向家培，雷玉華

(恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院心血管內科，恩施 445000)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是獨立于糖尿病的并發(fā)癥之一，同時也是晚期造成糖尿病患者死亡的主要原因。心肌間質纖維化是DCM的主要病理表現之一[1]。心肌纖維化能增加心室壁僵硬度，降低心室順應性，導致心臟舒縮功能障礙，最終導致心力衰竭[2]。心臟成纖維細胞(cardiac fibroblasts，CF)是調節(jié)細胞外基質(extracellular matrix，ECM)合成和降解的主要細胞，在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著至關重要的作用[3]。研究表明，高糖刺激一方面能夠促進CF增殖，加速膠原合成；另一方面，能夠直接激活轉化生長因子β(transforming growth factor-beta，TGF-β)/Smads信號通路，促進CF細胞中Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ，Col Ⅰ)、Col Ⅲ及結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)的合成，最終增加心肌組織ECM的合成[4]。沉默信息調節(jié)因子(silent information regulator，SIRT)1是哺乳動物體內與酵母SIRT2同源性最高的同系物，與機體氧化應激、基因轉錄調控及細胞衰老等多種生命活動密切相關[5]。在DCM中，SIRT1能夠通過抑制內質網應激減少心肌細胞凋亡，從而發(fā)揮保護作用[6]。此外，SIRT1還能夠通過抑制乙?；腟mad3(acetylated-Smad3，ac-Smad3)信號通路減輕腎臟纖維化[7]。

梔子苷(geniposide，GE)，又名京尼平苷，屬于環(huán)烯醚萜苷類化合物[8]。目前，GE已被證實具有抗炎癥、抗腫瘤、抗凋亡及抗血管生成等多種藥理作用[9]。在心血管疾病中，GE能夠抑制胸主動脈縮窄(thoracic aortic constriction，TAC)誘導的心肌肥厚，其機制與GE對心肌細胞中腺苷酸活化蛋白激酶α(adenosine monophosphate activated protein kinase α，AMPKα)的抑制有關[10]。而GE在DCM中的作用尚未見報到。本文將主要探討GE對高糖誘導的大鼠CF的轉化及膠原合成的作用，以及可能涉及的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

GE購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，純度大于98%。將GE溶解在磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)中配置成不同濃度的GE溶液待使用。出生1～3 d的Sprague-Dawley大鼠，雌雄不限，由湖北省疾病預防控制中心提供。氧化應激檢測試劑盒包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NAPDH)，購自碧云天生物技術有限公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；低糖DMEM培養(yǎng)基購自賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司；甘露醇、葡萄糖、Trizol Reagen購自美國Invitrogen公司；引物由武漢谷歌生物公司合成和純化。

1.2 方法

1.2.1 大鼠CF的分離和培養(yǎng) 無菌條件下剪取乳鼠心臟前1/3的心室部分，用0.25%胰蛋白酶消化心肌組織，差速貼壁1 h去除未貼壁的心肌細胞。采用DMEM + 10%胎牛血清 + 雙抗培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)乳鼠CF，選用第2～3代傳代細胞，用0.25%的胰酶消化CF。

1.2.2 實驗分組 預實驗確定GE的最佳保護濃度為100 μmol/L。實驗分為4組：(1)正常對照(normal control，NC)組；(2)NC+GE組；(3)高糖(葡萄糖，濃度為33.3 mmol/L)模型組；(4)高糖 + GE組。每組設置 5個復孔，并接受相應處理。

1.2.3 逆轉錄聚合酶鏈反應檢測膠原mRNA的表達 (1)Trizol法提取CF中RNA，利用紫外分光光度計檢測RNA的濃度及純度，A260/A280=1.8～2.0方可使用；(2)通過逆轉錄，將mRNA合成為cDNA，并放入-80℃冰箱保存；(3)逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)體系包括：10×Buffer 2.5 μl、cDNA 2 μl、正向引物(20 μmol/L)0.25 μl、反向引物(20 μmol/L)0.25 μl、去氧核苷酸(deoxynucleotide polymerases，dNTPs；10 mmol/L)0.5 μl、Taq酶(2×106U/L)0.5 μl和雙蒸水19 μl。引物序列見表1。

表1 RT-PCR中各指標引物序列

GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; CTGF: connective tissue growth factor.

