唐克文，李娟，馮麗娜，李從榮

(武漢大學人民醫(yī)院，武漢430060)

耐碳青霉烯類藥物腸桿菌科細菌(CRE)的出現(xiàn)和傳播毫無疑問是一個重要的臨床和公共衛(wèi)生問題。產(chǎn)碳青霉烯酶是CRE最重要的耐藥機制之一，肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶(KPC)、新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶(NDM)、維羅納整合子編碼-β-內(nèi)酰胺酶(VIM)及亞胺培南水解β-內(nèi)酰胺酶(IMP)是產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細菌(CP-CRE)最常見的四種碳青霉烯酶，分別由blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP基因編碼，其中KPC屬絲氨酸類碳青霉烯酶，其余均為金屬-β-內(nèi)酰胺酶[1，2]。多年來，學者們一直致力于尋找碳青霉烯酶的有效檢測方法。2015年，Van der Zwaluw等[3]首次描述了碳青霉烯類失活法(CIM)實驗。2017年美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)推薦在實驗滅活期間將無菌水替換為胰蛋白酶大豆肉湯、延長孵育時間，有效提高了碳青霉烯酶檢測的敏感度，即改良碳青霉烯類失活法(mCIM)實驗。2018年，CLSI又將EDTA-碳青霉烯類失活法(eCIM)實驗引入操作指南。eCIM實驗原理基于金屬-β-內(nèi)酰胺酶必須依賴金屬離子鋅的存在才能有效發(fā)揮催化活性，絡(luò)合劑EDTA可在細菌孵育期間絡(luò)合2價鋅離子，達到抑制金屬-β-內(nèi)酰胺酶的作用[4,5]。mCIM與eCIM聯(lián)合試驗可以區(qū)分產(chǎn)金屬-β-內(nèi)酰胺酶和絲氨酸碳青霉烯酶的耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌，是一種操作簡便、價格低廉、經(jīng)濟實用的有效表型檢測方法。本研究通過mCIM試驗與eCIM試驗聯(lián)合檢測產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌，并與基因檢測結(jié)果進行比較，探討mCIM試驗與eCIM試驗在產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌耐藥表型檢測中的聯(lián)合應(yīng)用效能。

1 材料與方法

1.1 菌株、儀器及試劑 武漢大學人民醫(yī)院2016年2月～2017年2月臨床住院患者標本分離的對碳青霉烯類藥物(亞胺培南和/或美羅培南)敏感性降低(最小抑菌濃度≥2 μg/ml)的腸桿菌科菌株80株，其中肺炎克雷伯菌33株、大腸埃希菌19株、產(chǎn)氣克雷伯菌10株、陰溝腸桿菌7株、產(chǎn)酸克雷伯菌5株、弗勞地檸檬酸桿菌3株、摩根摩根菌2株、非脫羧勒克氏菌1株。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC?25922、大腸埃希菌ATCC?35218均購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心，質(zhì)控菌株肺炎克雷伯菌ATCC?BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCC?BAA-1706均由浙江大學邵逸夫醫(yī)院俞云松教授惠贈，質(zhì)控菌株肺炎克雷伯菌ATCC?BAA-2146由BD公司惠贈。PhoenixTM-100全自動細菌鑒定/藥敏分析儀購自美國Becton Dickinson公司，T100 PCR儀購自美國Bio-Rad公司，DYY-6C型電泳儀購自北京六一儀器廠，G:BOX Chemi XT4全自動凝膠成像分析系統(tǒng)購自英國SYNGENE公司，培養(yǎng)基購自廣州迪景公司，EDTA試劑、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)購自杭州濱和微生物公司，藥敏紙片(10 μg/片)購自英國OXIOD公司，2×Taq PCR Master Mix購自上海萊楓公司，PCR引物購自武漢金開瑞公司，DL1000 DNA Marker購自大連寶生物公司，Gel-Red核酸染料購自北京Biotech公司。

