劉昕，林琳，倪雅娟，魏瑾，張超英

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，西安 710004)

心力衰竭(heart failure,HF)是大多數(shù)心血管疾病的終末狀態(tài)，具有高再住院率、致殘率及致死率的特點，給社會和家庭帶來了極大的經(jīng)濟負擔。線粒體是細胞進行正常生理活動的主要能量來源，線粒體損傷不僅可以導致能量代謝異常，還會造成過度氧化應激、細胞凋亡、線粒體自噬及線粒體融合分裂失衡等病理改變。研究認為，損傷的線粒體代謝產(chǎn)物可通過激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)促進HF的發(fā)病及進展，因此線粒體損傷是導致HF患者心功能異常的重要機制[1]。木犀草素(luteolin,Lu)是一種黃酮類化合物，可從多種天然藥材和瓜果蔬菜中分離出來，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抗病毒等多種藥理學活性。多項研究表明，Lu可減少冠心病患者死亡率、抑制糖尿病心肌病的心肌損傷，對心血管具有保護作用[2]。我們的前期研究初步發(fā)現(xiàn)Lu能減輕異丙腎上腺素誘導的HF大鼠外周淋巴細胞線粒體DNA損傷，并且可以一定程度上改善HF大鼠的心臟功能，而對正常大鼠心臟功能及心肌線粒體無明顯損傷[3]。因此，我們推斷線粒體功能損傷及線粒體途徑細胞凋亡可能是異丙腎上腺素誘導的大鼠心功能障礙的重要病理機制，也是Lu發(fā)揮心肌保護作用的重要途徑之一。本研究以異丙腎上腺素誘導建立HF模型，觀察Lu對HF大鼠心肌細胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)、呼吸鏈酶活性、線粒體途徑凋亡的影響，為尋找和開發(fā)新的HF治療藥物提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6～7周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g(西安交通大學實驗動物中心)；Lu(Sigma，491-70-3)；冷凍離心機(TGL-16, 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；彩色多普勒超聲診斷儀(iE33，Philips公司)；PCR 儀(9700型Gene AmP，美國應用生物系統(tǒng)公司)；透射電子顯微鏡(H-7650，日本HITACHI公司)；動物硬組織線粒體粗提分離試劑盒、純化線粒體溶解試劑盒、純化MMP熒光測定試劑盒、細胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase,COX)活性測定試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)；琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase,SDH)活性測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 HF大鼠模型建立 將30只SD大鼠按隨機數(shù)表法分為對照組、模型組(HF)和Lu干預組(HF + Lu)，每組10只。所有實驗大鼠在相同條件下喂養(yǎng)，環(huán)境溫度(22±2) ℃，濕度 35%～70%，大鼠可自由取食和飲水。參考文獻[4]中HF大鼠模型的制作，HF組和HF + Lu組大鼠給予異丙腎上腺素50 mg/kg腹腔注射，對照組給予等量生理鹽水腹腔注射。注射藥物同時HF + Lu組大鼠給予Lu 50 mg/(kg·d)灌胃(體積3 ml)，對照組和HF組給予50 g/L羧甲基纖維素鈉3 ml灌胃。均干預10 d后，于第11天行超聲心動圖檢測心功能。

1.2.2 超聲心動圖檢測 大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉(3 ml/kg)后，剔去胸前毛發(fā)，固定于操作臺上，采用彩色多普勒超聲診斷儀(頻率 22 MHz)檢測。取心臟左室長軸切面和左室乳頭肌水平測量M型曲線，測量分析并記錄左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter,LVEDs)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDd)、左室短軸縮短率(left ventricular fraction shortening,LVFS)和左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)。連續(xù)測量3個心動周期取其平均值。

1.2.3 RT-PCR檢測凋亡相關(guān)基因Bax、caspase3、caspase9表達 將所有大鼠處死，取30 mg心肌組織，按照TRIzol試劑說明書提取細胞總RNA，紫外光吸收法檢測RNA純度及含量，調(diào)整各組樣品總RNA濃度。RT-PCR反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。擴增條件：94℃預變性5 min；隨后95℃變性30 s，退火58 s，65℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。每次實驗以GAPDH作為內(nèi)參。PCR引物均由大連TaKaRa生物公司合成。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

1.2.4 心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 取心尖部心肌，約 4～5 mm3，滴注1～2 ml 預冷戊二醛固定劑，將組織切成1 mm3大小，置入盛有 2～3 ml預冷的 2.5%戊二醛中過夜固定。經(jīng)漂洗包埋后，在超薄切片機上切片，獲得厚度為70～90 nm的切片；經(jīng)檸檬酸鉛和醋酸鈾雙重染色各15 min；在H-7650透射電子顯微鏡下觀察心肌組織及線粒體結(jié)構(gòu)。