1.2.4 Western blot檢測 在直徑為100 mm的細胞培養(yǎng)皿中接種6 ml CF懸液，細胞密度約107/皿。CF長至70%匯合時，饑餓處理12 h，使其同步化生長。隨后按照分組給予高糖和GE刺激，24 h后提取細胞中總蛋白。具體過程如下：(1)首先棄去培養(yǎng)基中的培養(yǎng)液，PBS洗3次；(2)每皿加入1 000 μl裂解液，充分震蕩20 min；(3)用毛刷將皿底的細胞充分刮下，放入準備好的EP管中；(4)將收集的細胞，用超聲裂解儀裂解15 s左右；(5)靜置15 min后，離心0.5 h(12 000轉/min)；(6)取上清分裝至EP管，采用紫外分光光度法測量蛋白濃度后，將所有樣本的蛋白定容至等濃度；(7)分裝后放入-80℃冰箱。CF總蛋白提取后，進行SDS-PAGE電泳，電泳后將凝膠中的蛋白轉入PVDF膜中，一抗4℃孵育過夜，隨后于羊抗兔二抗中避光孵育1 h，利用Odyssey掃膜儀對蛋白條帶掃描并定量，GAPDH校正待測蛋白水平。

1.2.5 免疫熒光染色 (1)4%多聚甲醛固定；(2)0.2%的Triton破膜；(3)8%山羊血清封閉1 h；(4)一抗[包括抗SIRT1抗體和抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗體]封閉過夜；(5)羊抗鼠和羊抗兔二抗共同孵育1 h；(6)DAPI染核；(7)熒光顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 大鼠CF的鑒定

原代分離及純化后的大鼠CF經培養(yǎng)12 h后，基本貼壁。倒置顯微鏡下可見CF呈梭形，多角型。CF細胞在培養(yǎng)基中呈放射狀、網狀及漩渦狀分布。CF細胞核為圓形，胞漿透明(圖1A)。波形蛋白免疫熒光顯示，陽性染色細胞占比超過全視野所有細胞的95%(圖1B)。

圖1 大鼠左室心臟成纖維細胞鑒定

A: light mcroscope (×40); B: immunofluorescent staining of vimentin (×100)

2.2 高糖和GE對CF纖維化標志物mRNA表達的影響

RT-PCR結果顯示，高糖刺激下，大鼠CF的ColⅠ、Ⅲ及CTGF mRNA表達顯著升高，證明高糖能夠誘導大鼠CF細胞膠原增多；不同濃度的GE處理高糖刺激后的大鼠CF 24 h后，ColⅠ、Ⅲ及CTGFmRNA表達有所降低，且隨GE濃度的增加，抑制作用增強，在1～100 μmol/L之間呈現濃度依賴性(均P<0.05；圖2)。

2.3 各組氧化應激標志物水平比較

使用氧化應激試劑盒對CF中氧化應激標志物進行檢測，結果顯示，與NC組相比，高糖模型組的SOD活性顯著降低，NADPH活性和MDA產量均顯著增高；而GE能夠顯著抑制高糖誘導的氧化應激(均P<0.05；圖3)。

2.4 各組心肌纖維化信號通路相關蛋白檢測

高糖刺激后，非經典的促纖維化信號通路TGF-β/ac-Smad3和α-SMA蛋白的表達水平均明顯升高(P<0.05)；使用GE干預后，上述促纖維化信號通路相關蛋白的表達水平明顯受到抑制(P<0.05)。同時，我們檢測了CF中SIRT1蛋白水平的表達，結果顯示，高糖刺激后，SIRT1表達水平明顯受抑制；而GE干預后，SIRT1表達水平顯著上升(均P<0.05；圖4)。

2.5 EX-527對GE藥理作用的影響

EX-527為SIRT1抑制劑，我們用免疫熒光共染了CF中的SIRT1及α-SMA，結果表明，CF中SIRT1被GE或EX-527激活后，α-SMA表達水平明顯下降(圖5A)。同時利用氧化應激試劑盒再次檢測了CF氧化應激水平，結果表明，在加入EX-527后，GE對高糖刺激下CF表型轉化的抑制作用消失；且EX-527也可以使GE對高糖刺激下氧化應激及ac-Smad3信號通路的抑制作用消失(圖5B-H)。證明了GE對高糖刺激下CF轉化及膠原合成的抑制作用依賴于SIRT1。