1.2 PCR法檢測碳青霉烯酶基因 煮沸法提取細菌DNA模板，設(shè)計blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM基因上、下游引物并委托武漢金開瑞生物工程有限公司合成，PCR反應(yīng)體系共20 μL,包括2×Taq PCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1.5 μL，ddH2O 7.5 μL。PCR擴增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，循環(huán)32次，72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳后于凝膠成像系統(tǒng)中觀察。以DL1000 DNA Marker作為分子量標準，出現(xiàn)明亮條帶且大小在預(yù)期范圍判斷為基因陽性[6]。

1.3 mCIM試驗與eCIM試驗聯(lián)合應(yīng)用檢測產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌耐藥表型 ①mCIM試驗。受檢菌株80株。用1 μL接種環(huán)取一環(huán)過夜培養(yǎng)的新鮮純菌落置于含2 mL TSB肉湯試管中，振蕩混勻后加入一張含10 μg美羅培南的無菌紙片，35 ℃環(huán)境孵育4 h，用10 μL接種環(huán)取出美羅培南紙片，貼于已涂布大腸埃希菌ATCC?25922懸液的MH平板表面，35 ℃孵育18～24 h，量取抑菌圈直徑。抑菌圈直徑6～15 mm或抑菌圈直徑16～18 mm但抑菌圈內(nèi)有針尖樣菌落為mCIM試驗陽性結(jié)果，抑菌圈直徑≥19 mm為陰性結(jié)果，抑菌圈直徑16～18 mm或抑菌圈直徑≥19 mm但抑菌圈內(nèi)有散在菌落為中介結(jié)果。mCIM試驗陽性結(jié)果表示菌株產(chǎn)碳青霉烯酶。②eCIM試驗。受檢菌株80株。用1 μL接種環(huán)取一環(huán)與mCIM試驗對應(yīng)的新鮮純菌落置于含2 mL TSB肉湯試管中，加入20 μL 0.5 mol/L的EDTA溶液，其余步驟同mCIM試驗，對應(yīng)菌株的mCIM與eCIM試驗紙片貼于同一MH平板表面。eCIM試驗結(jié)果只有當mCIM試驗為陽性結(jié)果時有意義，當mCIM試驗為陰性結(jié)果或中介結(jié)果時，eCIM試驗結(jié)果不作解釋[7]。eCIM試驗結(jié)果判斷標準：當eCIM試驗與mCIM試驗抑菌圈直徑相差≥5 mm時為陽性結(jié)果，即菌株產(chǎn)金屬-β-內(nèi)酰胺酶；當eCIM試驗與mCIM試驗抑菌圈直徑相差≤4 mm時為陰性結(jié)果，即菌株產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶。

1.4 mCIM試驗與eCIM試驗在產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌耐藥表型檢測中的聯(lián)合應(yīng)用效能分析 以碳青霉烯酶基因檢測結(jié)果為金標準，四格表法計算mCIM試驗檢測產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的敏感性和特異性，計算eCIM試驗檢測產(chǎn)金屬-β-內(nèi)酰胺酶、絲氨酸碳青霉烯酶菌株的敏感性和特異性。敏感性=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陰性數(shù))×100%，特異性=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陽性數(shù))×100%。分析mCIM試驗與eCIM試驗在產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌耐藥表型檢測中的聯(lián)合應(yīng)用效能。

2 結(jié)果

80株菌株中，檢測出攜帶blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM基因的菌株分別為27株、27株、7株、1株，其中1株肺炎克雷伯菌同時攜帶blaNDM和blaIMP基因，1株產(chǎn)酸克雷伯菌同時攜帶blaKPC和blaNDM基因，1株產(chǎn)酸克雷伯菌同時攜帶blaNDM和blaVIM基因，即產(chǎn)碳青霉烯酶菌株59株。其中32株產(chǎn)金屬-β-內(nèi)酰胺酶，26株產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶，1株同時產(chǎn)金屬-β-內(nèi)酰胺酶和絲氨酸碳青霉烯酶，詳見表1。PCR擴增產(chǎn)物電泳圖見圖1。

表1 80株受檢菌株的碳青霉烯酶基因型檢測結(jié)果(株)

