韓昕，白維君

(遼寧省腫瘤醫(yī)院，沈陽110042)

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，近年來我國肺癌發(fā)病率逐年增高，雖然手術(shù)、放化療及新的靶向治療藥物不斷發(fā)展，患者病死率仍較高，5年生存率低[1]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是肺癌最常見的病理類型，目前仍缺乏有效的早期篩查手段，大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為中晚期，預(yù)后較差[2]。因此有必要深入研究NSCLC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。微小RNA(miRNA)是非編碼RNA調(diào)控因子，長度為18～25個(gè)核苷酸，參與多種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)控，在炎癥、腫瘤、自身免疫性疾病中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[3]。miR-155在乳腺癌、肺癌、膀胱癌等腫瘤組織中異常表達(dá)，與患者總體生存期有關(guān)[4]。有研究表明，miR-155可結(jié)合并抑制抑癌基因VHL、TP53INP1等的表達(dá)，并促進(jìn)核因子κB(NF-κB)、Janus酪氨酸蛋白激酶2/轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)通路的激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[5]。程序性細(xì)胞死亡因子4(PDCD4)基因位于人類染色體10q25.2，具有抑癌基因的作用，其編碼的PDCD4蛋白能結(jié)合并抑制真核翻譯起始因子4A(eIF4A)的解旋酶活性，抑制腫瘤細(xì)胞核糖體的蛋白合成過程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[6]。目前對(duì)NSCLC組織中miR-155與PDCD4的表達(dá)變化研究較少。本研究通過檢測(cè)NSCLC組織中miR-155、PDCD4的表達(dá)，初步探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年2月～2017年12月于本院就診并行手術(shù)治療的NSCLC患者60例，男34例，女26例；年齡41～62(52.1±6.3)歲；肺腺癌39例，鱗狀細(xì)胞癌(鱗癌)21例；TNM分期[7]：Ⅰ期15例、Ⅱ期20例，Ⅲ期20例，Ⅳ期5例；組織分化程度：高分化19例，中分化10例，低分化31例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)術(shù)后病理檢查診斷為NSCLC；既往未接受過免疫治療、化療等；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并急性感染性疾病(急性胃腸炎、呼吸道感染等)、其他惡性腫瘤病史、嚴(yán)重的肝肺等臟器功能不全。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 癌組織及癌旁組織中miR-155、PDCD4 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)。術(shù)中收集癌組織及其癌旁正常組織(距離癌組織邊緣3 cm以上)，置于凍存管內(nèi)液氮罐中速凍，于-80 ℃冰箱保存。取組織約100 mg，分別應(yīng)用總RNA提取試劑盒(RNAiso Plus，9108，Takara)及miRNA isolation試劑盒(RNAiso for Small RNA，9753A，Takara)提取組織中總RNA。紫外分光光度法鑒定RNA溶液的濃度及純度，-80 ℃冰箱保存。以總RNA為模板，分別用cDNA合成試劑盒(One Step PrimeScript RT-PCR Kit,RR064, Takara )合成cDNA。嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作。miR-155特異性莖環(huán)正向引物序列：5′-CGGCGGTTTAATGCTAATCGTGAT-3′，反向引物序列：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′；以U6作為內(nèi)參，上游引物序列:5′-CGGCGGTCGTGAAGCGTTCCAT-3′，下游引物序列：3′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-5′。PDCD4上游引物序列：5′-ATGTGGAGGAGGTGGATGTG-3′，下游引物序列：5′-TGGTGTTAAAGTCTTCTCAAATGC-3′；以β-actin作為內(nèi)參，上游引物序列：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，下游引物序列：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3′。miR-155的總反應(yīng)體系20 μL，包括cDNA 2 μL、上下游引物各1 μL、PCR Master MixⅡ 10 μL、TaqMan miRNA assay 1 μL、RNse free水6 μL。PDCD4總反應(yīng)體系25 μL，包括cDNA 2 μL、TaqDNA聚合酶0.25 μL、上下游引物各0.1 μL、10×PCR緩沖液2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，加雙蒸水補(bǔ)充至25 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min;95 ℃變性12 s、62 ℃退火50 s、72 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)均在ABI2500 qRT-PCR儀上完成，每個(gè)樣本重復(fù)3次。用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 癌組織與癌旁組織中miR-155、PDCD4 mRNA表達(dá)比較 癌組織與癌旁組織中miR-155相對(duì)表達(dá)量分別為3.342±0.784、0.651±0.192，PDCD4 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.133±0.021、1.153±0.352。癌組織中miR-155相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織(t=26.244，P=0.000)，PDCD4 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織(t=22.347，P=0.000)。

2.2 癌組織中miR-155、PDCD4 mRNA表達(dá)與NSCLC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 癌組織中miR-155、PDCD4 mRNA表達(dá)與腫瘤分期及組織學(xué)分級(jí)有關(guān)(P均<0.05)，而與患者性別、年齡及腫瘤病理類型、直徑及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

表1 癌組織中miR-155、PDCD4 mRNA表達(dá)與NSCLC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 NSCLC組織中miR-155與PDCD4 mRNA表達(dá)的相關(guān)性 NSCLC組織中miR-155相對(duì)表達(dá)量與PDCD4 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.618，P=0.000)。