1.2.5 心肌組織線粒體提取及線粒體功能檢測 按試劑盒說明書，稱取 500 mg 心肌組織用于線粒體提取；組織經(jīng) PBS 緩沖液沖洗后用剪刀充分剪碎并轉(zhuǎn)移入 5 ml EP 管中，加入 2.5 ml 酶解液，充分混勻；冰上孵育10 min后在 4℃下 1 000轉(zhuǎn)/min離心2 min，棄上清后加入清理液及稀釋液充分混勻；再次在 4℃下1 000轉(zhuǎn)/min離心2 min，棄上清；將沉淀移入10 ml勻漿器，加入裂解工作液徹底勻漿20～40次左右；將勻漿物進行離心沉淀加入0.5 ml線粒體儲存液以溶解線粒體，混勻備用；按MMP、SDH及COX試劑盒加入稀釋液及反應工作液，采用熒光酶標儀對熒光強度值進行檢測，并與對照組進行標準化。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠心臟超聲指標比較

超聲心動圖結(jié)果顯示，HF組大鼠心臟超聲各指標明顯受損，Lu + HF組大鼠心臟功能明顯改善。與對照組比較，HF組大鼠LVEF(P=0.023)和LVFS(P=0.002)均明顯降低；而 LVEDs(P=0.010)和LVEDd (P=0.034)均明顯增加，差異均具有統(tǒng)計學意義。與HF組相比，HF + Lu大鼠組LVEF(P=0.028)和LVFS(P=0.006)均明顯增加，而 LVEDs(P=0.043)和LVEDd(P=0.019)均明顯降低，差異亦有統(tǒng)計學意義(表2)。

表2 3組大鼠心功能相關(guān)指標比較

Group LVEF(%)LVFS(%)LVEDd(mm)LVEDs(mm)Control86.0±4.543.0±2.55.87±0.353.20±0.27HF68.0±3.1?32.0±3.7?7.10±0.34?4.10±0.29?HF+Lu78.0±5.8#39.0±1.5#5.65±0.21#3.40±0.23#

HF: heart failure; Lu: luteolin; LVEF: left ventricular ejection fraction; LVFS: left ventricular fraction shortening; LVEDd: left ventricular end-diastolic diameter; LVEDs: left ventricular end-systolic diameter. Compared with control group,*P<0.05; compared with HF group,#P<0.05.

2.2 3組大鼠心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)改變

透射電子顯微鏡下可見，對照組大鼠心肌細胞結(jié)構(gòu)清楚，Z線清晰，粗細肌絲排列整齊、有序，細胞核形態(tài)規(guī)整，大小相對均一的線粒體在肌絲之間密集分布，線粒體形狀多為圓形或橢圓形。而HF組大鼠心肌組織內(nèi)可見脂質(zhì)沉積，肌絲排列紊亂，伴有肌絲斷裂與溶解，其中充滿大量線粒體伴有空泡變性，肌漿網(wǎng)腔擴張。HF + Lu組大鼠上述形態(tài)改變較HF組明顯減輕(圖1)。

2.3 3組大鼠心肌線粒體MMP、SDH及COX酶活性比較

與對照組比較，HF組大鼠心肌MMP 水平顯著降低(P=0.033)，給予Lu干預后，HF + Lu組大鼠MMP水平較HF組顯著升高(P=0.021)，差異有統(tǒng)計學意義(圖2A)。與對照組比較，HF組大鼠心肌線粒體 COX(P=0.032)和SDH(P=0.040)的活性均明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義；給予Lu干預后，HF + Lu組大鼠COX (P=0.007)和 SDH (P=0.011)活性較HF組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(圖2B)。

2.4 3組大鼠心肌Bax、caspase3及caspase9 mRNA水平比較

結(jié)果顯示，與對照組比較，HF組大鼠心肌組織中Bax(P=0.026)、caspase3(P=0.046)及caspase9(P=0.009)mRNA表達水平均顯著高于對照組；給予Lu干預后，HF + Lu組大鼠心肌組織Bax(P=0.012)、caspase3(P=0.024)及caspase9(P=0.039)mRNA較HF組表達水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(圖3)。

圖1 3組大鼠心肌組織線粒體超微結(jié)構(gòu)

圖2 3組大鼠心肌線粒體MMP、SDH及COX比較

圖3 3組大鼠心肌Bax、caspase3及caspase9 mRNA表達水平

3 討 論

HF是由心室充盈或射血過程中任何結(jié)構(gòu)或功能損害引起的復雜性終末期臨床常見綜合征，其特征包括能量代謝異常、活性氧生成增加以及興奮-收縮耦合缺陷等[5]。線粒體對代謝底物的攝取、ATP合成、電子傳遞鏈活性、活性氧水平、離子穩(wěn)態(tài)、線粒體生物發(fā)生、線粒體動力學及活性氧含量的影響[6]以及線粒體DNA損傷[7]的調(diào)節(jié)異常是HF發(fā)生和發(fā)展的重要病理機制[8]，是促進HF病程進展的重要因素。

