劉 淼，陶能國(guó)，許靈春，吳育藩，楊文蒿，敬國(guó)興*

（湘潭大學(xué)化工學(xué)院，湖南 湘潭 411105）

2013年柑橘類水果全球產(chǎn)量超過(guò)1.23億 t[1]，柑橘果實(shí)具有很高的食用及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。據(jù)研究報(bào)道，指狀青霉（Penicillium digitatum）、意大利青霉（Penicillium italicum）和柑橘酸腐菌（Geotrichum citri-aurantii）是柑橘類水果中致病性最強(qiáng)的真菌[2-3]，這些致病真菌通常通過(guò)傷口感染宿主[4]，并在貯存過(guò)程中加速柑橘類水果的腐爛，從而導(dǎo)致果實(shí)喪失食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。一些合成類真菌抑制劑對(duì)指狀青霉和意大利青霉有很好的控制效果[5]，但大多數(shù)對(duì)酸腐菌生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用。Zhou Hai’en等[6]發(fā)現(xiàn)只有苯酚鈉可以部分控制酸腐菌的生長(zhǎng)，然而長(zhǎng)時(shí)間使用化學(xué)抑制劑不僅對(duì)環(huán)境造成污染，還威脅人類健康[7]。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)更安全、更環(huán)保的替代產(chǎn)品，來(lái)有效控制柑橘果實(shí)采后病菌的污染。

精油源自植物且具有抗真菌的生物活性[8]。研究證明，精油可以有效地控制采后水果的真菌污染[9-10]。此外，Liu等[11]研究表明，百里香精油處理后酸腐菌菌絲生長(zhǎng)發(fā)生改變。Zhou Hai’en等[6]發(fā)現(xiàn)，檸檬醛可以通過(guò)破壞酸腐菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和菌絲體形態(tài)從而抑制其生長(zhǎng)，但細(xì)胞膜被破壞后，有關(guān)細(xì)胞器損傷的進(jìn)一步研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

線粒體是一種重要的細(xì)胞器，可通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），破壞其結(jié)構(gòu)完整性促使生物體死亡[12]。大量研究報(bào)道，精油因其親脂性可破壞細(xì)胞膜，從而抑制真菌生長(zhǎng)[13-14]。李亞茹等[15]發(fā)現(xiàn)植物精油不僅可破壞線粒體膜、DNA修復(fù)系統(tǒng)等，還可影響氧化還原酶系和細(xì)胞能量代謝，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。有研究報(bào)道精油通過(guò)破壞黃曲霉細(xì)胞膜完整性而導(dǎo)致胞內(nèi)ATP泄漏，并抑制三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）中蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）和琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）活力[16]。類似地，Zheng Shiju等[17]發(fā)現(xiàn)經(jīng)檸檬醛處理后指狀青霉中不規(guī)則線粒體數(shù)量增加，且線粒體中檸檬酸合酶（citrate synthase，CS）、α-酮戊二酸脫氫酶（α-ketoglutarate dehydrogenase，α-KGDH）、異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，ICDH）、琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）活力明顯降低。本課題組前期研究結(jié)果表明，檸檬醛對(duì)酸腐菌的最小抑菌劑量（minimum inhibitory concentration，MIC）為0.5 μL/mL，最小殺菌劑量（minimum fungicidal concentration，MFC）為1.0 μL/mL[6]。本研究將探討MIC和MFC檸檬醛處理對(duì)柑橘酸腐菌線粒體形態(tài)和功能的影響，以期為檸檬醛在柑橘果實(shí)采后品質(zhì)保持方面的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

供試菌株保存于湘潭大學(xué)生物技術(shù)和食品工程系，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)4～5 d（28 ℃），孢子濃度用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器調(diào)整為5×106CFU/mL。

檸檬醛（純度＞95%） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；ATP、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）和一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）（純度≥98.5%） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；CS、α-KGDH、ICDH、SDH、MDH活力和CA含量檢測(cè)試劑盒（分析級(jí)）北京索萊寶科技有限公司。

PDB：100 g馬鈴薯煮沸后用4 層紗布過(guò)濾，再加入10 g葡萄糖，定容至500 mL。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：100 g馬鈴薯煮沸后用4 層紗布過(guò)濾，再加入10 g葡萄糖和10 g瓊脂，定容至500 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 日本Shimadzu公司；Quanta-200掃描電子顯微鏡（配有噴金程序Polaron） 美國(guó)FEI公司；Cary 60紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Agilent公司；TDL5A離心機(jī) 長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 線粒體的提取