3 討論

80%～85%的肺癌為NSCLC，而NSCLC中鱗癌和腺癌最為常見[8]。雖然近年來診斷和治療技術(shù)取得較大發(fā)展，但NSCLC患者的5年生存率仍較低[9]，因此需深入研究其發(fā)病機(jī)制。非編碼RNA如LncRNA、miRNA等在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，通過調(diào)控細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)及靶基因的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡及浸潤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為[10]。miRNA是一類小的非編碼RNA，是轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的主要參與者，可結(jié)合靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)，影響mRNA的穩(wěn)定性和基因表達(dá)。miRNA在正常生理和病理?xiàng)l件下均起重要的調(diào)控作用。腫瘤細(xì)胞內(nèi)的miRNA可促進(jìn)腫瘤相關(guān)基因(p65、STAT3等)的表達(dá)，同時(shí)能抑制抑瘤基因(PTEN、VHL等)的表達(dá)，在腫瘤增殖、凋亡、浸潤轉(zhuǎn)移、腫瘤干細(xì)胞特性維持、腫瘤代謝、腫瘤血管生成及免疫逃逸等多個(gè)方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在NSCLC組織中已檢測(cè)出多種miRNA表達(dá)異常，如miR-155、miR-133b等，檢測(cè)其表達(dá)有助于NSCLC的早期診斷、治療及預(yù)后評(píng)估[11]。其中miR-155可結(jié)合SOCS1、SOCS6和PTEN等基因mRNA的3′非編碼區(qū)，直接抑制抑瘤基因的表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)效應(yīng)。

PDCD4作為一種細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，能編碼長度約469個(gè)氨基酸，其氨基端的α螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)能結(jié)合翻譯起始因子eIF4A的N端，通過抑制核糖體復(fù)合物形成，影響蛋白合成。其在凋亡誘導(dǎo)過程中表達(dá)上調(diào)，而在直腸癌、胰腺癌等多種腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)其表達(dá)下調(diào)[12]?，F(xiàn)已證實(shí)多種miRNA能調(diào)控PDCD4表達(dá)，如胰腺癌組織中miR-429能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中PDCD4表達(dá)[13]，而在NSCLC組織中miR-21可調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，抑制PDCD4表達(dá)[14，15]。而目前NSCLC中miR-155與PDCD4的關(guān)系報(bào)道較少，有必要深入研究。

本研究癌組織中miR-155的相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織，與以往研究[16]報(bào)道一致。目前miR-155高表達(dá)的機(jī)制尚不明確，可能與其編碼基因miR-155HG啟動(dòng)子區(qū)的表觀遺傳學(xué)修飾，如乙?；揎椇蟮募せ钣嘘P(guān)[17]。尚有研究顯示，長鏈非編碼RNA(如XIST)能作為內(nèi)源競(jìng)爭性RNA結(jié)合miR-155，抑制miR-155對(duì)下游癌基因TERF1、CDX1等表達(dá)的影響，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，而腫瘤發(fā)生時(shí)XIST基因表達(dá)降低，對(duì)miR-155的抑制作用減弱[18]。此外，本研究NSCLC癌組織中miR-155的表達(dá)與腫瘤分期、組織學(xué)分級(jí)有關(guān)，腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化的癌組織中miR-155表達(dá)高。表明癌組織中miR-155表達(dá)與NSCLC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。研究表明，miR-155高表達(dá)能夠激活PI3K/SGK3/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者預(yù)后不良[19]。本研究癌組織中miR-155與PDCD4的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，其機(jī)制可能為PDCD4是miR-155的靶基因，miR-155能夠結(jié)合PDCD4 mRNA的3′非編碼區(qū)，通過降低PDCD4 mRNA穩(wěn)定性，干擾PDCD4的翻譯。而在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中沉默miR-155表達(dá)后，PDCD4表達(dá)增加，并抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤和侵襲[20]。

本研究癌組織中PDCD4 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織，其原因一方面與PDCD4基因5′CpG島的高甲基化影響基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)；另一方面小非編碼RNA降低PDCD4 mRNA的穩(wěn)定性，在翻譯水平降低其表達(dá)。此外，PDCD4能結(jié)合并抑制NF-κB p65的活性，抑制轉(zhuǎn)錄因子STAT3及下游靶基因表達(dá)，當(dāng)PDCD4表達(dá)減少后，STAT3促進(jìn)miR-181b表達(dá)，進(jìn)一步抑制PDCD4表達(dá)，形成一條負(fù)反饋環(huán)路。本研究NSCLC組織中PDCD4的表達(dá)與腫瘤分期、組織學(xué)分級(jí)有關(guān)，腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化癌組織中PDCD4表達(dá)低。表明PDCD4可能參與NSCLC發(fā)生發(fā)展的過程。目前其機(jī)制尚不明確，其原因可能為PDCD4表達(dá)越低，與轉(zhuǎn)錄因子twist1的DNA結(jié)合域的結(jié)合減少。twist1活化下游靶基因如Vimentin的表達(dá)，抑制E-鈣黏素的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，NSCLC組織中miR-155表達(dá)升高，而PDCD4表達(dá)降低，兩者共同參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展，有可能成為NSCLC診斷、治療及預(yù)后評(píng)估的腫瘤標(biāo)志物，但兩者之間的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。