線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整與健康是保證細胞能量供應、維持細胞內(nèi)環(huán)境、調(diào)節(jié)細胞凋亡、炎癥應答等多種生命活動的基礎(chǔ)。線粒體的能量供應依賴于維持其內(nèi)膜的化學滲透梯度。這種梯度，也稱為質(zhì)子動力，是由呼吸鏈復合酶產(chǎn)生的，它們利用電子傳輸過程中釋放的自由能將質(zhì)子從線粒體基質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜間隙。其中，MMP是由正電荷在膜上的凈運動和pH梯度產(chǎn)生的，貢獻了梯度中存儲的大部分能量，而線粒體呼吸酶活性能促進能量的產(chǎn)生及傳遞[9]。因此，MMP、線粒體酶復合物活性被認為是線粒體能量狀態(tài)的重要指標之一。在氧化應激、酸中毒、鈣超載、ATP耗竭等情況下，MMP可在一定程度上降低，若MMP下降不超過15%可能有利于自由基的清除[10]，但MMP進一步下降可能導致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，進一步加重MMP的消散，從而導致ATP產(chǎn)生完全終止，并進一步啟動細胞凋亡起點。大量功能損傷的線粒體可導致細胞色素C(Cytochrome C,Cyt-C)釋放，并與 ATP、細胞內(nèi)Ca2+、凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptotic protease activating factor 1,Apaf-1)和其他因子之間相互作用，促進Bax轉(zhuǎn)位，從而激活caspase3、caspase9途徑的級聯(lián)反應，最終導致細胞凋亡。我們在研究中發(fā)現(xiàn)HF大鼠心肌線粒體呼吸鏈酶活性降低，線粒體凋亡相關(guān)基因Bax、caspase3、caspase9表達增加，這顯然與既往結(jié)論是相符的。然而，在部分研究中發(fā)現(xiàn)HF模型中SDH活性是增加的，考慮可能與疾病程度不同、線粒體功能處于代償性增加有關(guān)[11]。同樣的，細胞凋亡是致心肌病心肌細胞丟失、左心室功能逐漸下降、充血性HF的重要原因，研究表明，心肌病患者心肌存在線粒體Cyt-C釋放誘導的caspase3激活及心肌細胞凋亡，與心功能尚能維持的患者相比，其凋亡的心肌細胞數(shù)量顯著增加[12]，因此，心肌細胞凋亡是HF進展的重要促進因素。

在本研究中，我們主要觀察了Lu對HF大鼠心肌細胞線粒體相關(guān)指標的影響，發(fā)現(xiàn)Lu可減緩異丙腎上腺素誘導的HF大鼠心肌線粒體MMP、線粒體呼吸鏈復合酶SDH及COX活性的降低，同時線粒體相關(guān)凋亡因子Bax、caspase3、caspase9表達顯著降低，提示Lu可通過減輕異丙腎上腺素誘導的HF大鼠心肌線粒體損傷及凋亡，改善線粒體呼吸功能，發(fā)揮心肌保護作用。Lu是一種具有抗氧化、抗凋亡、抗炎作用的黃酮類化合物，可增加心肌中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽還原酶等抗氧化酶的活性，降低丙二醛、乳酸脫氫酶的釋放以及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，對心臟具有心肌保護作用[13]。有學者在缺血再灌注大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)Lu可減少心肌細胞凋亡及壞死，從而發(fā)揮心肌保護作用[14]；Re等[15]研究報道，Rho亞家族蛋白A/相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(Ras homolog family member A/Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 2,RhoA/ROCK2)信號通路可引起抑癌基因p53介導的Bax 表達上調(diào)，Bax 激活后大量轉(zhuǎn)移到線粒體中，導致線粒體中前凋亡因子釋放，引起caspase3 和 caspase9 激活，最終導致心肌細胞的凋亡。而王雷等[16]發(fā)現(xiàn)，Lu可能通過抑制RhoA/ROCK2 信號通路減少糖尿病小鼠心肌細胞凋亡，從而減輕糖尿病心肌損傷。本研究盡管未進一步對凋亡細胞進行組織學檢測，但我們證實了Lu可減少衰竭心肌Bax、caspase3、caspase9的表達，且根據(jù)上述研究我們認為，Lu很可能是通過減少衰竭心肌細胞的凋亡從而改善心臟功能。

綜上，Lu可能通過減輕線粒體損傷及抑制線粒體途徑的心肌細胞凋亡，對異丙腎上腺素誘導的HF大鼠心肌損傷起到保護作用，但仍需對其具體分子機制進行更深入研究，為Lu治療HF提供臨床理論依據(jù)。