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基于HPLC-UV特征圖譜與主成分分析的蔓荊子配方顆粒的質(zhì)量控制研究*

2019-09-18 09:22:58張永苗梁春霞王仁興薛志峰劉志東
天津中醫(yī)藥 2019年9期
關(guān)鍵詞:蔓荊子原兒茶酸苯甲酸

張永苗 ,張 兵 ,梁春霞 ,彭 輝 ,王仁興 ,薛志峰 ,劉志東

(1.天津中醫(yī)藥大學,現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程中心,天津 301617;2.天津中醫(yī)藥大學,天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地,天津 301617)

蔓荊子為馬鞭草科牡荊屬多年生落葉小灌木單葉蔓荊(Vitex trifolia L.var.simplicifolia Cham.)或蔓荊(Vitex trifolia L.)的干燥成熟果實[1],主產(chǎn)于山東、廣西、廣東、福建、江西、浙江等地。蔓荊子在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品,謂“荊實,味苦,微寒,主筋骨間寒熱,濕痹據(jù)攣,明目堅齒,利九竅,去白蟲,久服輕身耐老”[2]。蔓荊子中主要含有酚類、木脂素類、黃酮類、萜類等化學成分[3-9]。現(xiàn)代研究表明,蔓荊子具有鎮(zhèn)痛、抗炎、降壓、祛痰、抗腫瘤、抗衰老和改善微循環(huán)的藥理作用[10-13],常用于疏散風熱、清理頭目、止痛的功效。蔓荊子中主要含有原兒茶酸、對羥基苯甲酸、蔓荊子黃素3種活性成分,其中原兒茶酸具有抗菌[14]、抗炎[15]、抗氧化[16]、抑制腫瘤、鎮(zhèn)痛[17]、保護缺血和缺氧神經(jīng)元細胞[18-19]等作用,對羥基苯甲酸具有神經(jīng)保護和抗炎作用[20],蔓荊子黃素具有抗炎[21-24]、抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤[24-30]、免疫調(diào)節(jié)[18]的作用,它們是蔓荊子發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

相比傳統(tǒng)湯劑,中藥配方顆粒具有方便服用、高效、易攜帶和安全可控等優(yōu)點。本文在參照古法的基礎(chǔ)上,采用生品粉碎后進行水提、過濾濃縮、干燥制粒,可充分提取蔓荊子的有效成分,提高其配方顆粒的質(zhì)量。蔓荊子配方顆粒在性味歸經(jīng),功能主治方面與蔓荊子藥材一致。本文通過測定不同產(chǎn)地批次蔓荊子的配方顆粒中原兒茶酸、對羥基苯甲酸和蔓荊子黃素進行含量和指紋圖譜,并結(jié)合主成分分析方法對其指紋圖譜特征變量進行降維處理,尋求其在化學成分方面的共性與差異,根據(jù)相似相聚原理,區(qū)分優(yōu)劣,為蔓荊子配方顆粒的質(zhì)量控制和評價提供依據(jù)。

1 實驗儀器與試藥

安捷倫1260LC-VWD液相色譜儀(美國安捷倫公司);安捷倫1260LC-DAD液相色譜儀(美國安捷倫公司);B-290型噴霧干燥儀(瑞士Buchi公司);GL2-25干法制粒機(張家港開創(chuàng)機械制造有限公司);FA124型萬分之一天平(天津億諾科學儀器有限公司);XP205十萬分之一電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司);Milli-Q超純水機(美國Millipore公司)。

對羥基苯甲酸對照品(批號2169,含量以99.2%計)、原兒茶酸對照品(批號5668,含量以100%計)、蔓荊子黃素對照品(批號5185,含量以99.6%計)均購自上海詩丹德標準技術(shù)服務(wù)有限公司。糊精(西安天正藥業(yè)有限公司),乙腈、甲醇、磷酸、甲酸均為色譜純(購自Fisher Scientific公司),水為超純水。10批蔓荊子藥材均由黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司提供,編號分別為A1~A10,來源見表1。按2015年版《中國藥典》一部蔓荊子鑒別項下方法檢驗,鑒定為品為馬鞭草科植物單葉蔓荊(Vitex trifolia L.var.simplicifolia Cham.)或蔓荊(Vitex trifolia L.)的干燥成熟果實。按其含量測定項下測定蔓荊子黃素的含量,結(jié)果顯示,蔓荊子藥材中蔓荊子黃素含量均大于0.030%,符合藥典標準。