注：M為DL1000 DNA Marker，條帶1、3、5、7為空白對照，條帶2為blaKPC基因(811 bp)，條帶4為blaVIM基因(370 bp)，條帶6為blaIMP基因(365 bp)，條帶8為blaNDM基因(281 bp)。

圖1 80株受檢菌株的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

80株菌株中，mCIM試驗陽性結(jié)果57株，陰性結(jié)果23株，即產(chǎn)碳青霉烯酶菌株57株。eCIM陽性結(jié)果28株，陰性結(jié)果29株，即產(chǎn)金屬-β-內(nèi)酰胺酶菌株28株，產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶菌株29株。詳見圖2、表2。

注：A1為產(chǎn)金屬-β-內(nèi)酰胺酶受檢菌株；A2為產(chǎn)金屬-β-內(nèi)酰胺酶對照菌株；B1為產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶受檢菌株；B2為產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶對照菌株；C1為不產(chǎn)碳青霉烯酶受檢菌株；C2為不產(chǎn)碳青霉烯酶對照菌株；D1為產(chǎn)碳青霉烯酶受檢菌株；D2為產(chǎn)碳青霉烯酶對照菌株；m為mCIM試驗；e為eCIM試驗。

圖2 部分菌株的mCIM試驗與eCIM試驗聯(lián)合檢測結(jié)果

表2 80株受檢菌株的mCIM與eCIM聯(lián)合試驗檢測產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌耐藥表型結(jié)果(株)

80株菌株中，59株碳青霉烯酶基因陽性菌株，其中57株試驗菌株mCIM試驗結(jié)果陽性，即mCIM試驗檢測產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的敏感性為96.6%(57/59)。80株菌株中，21株碳青霉烯酶基因陰性菌株，mCIM試驗結(jié)果均陰性，即mCIM試驗檢測產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的特異性為100.0%(21/21)。

80株菌株中，33株金屬-β-內(nèi)酰胺酶基因(blaNDM、blaVIM、blaIMP基因)陽性，其中28株試驗菌株eCIM試驗結(jié)果陽性，即eCIM試驗檢測產(chǎn)金屬-β-內(nèi)酰胺酶菌株的敏感性為84.8%(28/33)。80株菌株中，47株金屬-β-內(nèi)酰胺酶基因陰性，eCIM試驗結(jié)果均陰性，即eCIM試驗檢測產(chǎn)金屬-β-內(nèi)酰胺酶菌株的特異性為100.0%(47/47)。

80株菌株中，27株絲氨酸碳青霉烯酶基因(blaKPC基因)陽性，eCIM試驗結(jié)果均陰性，即eCIM試驗檢測產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶菌株的敏感性為100.0%(27/27)。80株菌株中，53株絲氨酸碳青霉烯酶基因陰性，其中51株試驗菌株eCIM試驗結(jié)果均陽性，即eCIM試驗檢測產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶菌株的特異性為96.2%(51/53)。

3 討論

各種類型的CRE中，CP-CRE受到最多的關(guān)注，因為它們最有可能造成細菌耐藥性的整體問題。碳青霉烯酶基因攜帶在質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子或其他可移動遺傳元件上，促進了革蘭陰性菌之間抗藥性的水平轉(zhuǎn)移，增加了環(huán)境和臨床腸桿菌科細菌的抗性儲存。此外，研究[8]發(fā)現(xiàn)，CP-CRE中的質(zhì)粒通常攜帶額外的抗性元件，具有增加細菌多重耐藥的潛力。目前尚不建議以碳青霉烯類耐藥機制指導(dǎo)治療方案，且碳青霉烯類耐藥機制的檢測在大多數(shù)臨床試驗室中并非常規(guī)，但CP-CRE的感染常伴隨著較高的治療失敗率及病死率，并且可能需要實施比非CP-CRE更多的感染控制干預(yù)措施，因此區(qū)分CP-CRE和非CP-CRE對于感染控制和流行病學研究十分重要[9]。Zhang等[10]的研究進行了中國首次全國范圍的CRE檢測，結(jié)果顯示產(chǎn)碳青霉烯酶是中國CRE的主要耐藥機制，NDM和KPC-2為主要碳青霉烯酶類型。本研究中，產(chǎn)金屬-β-內(nèi)酰胺酶菌株占產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的55.9%，與相關(guān)研究結(jié)果一致。然而，迄今為止，臨床常用β-內(nèi)酰胺酶抑制劑如舒巴坦、克拉維酸、三唑巴坦[11]和新型抑制劑——頭孢他啶-阿維吧坦，對NDM、VIM或IMP等金屬-β-內(nèi)酰胺酶仍然沒有作用[12，13]。有效的金屬-β-內(nèi)酰胺酶抑制劑一方面需保證不能破壞人體金屬酶，另一方面應(yīng)滿足對各種金屬-β-內(nèi)酰胺酶或同種類型金屬-β-內(nèi)酰胺酶起作用[14]。面對CP-CRE的感染，區(qū)分產(chǎn)金屬-β-內(nèi)酰胺酶和絲氨酸碳青霉烯酶可為抗生素的合理使用提供科學依據(jù)。我們認為，研發(fā)有效的金屬-β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，尤其是開發(fā)靶向NDM和KPC-2的抑制劑是國內(nèi)抗CRE治療的可行策略。