將供試菌株接種于PDA培養(yǎng)基，于28 ℃培養(yǎng)5～7 d，用6 mm圓形打孔器取2 個(gè)菌斑，接種于100 mL PDB培養(yǎng)基，在28 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)。選取培養(yǎng)48 h的PDB培養(yǎng)基，加入檸檬醛使其終添加量分別為0.5 μL/mL和1.0 μL/mL（即MIC和MFC），以不加檸檬醛為空白對(duì)照，28 ℃分別培養(yǎng)0、30、60 min和120 min。將處理好的菌絲體于4 ℃、4 000 r/min條件下離心15 min，過(guò)濾后待提取線粒體用。

線粒體提取參照羅曼等[16]的方法，取1.0 g菌絲體（液氮充分研磨），加入2 mL提取液（含20 mmol/L HEPE-Tris、250 mmol/L甘露醇、10 mmol/L KCl、5 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）和20 mmol/L MgCl2，pH 7.2），然后用120 目尼龍布過(guò)濾。濾液于4 ℃、4 000 r/min條件下離心15 min，取上清液于12 000 r/min離心15 min，棄去上清液即得線粒體。

1.3.2 SEM觀察線粒體表面形態(tài)

參照Z(yǔ)heng Shiju等[17]的方法，采用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）觀察線粒體表面形態(tài)。將線粒體置于體積分?jǐn)?shù)3%的戊二醛溶液（0.1 mol/L磷酸緩沖液配制，pH 7.0）中，4 ℃保存24 h。樣品再依次在體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%和95%的乙醇溶液中梯度脫水20 min，最終在純乙醇中處理45 min。超低溫冰箱冷凍保藏2 h后真空干燥6～8 h。

將干燥的樣品通過(guò)噴金程序（60 s、1.8 mA、2.4 kV）涂上薄層（20～30 nm）金屬膜作為導(dǎo)電介質(zhì)。所有樣品用SEM于15 000倍下觀察。

1.3.3 HPLC法分析ATP、ADP、AMP含量

采用HPLC法分析樣品中ATP、ADP、AMP含量。參照Dai Ruihua等[18]的方法，具體操作步驟如下：取0.3 g菌絲體與10 mL超純水混勻后加入檸檬醛使其終劑量分別為0、0.5 μL/mL和1.0 μL/mL，處理0、30、60、120 min后取10 mL酸腐菌菌絲體懸浮液以8 000 r/min、4 ℃條件離心30 min，上清液用于測(cè)定胞外ATP、ADP、AMP含量，管底菌絲體用于測(cè)定胞內(nèi)ATP、ADP、AMP含量。胞外ATP、ADP、AMP含量的測(cè)定采用熱提取法，將上述上清液放入離心管并加入5 mL 100 ℃沸騰的2 mmol/L MgSO4提取液，搖勻，在沸水浴中保溫10 min后于冰浴中冷卻，4 ℃、4 000 r/min離心10 min后取上清液待測(cè)。胞內(nèi)ATP、ADP、AMP含量測(cè)定前，先采用熱提取法進(jìn)行提取，操作步驟同上，再用液氮破碎10 min，同樣條件下離心10 min，取上清液待測(cè)。

HPLC條件：色譜柱Inertsil ODS-SP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.05 mol/L KH2PO4-K2HPO4緩沖溶液（內(nèi)含1 mmol/L EDTA，pH 6.0）-甲醇（97.5∶2.5，V/V）；洗脫時(shí)間為12 min；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)溫度為25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為259 nm；進(jìn)樣體積為20 μL。

1.3.4 TCA循環(huán)中酶活力及CA含量的檢測(cè)

取待測(cè)樣本，按試劑盒說(shuō)明書操作步驟，用分光光度法分別對(duì)CS、α-KGDH、ICDH、SDH和MDH活力以及檸檬酸（citric acid，CA）含量進(jìn)行檢測(cè)。其中α-KGDH、ICDH和MDH的檢測(cè)波長(zhǎng)均為340 nm，CS、SDH和CA的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為412、600 nm和545 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 16.0軟件的單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，最小顯著性差異小于5%的數(shù)據(jù)認(rèn)為具有顯著性影響。采用Origin 8.5和Excel 2010軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬醛處理對(duì)酸腐菌線粒體表面形態(tài)的影響

圖1 酸腐菌線粒體SEM圖（×15 000）Fig. 1 Scanning electron micrograph of mitochondria in G. citri-aurantii (× 15 000)

由圖1可知，SEM結(jié)果顯示，添加檸檬醛培養(yǎng)120 min時(shí)，對(duì)照組中線粒體形狀規(guī)則、形態(tài)豐滿、表面光滑（圖1A），但隨著檸檬醛劑量的增加，線粒體表面變得粗糙、形狀不規(guī)則，在MFC（1.0 μL/mL）檸檬醛處理下，線粒體出現(xiàn)坍塌并破裂（圖1C）。