表1 蔓荊子產(chǎn)地及批號Tab.1 Producing places and batches of Viticis Fructus

2 方法與結(jié)果

2.1 蔓荊子配方顆粒含量測定方法的建立與測定

2.1.1 對照品儲備液的配制 取原兒茶酸15.26 mg、對羥基苯甲酸11.82 mg、蔓荊子黃素對照品10.46 mg,精密稱定,分別置于50、25和50 mL量瓶中,加60%甲醇分別制成每1 mL含原兒茶酸0.305 2 mg、對羥基苯甲酸0.469 0 mg、蔓荊子黃素0.208 4 mg的對照品儲備液。

2.1.2 混標溶液的配制 分別精密吸取上述各對照品儲備液2、5和2 mL適量于50 mL量瓶中,加60%甲醇制成每1 mL含原兒茶酸12.21 μg、對羥基苯甲酸 46.90 μg、蔓荊子黃素 8.335 μg的混合對照品溶液①。分別精密吸取上述各對照品儲備液10、25和10 mL于100 mL量瓶中,加60%甲醇制成每1 mL 含原兒茶酸 30.52 μg、對羥基苯甲酸 117.3 μg、蔓荊子黃素20.84 μg的混合對照品溶液②。

2.1.3 配方顆粒的制備 取A1~A10蔓荊子藥材粉碎成粗粉,加12倍水,回流提取2 h,趁熱濾過,減壓濃縮湯劑密度至1.020 g/cm3,按藥(干膏量)與糊精1∶1比例加入,混合均勻后,噴霧干燥,以干燥粉末進行干法制粒(每克配方顆粒相當于5 g蔓荊子飲片),所得10批顆粒依次編號記為S1~S10。

2.1.4 供試品溶液的制備 精密稱取蔓荊子配方顆粒粉末0.3 g,置于具塞錐形瓶中,精密加入25 mL 60%甲醇,密封,稱質(zhì)量,超聲處理45 min(功率400 W,頻率40 kHz),放冷,再次稱質(zhì)量,用60%甲醇補足減失質(zhì)量,靜置后取上清液,以0.22 μm孔徑的濾膜過濾,即得供試品溶液。

2.1.5 色譜條件 Agilent ZOBRAX Plus C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm),流動相為 0.1%磷酸水(A)-乙腈(B),梯度洗脫,0~3 min(93%A),3~13 min(93%-90%A),13~25 min(90%-83%A),25~35 min(83%-74%A),35~40 min(74%-60%A),40~45 min(60%-40%A),45~55 min(40%-10%A),流速1.0 mL/min,柱溫 35 ℃,進樣量 10 μL,程序性檢測波長,0~9 min(254 nm),9~9.01 min(254~258 nm),9.01~20 min(258 nm),20~20.01min(258~260 nm),20.01~55 min(260 nm)。理論塔板數(shù)按對羥基苯甲酸峰計算應(yīng)不低于3 000。

2.1.6 專屬性考察 取混合對照品溶液①和江西SQ80703的蔓荊子配方顆粒(S8)制備的供試品溶液,按“2.1.5”項下色譜條件分析。由圖1可知,原兒茶酸、對羥基苯甲酸、蔓荊子黃素混合對照品溶液、蔓荊子配方顆粒供試品溶液在相同的保留時間都有色譜峰,同時無溶劑峰干擾,表明方法專屬性良好。

圖1 專屬性考察圖譜Fig.1 HPLC chromatograms exclusive investigation

2.1.7 線性關(guān)系考察 精密稱取對照品原兒茶酸10.12 mg、對羥基苯甲酸25.42 mg、蔓荊子黃素10.26 mg,置于100 mL量瓶,加60%甲醇溶解,得每1 mL含原兒茶酸、對羥基苯甲酸和蔓荊子黃素分別為 0.101 2 mg、0.252 2 mg、0.102 2 mg 的混合對照品儲備液。將混合對照品儲備溶液分別進行2倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍稀釋,得系列濃度溶液,按“2.1.5”項下色譜條件測定峰面積,以溶液濃度為(μg/mL)橫坐標、其峰面積(mAU)為縱坐標,得原兒茶酸、對羥基苯甲酸和蔓荊子黃素的線性回歸方程分別為 Y=37.208X-2.269 1(r2=0.999 9)、Y=60.517X-6.483 0(r2=0.999 9)和 Y=30.455X-1.644 8(r2=0.999 9)。表明原兒茶酸、對羥基苯甲酸和蔓荊子黃素分別在 1.012~50.60 μg/mL、2.522~126.1 μg/mL和1.022~51.09 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.8 精密度考察 取混合對照品溶液①,按“2.1.5”項下色譜條件,連續(xù)進樣6次,計算對羥基苯甲酸、原兒茶酸和蔓荊子黃素峰面積的RSD分別為0.25%、0.27%和0.23%,表明儀器精密度良好。