3 討 論

心肌纖維化是DCM主要的病理改變，極大地增加了糖尿病患者心力衰竭的發(fā)病風險[1]。CF作為心臟中主要的細胞類型之一，一旦被各組刺激因素(高糖、異丙腎上腺素、TGF-β等)激活便可合成并分泌膠原，導致心肌中ECM的沉積。此外，CF轉化為表達α-SMA的肌成纖維細胞也是合成ECM的一個重要來源[2]。研究發(fā)現，高糖可通過促進心臟間質膠原沉積誘發(fā)心肌纖維化。一方面，高糖可以抑制間質內膠原的降解；另一方面，高糖又可促進膠原蛋白的糖基化，增加心臟間質中膠原的合成。因此，阻斷CF的表型轉化及膠原合成對干預DCM具有重要意義[11]。本研究發(fā)現，GE可以通過抑制SIRT1的表達進而阻斷高糖誘導的CF表型轉化及膠原合成。

圖2 不同濃度GE對高糖刺激下纖維化標志物mRNA表達的影響

圖3 各組氧化應激標志物水平比較

圖4 GE對高糖刺激下CF中TGF-β/ac-Smad3信號通路及SIRT1蛋白表達的影響

圖5 EX-527對GE藥理作用的影響

傳統(tǒng)觀點認為，TGF-β/磷酸化的Smad3(phosphorylated-Smad3，P-Smad3)信號通路是經典的促心肌纖維化信號通路，在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中有著至關重要的作用。此信號通路激活的基本過程如下：TGF-β與TGF-β受體Ⅱ結合后，可激活TGF-β受體Ⅰ。隨后，活化的TGF-β受體Ⅰ可磷酸化Smad3。磷酸化的Smad3再與Smad4結合后入核，直接或間接地激活促纖維化相關基因[12]。最近研究發(fā)現，TGF-β刺激能夠激活細胞內乙酰化酶p300的催化活性，將乙酰輔酶A的乙?；D移到Smad3的賴氨酸氨基殘端，進而對Smad3進行乙?；揎?，調節(jié)Smad3的DNA連接酶活性或轉錄活性[13，14]。因此，抑制Smad3的乙酰化也是治療心肌纖維化的關鍵策略之一。

在糖尿病狀態(tài)下，心肌膠原代謝氧化失衡，氧化應激通過促進TGF-β的表達增加CF向肌成纖維細胞的表型轉化，從而加強膠原合成、促進DCM患者心臟纖維化。因此，抑制CF氧化應激是治療DCM的重要靶點之一[1]。Gu等[15]研究發(fā)現，上調CF中乙醛脫氫酶2(acetaldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)的表達能明顯抑制高糖誘導的CF膠原產生，其機制可能與CF中氧化應激的降低有關。

近年來，組蛋白去乙酰化酶SIRT1在纖維化疾病中的作用日益受到關注。據報道，SIRT1可通過激活TGF-β/ac-Smad3信號通路和抑制氧化應激，改善腎間質纖維化[7]。此外，SIRT1還能夠降低ac-Smad4和β-catenin蛋白的表達，抑制內皮間質轉化，最終抑制腫瘤轉移及器官纖維化[16]。體外實驗證明，蝦青素可以通過激活SIRT1進而抑制Smad3的乙?；罱K減輕壓力負荷過載所致的心肌纖維化和心功能不全[2]。SIRT1在抗氧化應激中也發(fā)揮著至關重要的作用，例如SIRT1可以通過將P53的第382位的賴氨酸殘基去乙酰化，抑制P53的生理活性，最終抑制細胞氧化應激所致的病理損傷[5]。這些研究結果提示，SIRT1對纖維化的發(fā)生發(fā)展及細胞的氧化應激發(fā)揮著重要的調控作用。在本研究中，我們利用高糖在體外對乳鼠CF細胞進行刺激，同時利用GE進行干預，結果發(fā)現，GE能夠明顯降低高糖環(huán)境中CF的氧化應激水平及各種膠原的合成，抑制Smad3的乙酰化，同時GE能夠激活CF細胞中SIRT1蛋白的表達。SIRT1一旦被抑制，GE的抑纖維化作用消失，表明GE的抑纖維化作用依賴于CF細胞中SIRT1的激活。

總之，我們的研究首次證實GE能夠降低高糖誘導的大鼠心肌成纖維細胞表型轉化及膠原合成，這種保護作用可能與GE對CF中氧化應激及Smad3乙?；囊种朴嘘P，且這種抑制作用依賴于SIRT1的激活。