通過標準藥敏試驗確定菌株對碳青霉烯類藥物的耐藥性后，額外的表型試驗可以幫助確定CP-CRE，包括改良Hodge法(MHT)、Carba NP及其改良試驗、CIM及其改良試驗(mCIM)。另外，有研究[15]報道，基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)對碳青霉烯酶活性的檢測。隨著MALDI-TOF MS儀器在臨床微生物實驗室中逐漸推廣應(yīng)用，該方法可能會越來越受歡迎，但這些試驗的目標都是針對碳青霉烯酶的產(chǎn)生，沒有提供有關(guān)碳青霉烯酶表型的指導(dǎo)。本研究首先通過mCIM試驗完成對產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的檢測，與其他試驗相比，mCIM試驗具有重現(xiàn)性好、結(jié)果易判讀的優(yōu)點，不僅具有較高的敏感性和特異性，且對NDM、OXA-48靈敏度更高[16～18]，隨后結(jié)合eCIM試驗可檢測出碳青霉烯酶表型。2018年CLSI評價mCIM與eCIM聯(lián)合試驗檢測絲氨酸碳青霉烯酶和金屬-β-內(nèi)酰胺酶的敏感性>95%、特異性>92%，本研究中mCIM與eCIM聯(lián)合試驗檢測絲氨酸碳青霉烯酶的敏感性和特異性與之相符，但檢測金屬-β-內(nèi)酰胺酶的敏感性較低。我們分析認為，一方面是本研究菌株數(shù)量有限，另一方面是eCIM試驗的應(yīng)用需建立在mCIM的基礎(chǔ)上，本研究中mCIM試驗出現(xiàn)2個假陰性結(jié)果，因此2株實際產(chǎn)金屬-β-內(nèi)酰胺酶菌株的eCIM試驗結(jié)果被認為無效，這也體現(xiàn)出了eCIM試驗的局限性，只有確定為產(chǎn)碳青霉烯酶菌株(mCIM試驗結(jié)果陽性)時才有意義，不可單獨使用。除此之外，雖然2018年CLSI推薦當mCIM試驗陽性、eCIM試驗陰性時菌株可報告為絲氨酸碳青霉烯酶，但eCIM試驗實際只應(yīng)用于金屬-β-內(nèi)酰胺酶的檢測，所檢測菌株同時攜帶其他碳青霉烯酶時則不能區(qū)分且可能有假陰性結(jié)果，本研究中1株同時攜帶blaKPC和blaNDM基因的產(chǎn)酸克雷伯菌eCIM試驗結(jié)果既出現(xiàn)假陰性。

總之，mCIM與eCIM聯(lián)合試驗是一種操作簡便、價格低廉、經(jīng)濟實用的有效表型檢測方法。mCIM與eCIM聯(lián)合試驗檢測產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌耐藥表型的敏感性和特異性較高，對流行病學調(diào)查、感染控制和抗菌藥物管理優(yōu)化均具有重要意義。