2.1.9 穩(wěn)定性考察 精密吸取S8的供試品溶液10 μL,分別在 0、2、4、6、8、10、12、24、48 和 72 h 進樣,進樣室溫度與室溫一致,測定對羥基苯甲酸、原兒茶酸和蔓荊子黃素的峰面積,計算對羥基苯甲酸、原兒茶酸和蔓荊子黃素峰面積的RSD分別為0.22%、0.28%和0.39%,表明供試品溶液在室溫條件下72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.10 重復(fù)性考察 精密稱取S8的蔓荊子配方顆粒粉末6份,按“2.1.4”項下制備供試品溶液,按“2.1.5”項下色譜條件測定。結(jié)果蔓荊子配方顆粒中原兒茶酸、對羥基苯甲酸和蔓荊子黃素的平均含量分別為0.102 5%、0.390 1%和0.070 38%,RSD分別為0.64%、0.63%和0.72%,表明方法重復(fù)性良好。

2.1.11 加樣回收率考察 精密稱取S8的蔓荊子配方顆粒粉末0.15 g,按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液,分別精密加入混合對照品溶液②5 mL,平行制備6份,按“2.1.5”項下色譜條件測定。計算原兒茶酸、對羥基苯甲酸和蔓荊子黃素的回收率分別為99.56%、100.7%和104.3%,RSD分別為0.65%、0.47%和0.68%,結(jié)果表明方法準確度良好。見表2。

2.1.12 樣品含量測定 取S1~S10的蔓荊子配方顆粒,按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液,按“2.1.5”項下色譜條件進行測定,計算10批蔓荊子配方顆粒中對羥基苯甲酸、原兒茶酸和蔓荊子黃素的含量。各批次蔓荊子配方顆粒中的原兒茶酸含量范圍在0.070 77%~0.142 0%之間、對羥基苯甲酸含量在0.257 6%~0.719 3%之間、蔓荊子黃素含量在0.016 57%~0.143 0%之間。10批蔓荊子顆粒中的原兒茶酸含量相差2.0倍,對羥基苯甲酸含量相差2.8倍,蔓荊子黃素含量相差8.6倍,說明不同產(chǎn)地批次的蔓荊子所制備的配方顆粒有效成分含量差異大。見表3。

表2 原兒茶酸、對羥基苯甲酸和蔓荊子黃素的加樣回收率實驗相關(guān)數(shù)據(jù)Tab.2 Relevant data of recovery test for protocatechuic acid,parahydroxybenzoic acid and viticin

其中江西產(chǎn)地的蔓荊子所制備的蔓荊子配方顆粒(S7~S10)3種主要活性成分含量均較高,明顯優(yōu)于原藥材為安徽的配方顆粒(S1~S3)和原藥材為廣西的配方顆粒(S4~S6)。根據(jù)《中國藥典》2015版對蔓荊子藥材進行質(zhì)量檢查,其中江西產(chǎn)地的蔓荊子藥材質(zhì)量優(yōu)于安徽和廣西等地藥材,結(jié)果如表1所示。藥材質(zhì)量檢查結(jié)果與顆粒劑含量測定結(jié)果一致,表明使用江西產(chǎn)地的優(yōu)質(zhì)藥材所制備的配方顆粒質(zhì)量也較優(yōu)。

2.2 蔓荊子配方顆粒指紋圖譜的建立與測定

2.2.1 指紋圖譜的建立 取S8蔓荊子配方顆粒,按照“2.1.4”項下方法制作供試品溶液,按“2.1.5”項下色譜條件進行測定,記錄色譜圖,確定了其中10個峰面積較大的特征峰,其中峰2、峰3、峰10分別是原兒茶酸、對羥基苯甲酸、蔓荊子黃素。見圖2。原兒茶酸是蔓荊子藥材及其配方顆粒中的主要有效成分之一,各個批次的蔓荊子藥材所制備的蔓荊子配方顆粒中均含有此峰,峰面積占總峰面積適宜,無其他干擾峰,因此確定原兒茶酸作為指紋圖譜參照峰。

表3 原兒茶酸、對羥基苯甲酸、蔓荊子黃素的含量測定結(jié)果Tab.3 Results of content determination of protocatechuic acid,parahydroxybenzoic acid and viticin

圖2 蔓荊子配方顆粒的指紋圖譜Fig.2 Fingerprint chromatogram of Viticis Fructus formula granules