2.2 檸檬醛處理對(duì)酸腐菌胞內(nèi)和胞外ATP、ADP和AMP含量的影響

圖2 檸檬醛處理對(duì)酸腐菌胞內(nèi)（A）和胞外（B）ATP含量的影響Fig. 2 Effect of citral on the contents of intracellular (A) and extracellular (B) ATP in G. citri-aurantii

如圖2所示，培養(yǎng)0～120 min內(nèi)MIC和MFC檸檬醛處理組胞內(nèi)ATP含量明顯下降（圖2A），30 min時(shí)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。相反地，MIC和MFC檸檬醛處理組胞外ATP含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，且120 min時(shí)胞外ATP含量（0.42 μg/g和0.63 μg/g）顯著高于對(duì)照組（0.33 μg/g）（圖2B）。

圖3 檸檬醛處理對(duì)酸腐菌胞內(nèi)（A）和胞外（B）ADP含量的影響Fig. 3 Effect of citral on the contents of intracellular (A) and extracellular (B) ADP in G. citri-aurantii

由圖3可知，培養(yǎng)0～60 min內(nèi)，MIC檸檬醛處理組胞內(nèi)ADP含量呈下降趨勢(shì)，但60 min后開(kāi)始上升，120 min時(shí)胞內(nèi)ADP含量增加至11.07 μg/g，MFC檸檬醛處理組胞內(nèi)ADP含量在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程呈上升趨勢(shì)（圖3A），且顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。MIC和MFC檸檬醛處理組中，胞外ADP含量在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程呈上升趨勢(shì)，且顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）（圖3B）。

圖4 檸檬醛處理對(duì)酸腐菌胞內(nèi)（A）和胞外（B）AMP含量的影響Fig. 4 Effect of citral on the contents of intracellular (A) and extracellular (B) AMP in G. citri-aurantii

由圖4A可知，在整個(gè)培養(yǎng)期間菌絲體胞內(nèi)AMP含量呈下降趨勢(shì)，在培養(yǎng)120 min時(shí)MFC檸檬醛處理組含量?jī)H為3.86 μg/g，顯著低于對(duì)照組（7.24 μg/g）（P＜0.05）。MIC檸檬醛處理組與對(duì)照組胞外AMP含量無(wú)顯著差異（P＞0.05），而MFC檸檬醛處理組胞外AMP含量在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中呈上升趨勢(shì)，且在培養(yǎng)60～120 min時(shí)MFC檸檬醛處理組AMP含量迅速增加，顯著高于對(duì)照組和MIC檸檬醛處理組（P＜0.05）（圖4B）。

2.3 檸檬醛對(duì)酸腐菌TCA循環(huán)中關(guān)鍵酶活力和CA含量的影響

如圖5A所示，CS活力經(jīng)檸檬醛作用后被顯著抑制，培養(yǎng)120 min時(shí)，MIC和MFC檸檬醛處理組CS活力分別僅為對(duì)照組的47.64%和46.11%。如圖5B、C所示，檸檬醛處理后α-KGDH和ICDH的活力受到抑制，培養(yǎng)120 min時(shí)MIC和MFC檸檬醛處理組的α-KGDH活力分別為13.65 U/g和6.24 U/g，顯著低于對(duì)照組（34.84 U/g）；培養(yǎng)120 min時(shí)，對(duì)照組中ICDH活力為5.78 U/g，分別是MIC（2.49 U/g）和MFC（2.08 U/g）檸檬醛處理組活力的2.32 倍和2.78 倍。

圖5 檸檬醛處理對(duì)酸腐菌CS（A）、α-KGDH（B）和ICDH（C）活力的影響Fig. 5 Effect of citral treatment on the activity of CS (A), α-KGDH (B)and ICDH (C) in G. citri-aurantii

圖6 檸檬醛處理對(duì)酸腐菌SDH（A）和MDH（B）活力的影響Fig. 6 Effect of citral treatment on the activity of SDH (A) and MDH (B)in G. citri-aurantii

由圖6可知，檸檬醛處理后SDH和MDH的活力顯著降低，而對(duì)照組中2 種酶的活力基本保持不變。培養(yǎng)120 min后，MIC和MFC檸檬醛處理組的SDH活力分別為5.17、3.65 U/g，均顯著低于對(duì)照組（14.07 U/g）（P＜0.05）；類似地，與對(duì)照組相比，MIC和MFC檸檬醛處理組中MDH活力也相應(yīng)降低了80.89%和85.61%。

圖7 檸檬醛處理對(duì)酸腐菌CA含量的影響Fig. 7 Effect of citral treatment on the content of citric acid in G. citri-aurantii

