.23△△321.22±21.02**262.53±19.84*237.21±17.32 339.84±24.06**1.38±0.17 5.97±1.89△△3.77±0.26**4.57±0.21*5.45±0.29 3.23±0.22**

2.7 化痰行瘀湯對(duì)肝纖維化大鼠血清肝纖維化標(biāo)志物的影響 檢測(cè)各組大鼠血清中PCⅢ、IV-C、HA、LN等肝纖維化標(biāo)志物水平發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組PCⅢ、IV-C、HA、LN 都顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，化痰行瘀湯高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組PCⅢ、IV-C、HA、LN 都顯著下降（P＜0.01），中劑量組 PCⅢ、IV-C、HA、LN 均明顯下降（P＜0.05）。見(jiàn)表 5。

表5 化痰行瘀湯對(duì)肝纖維化大鼠血清中PCⅢ、IV-C、HA、LN水平的影響（±s，μg/L,n=10）Tab.5 Effect of Huatan Xingyu Decoction on serum PCIII,IV-C,HA and LN levels in rats with liver fibrosis（±s，μg/L,n=10）

表5 化痰行瘀湯對(duì)肝纖維化大鼠血清中PCⅢ、IV-C、HA、LN水平的影響（±s，μg/L,n=10）Tab.5 Effect of Huatan Xingyu Decoction on serum PCIII,IV-C,HA and LN levels in rats with liver fibrosis（±s，μg/L,n=10）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01Note：Compared with the normal group,△△P＜0.01;compared with the model group,*P＜0.05，**P＜0.01

組別 PCⅢ IV-C HA LN正常組模型組化痰行瘀湯高劑量組化痰行瘀湯中劑量組化痰行瘀湯低劑量組陽(yáng)性對(duì)照組52.88±4.43 155.11±10.20△△88.23±7.11**145.58±8.17*154.40±9.21 77.30±6.25**78.67±6.44 171.43±11.59△△107.65±7.83**158.46±8.88*170.60±9.50 90.25±7.42**83.35±6.80 224.67±17.67△△145.46±13.33**207.67±14.08*219.88±15.30 139.82±12.66**85.02±6.89 275.60±23.66△△186.80±12.34**256.36±15.06*270.54±18.38 167.22±11.25**

3 討論

在我國(guó)，慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病以及肝癌等慢性肝病發(fā)病廣、危害大，嚴(yán)重危害著國(guó)民健康。肝纖維化是肝臟對(duì)多種慢性損傷的病理修復(fù)反應(yīng)，以肝臟細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度增生沉積為特征，是大多數(shù)慢性肝病的共同病理特征，亦是慢性肝炎向肝硬化甚至肝癌發(fā)展的必經(jīng)病理階段[1]。近年來(lái)，肝纖維化的病理變化可逆轉(zhuǎn)已是業(yè)界共識(shí)，抗肝纖維化治療已成為當(dāng)前慢性肝臟疾病研究的焦點(diǎn)之一[2]。中藥復(fù)方具有多組分、多途徑與多環(huán)節(jié)的綜合治療優(yōu)勢(shì)，在抗肝纖維化治療方面研究取得了較大的進(jìn)展，并取得了較滿意的臨床療效，如扶正化瘀膠囊（片）、復(fù)方鱉甲軟肝片以及下瘀血湯等[3]。

本課題組認(rèn)為肝纖維化的病理表現(xiàn)為膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，這與中醫(yī)的痰瘀互結(jié)的病機(jī)相似，因此，課題組選用浙貝化痰，澤瀉利濕，丹參、赤芍活血，桃仁軟堅(jiān)散結(jié)散結(jié)，郁金為血中之氣藥，活血兼以行氣，痰瘀兼治，可有效治療肝纖維化[4]。課題組多年來(lái)將化痰行瘀湯應(yīng)用于治療肝硬化、肝纖維化臨床病人，取得了較好的臨床療效，為課題組治療肝纖維化的經(jīng)驗(yàn)方。但化痰行瘀湯對(duì)肝纖維化作用機(jī)制尚不清楚，因此本項(xiàng)目重點(diǎn)探討化痰行瘀湯對(duì)肝纖維化大鼠治療作用和機(jī)制。

本研究使用經(jīng)典的CCL4造成大鼠肝纖維化模型，大部分動(dòng)物都出現(xiàn)了3級(jí)和4期的病理改變，纖維結(jié)締組織彌漫性增生，假小葉形成，且均一性好，而且血清 ALT、AST、ALP 等肝酶和 PCⅢ、Ⅳ-C、HA、LN等肝纖維化指標(biāo)顯著升高，表明模型成功，肝纖維化大鼠具有明顯的肝纖維化特征。而化痰行瘀湯高、中劑量組大鼠血清 ALT、AST、ALP 及 PCⅢ、Ⅳ-C、HA、LN降低，肝脾指數(shù)降低，HE病理顯示肝臟纖維增生和細(xì)胞病變壞死情況減輕，說(shuō)明高、中劑量組化痰行瘀湯均具有明顯的抗肝纖維化作用，能減少肝臟膠原的合成。

肝纖維化的發(fā)病機(jī)制異常復(fù)雜，目前認(rèn)為細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過(guò)度沉積與肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）活化是其主要發(fā)病機(jī)制[5]。脂質(zhì)過(guò)氧化是指在自由基的攻擊下，不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，從而生成一系列活性氧的復(fù)雜過(guò)程。脂質(zhì)過(guò)氧化除破壞生物膜、蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)外，還可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，激活庫(kù)普弗細(xì)胞和 HSC,所產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化物質(zhì)可以通過(guò)影響膠原代謝導(dǎo)致肝纖維化的形成。因此，清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化成為抗肝纖維化的一個(gè)重要靶點(diǎn)[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組脂質(zhì)過(guò)氧化相關(guān)指標(biāo)MDA顯著升高，抗氧化指標(biāo)CAT、SOD、GSH-Px顯著下降，表明模型組大鼠體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，肝組織內(nèi)自由基產(chǎn)生過(guò)多，誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。高、中劑量的化痰行瘀湯能能降低肝臟的脂質(zhì)過(guò)氧化，發(fā)揮抗纖維化的作用，目前尚無(wú)這方面的文獻(xiàn)報(bào)道。同時(shí)，化痰行瘀湯與復(fù)方鱉甲軟肝片的作用相似，但本方選藥組方精當(dāng)，具有簡(jiǎn)、便、廉、驗(yàn)的特點(diǎn)，值得進(jìn)一步推廣和研究。

綜上所述，化痰行瘀湯可能通過(guò)抗脂質(zhì)過(guò)氧化發(fā)揮抗纖維化的作用，本課題組將進(jìn)一步深入研究。