2.2.2 專屬性考察 取混合對照品溶液①和S8蔓荊子配方顆粒制備的供試品溶液,按“2.1.5”項下色譜條件分析?;旌蠈φ掌啡芤?、供試品溶液在相同的保留時間都有色譜峰,并無溶劑峰干擾,專屬性良好,如圖1所示。

2.2.3 精密度考察 取S8蔓荊子配方顆粒制備的供試品溶液,按“2.1.5”項下色譜條件分析,連續(xù)進樣6次,得指紋圖譜。計算得供試品溶液中各共有峰相對保留時間的RSD在0.078%~0.14%之間,相對峰面積的RSD在0.15%~1.1%之間,表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性考察 取S8蔓荊子配方顆粒制備的供試品溶液,按“2.1.5”項下色譜條件分析,分別在0、2、4、6、8、10、12、24、48、72 h 進樣,進樣室溫度與室溫一致,測得指紋圖譜,計算得供試品溶液中各共有峰相對保留時間的RSD在0.14%~1.1%之間,相對峰面積的RSD在0.53%~5.8%之間,表明樣品溶液在室溫條件下72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 重復(fù)性考察 取S8蔓荊子配方顆粒按“2.1.4”項下方法平行制備6份供試品溶液,按“2.1.5”項下色譜條件分析,計算得供試品溶液中各共有峰相對保留時間的RSD在0.032%~0.13%之間,相對峰面積的RSD在0.21%~0.75%之間,表明方法重復(fù)性良好。

2.2.6 指紋圖譜相似度評價 取S1~S10的蔓荊子配方顆粒,按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液,按“2.1.5”項下色譜條件進行測定,將色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”,建立10批蔓荊子配方顆粒(S1~S10)的指紋圖譜疊加圖,見圖3。得到蔓荊子配方顆粒對照指紋圖譜(R),每批樣品與R比較,計算10批顆粒劑指紋圖譜相似度,S1~S10樣品相似度結(jié)果分別是0.975,0.984,0.993,0.992,0.914,0.996,0.992,0.976,0.976,0.978。10批蔓荊子配方顆粒的指紋圖譜相似度差異不大,表明其化學成分含量總體穩(wěn)定。

2.7 主成分分析 主成分分析是考察多個變量間相關(guān)性的一種多元降維統(tǒng)計方法,通過研究少數(shù)幾個主成分來揭示多個變量間的內(nèi)部結(jié)構(gòu),描述最大的變異量,能夠有效研究樣本組分上的差別[31]。中藥指紋圖譜可較全面地表征中藥中的多種化學成分,指紋圖譜結(jié)合主成分分析可評價藥物之間的相似性和差異性,是適合中藥特點的質(zhì)量控制方法[32-35]。

主成分分析方法對蔓荊子配方顆粒指紋圖譜中的10個特征峰進行分析,特征峰信息見圖3,以2號峰(原兒茶酸)為參照峰,得到各特征峰的相對峰面積,見表4。采用SIMCA 14.0軟件,以各特征峰的相對峰面積為變量,對10批蔓荊子配方顆粒的指紋圖譜特征峰進行主成分分析。選取3個主成分建立分析模型,結(jié)果累計貢獻率達82.4%,能代表特征峰的信息。分別利用3個主成分(PC1,PC2,PC3)進行區(qū)分,將變量投影在二維空間上,擬合分析生成10批蔓荊子配方顆粒的主成分分析得分圖和載荷圖,分別用來觀察蔓荊子配方顆粒所用藥材的產(chǎn)區(qū)分布狀況和分析各個特征峰對產(chǎn)地區(qū)分所起的貢獻作用。

圖3 蔓荊子配方顆粒的指紋圖譜疊加圖和對照指紋圖譜RFig.3 Fingerprints overlay and contrast fingerprint R of Viticis Fructus formula granules

表4 10批蔓荊子配方顆粒高效液相色譜(HPLC)特征峰的相對峰面積Tab.4 Relative peak areas of HPLC characteristic peaks of 10 batches of Viticis Fructus formula granules

主成分分析的得分圖見圖4,根據(jù)相似相聚原理,明顯分為2類,江西產(chǎn)地蔓荊子的配方顆粒(S7~S10)樣品聚為一類,安徽和廣西產(chǎn)地蔓荊子的配方顆粒(S1~S6)聚為一類。廣西產(chǎn)地蔓荊子的配方顆粒(S4~S6)分散比較集中,安徽產(chǎn)地蔓荊子的配方顆粒(S1~S3)同產(chǎn)區(qū)的差異相對較大。根據(jù)10批蔓荊子顆粒劑含量測定結(jié)果可知,江西的蔓荊子藥材質(zhì)量較優(yōu),用該產(chǎn)地蔓荊子藥材制備配方顆粒,測得顆粒中3種活性成分含量均較高,指紋圖譜相似度較高,主成分分析方法通過對指紋圖譜特征峰進行分析,將江西產(chǎn)地的蔓荊子制備的顆粒劑聚在一起,表明江西產(chǎn)地蔓荊子的顆粒劑化學成分含量穩(wěn)定,質(zhì)量均一性良好,故可判斷出江西產(chǎn)地蔓荊子藥材制備的配方顆粒較其安徽和廣西產(chǎn)地的優(yōu)質(zhì)。