由圖7可知，MIC和MFC檸檬醛處理組中CA含量整體呈下降趨勢(shì)，而對(duì)照組基本保持不變。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，檸檬醛處理組中CA含量持續(xù)降低，120 min時(shí)MIC和MFC檸檬醛處理組中CA含量分別為2.96 μmol/g和1.06 μmol/g，顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

3 討 論

有研究報(bào)道精油可以通過(guò)影響線粒體功能來(lái)發(fā)揮其抗真菌活性[19-21]，Perina等[22]發(fā)現(xiàn)百里香精油可破壞鏈格孢菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜，從而進(jìn)一步破壞線粒體。類似地，Romagnoli等[23]證明孔雀草精油可改變灰霉菌內(nèi)膜系統(tǒng)，導(dǎo)致其核膜溶解和線粒體退化。Park等[14]證明，檸檬醛可改變毛蘚菌屬真菌線粒體的形態(tài)，并極顯著抑制菌絲的生長(zhǎng)。本研究中，SEM結(jié)果清楚地表明，檸檬醛破壞酸腐菌的線粒體形態(tài)，添加檸檬醛培養(yǎng)120 min時(shí)，MIC組線粒體出現(xiàn)坍塌，MFC組的線粒體形態(tài)出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的破裂。與Zheng Shiju等[17]研究結(jié)果相似，檸檬醛可破壞指狀青霉線粒體膜，且高濃度檸檬醛處理可使其線粒體結(jié)構(gòu)坍塌。因此，檸檬醛可能通過(guò)對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)的破壞來(lái)抑制酸腐菌生長(zhǎng)。

生物體中能量的生成與線粒體結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)，Pinto等[24]指出纖毛苔草精油可明顯抑制酵母細(xì)胞線粒體酶活力和能量的生成。Turgis等[25]報(bào)道芥子精油處理后大腸桿菌和傷寒沙門氏菌胞內(nèi)ATP含量減少，且細(xì)胞膜完整性和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)遭到破壞。本研究結(jié)果表明，檸檬醛處理后酸腐菌線粒體膜被破壞且胞內(nèi)ATP含量下降，胞外ATP含量增加，這些結(jié)果證明胞內(nèi)ATP可通過(guò)損傷的細(xì)胞膜向細(xì)胞外泄漏，此現(xiàn)象與Burt[26]的研究結(jié)果一致，該研究中蠟樣芽孢桿菌經(jīng)香芹酚處理后胞內(nèi)ATP含量顯著下降，胞外ATP含量顯著增加。

除對(duì)ATP合成的影響外，精油處理還可加速ATP轉(zhuǎn)化為AMP、ADP[27]。本研究中檸檬醛處理120 min后酸腐菌中胞內(nèi)和胞外ADP的含量均呈顯著上升趨勢(shì)（P＜0.05），初步推測(cè)檸檬醛損傷線粒體的結(jié)構(gòu)造成ATP合成受損，ATP分解釋放能量維持菌絲體存活，從而導(dǎo)致ADP含量上升。但AMP與ADP含量的變化趨勢(shì)并不一致，檸檬醛處理后胞內(nèi)AMP含量下降，推測(cè)ATP分子中β-和γ-磷酸基團(tuán)中的高能鍵水解程度高于α-和β-磷酸基團(tuán)之間的高能鍵，故短時(shí)間內(nèi)ATP未直接水解為AMP而導(dǎo)致ADP大量積累。且檸檬醛處理組中線粒體膜損傷導(dǎo)致胞內(nèi)AMP泄露至胞外，故培養(yǎng)60 min后胞外AMP大量積累。

Huang等[28]研究證明，抑制α-KGDH活力可減少NADH＋H＋的生成，氫供體的缺乏導(dǎo)致ATP合成減少。本研究中，檸檬醛處理抑制酸腐菌中CS、ICDH、SDH、MDH、α-KGDH的活力，該類酶活力降低可減少TCA循環(huán)中NADH＋H＋和呼吸鏈中ATP的合成，導(dǎo)致線粒體功能受損而抑制柑橘類宿主真菌的生長(zhǎng)。

本研究結(jié)果表明，檸檬醛處理可破壞酸腐菌線粒體形態(tài)，MIC處理使線粒體結(jié)構(gòu)嚴(yán)重坍塌，MFC處理則破壞了線粒體膜的完整性，從而導(dǎo)致胞內(nèi)ATP、ADP和AMP泄漏至胞外。此外，檸檬醛可破壞線粒體功能，降低CS、α-KGDH、ICDH、SDH、MDH活力及CA含量。這些研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了檸檬醛通過(guò)破壞酸腐菌線粒體形態(tài)和功能進(jìn)而抑制其生長(zhǎng)。