圖4 10批蔓荊子配方顆粒HPLC特征峰主成分分析得分圖Fig.4 Score plot of HPLC characteristic peaks of 10 batches of Viticis Fructus formula granules

主成分分析載荷圖見圖5,距離載荷圖原點越遠的變量,其絕對值越大,對分類模型總體方差貢獻程度越高,代表該特征峰對產(chǎn)地分布所起的作用越大。由圖可知,所選的特征峰峰均對分類模型有較高的貢獻度,貢獻度最大的3個峰分別為峰3(對羥基苯甲酸)、峰5、峰10(蔓荊子黃素),鑒于峰5化合物成分尚不明確,且在蔓荊子藥材及配方顆粒中含量相對較低,難以準確定性定量,而峰3、峰10為蔓荊子藥材及配方顆粒的主要活性成分,含量較高,對分類模型貢獻度最大。本研究選擇的10個共有峰具有明顯的特征性,可作為該模型的特征變量。

圖5 10批蔓荊子配方顆粒HPLC特征峰主成分分析載荷圖Fig.5 Loading plot of HPLC characteristic peaks of 10 batches of Viticis Fructus formula granules

3 討論

通過3D全波長(190~400 nm)掃描,得原兒茶酸、對羥基苯甲酸和蔓荊子黃素最大吸收波長分別為260 nm、254 nm和258 nm,故采用程序性波長對含量測定和指紋圖譜進行準確、便捷、高效的研究。

蔓荊子配方顆粒既保留了原藥材的功用,又能安全、有效、便捷、質(zhì)量可控地應(yīng)用于臨床。根據(jù)蔓荊子炮制的文獻考證,蔓荊子在唐代及以前以生用破碎為主,宋代以后又增加炒制、酒浸的炮制方法[36],如今蔓荊子的生品和微炒后的炮制品應(yīng)用較多,炒制雖會提高蔓荊子總黃酮含量[7,37],但其鎮(zhèn)痛效果明顯下降[38]。本實驗以水為提取溶劑,采用粉碎蔓荊子藥材的方式來提高其有效成分的提取效率。

鑒于中藥湯劑中含有較多的糖類和鞣質(zhì)成分,濕法制粒難度大,為防止顆粒劑花?,F(xiàn)象,故采用內(nèi)加輔料法噴霧干燥、干法制粒。甘露醇、蔗糖、乳糖、糊精和淀粉均是常用的稀釋劑,乳糖易溶于水,化學性質(zhì)穩(wěn)定,無吸濕性,但乳糖含糖量較高,不適合高血壓、齲齒等患者的長時間服用。甘露醇溶解效果好,內(nèi)加輔料得率低,損失大,成型率、外觀效果均較差。淀粉的溶解效果較差,影響顆粒的溶解度,而糊精的溶解性比淀粉好,綜合考慮,最終確定糊精作為制備蔓荊子配方顆粒的輔料。

原兒茶酸、對羥基苯甲酸和蔓荊子黃素作為蔓荊子配方顆粒的主要活性成分,定量分析這3種主要活性成分是保證蔓荊子配方顆粒安全、有效應(yīng)用的前提。根據(jù)顆粒劑中單個化學成分的高低來難以判斷藥物質(zhì)量,指紋圖譜能較全面的反映蔓荊子配方顆粒的化學成分及其相對比例,鑒于個體樣本本身的差異,可通過選擇圖譜中特征峰對其進行整體性評價。鑒于中藥材的產(chǎn)地對藥物的質(zhì)量和療效有影響[39-40],本文以不同產(chǎn)地蔓荊子藥材制備的配方顆粒為例,基于HPLC-UV法的含量測定結(jié)合指紋圖譜分析與主成分分析的評價方法,在一定程度上表征了10批蔓荊子配方顆粒在化學成分方面的共性與差異,可區(qū)分出由江西產(chǎn)地的蔓荊子所制備的配方顆粒質(zhì)量最佳,均一性良好,基于三者的綜合信息,可以為蔓荊子配方顆粒甄選原藥材、質(zhì)量控制和評價提供相應(yīng)的依據(jù)。

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