鄒昌業(yè) 蘇喬 李武國 趙巨鵬 樊澤培 陳俊愷 尹軍強(qiáng) 沈靖南

骨肉瘤是源自骨間葉細(xì)胞的惡性原發(fā)骨腫瘤，多見于青少年和兒童。腫瘤肺轉(zhuǎn)移是骨肉瘤患者病死的主要原因?；瘜W(xué)治療可以降低骨肉瘤患者的肺轉(zhuǎn)移率[1]。截止至2018年，美國14歲以下骨肉瘤患者5年生存率為69.8%，15～19歲患者5年生存率為65.5%[2]。骨肉瘤的規(guī)范化療方案仍待進(jìn)一步研究。目前，關(guān)于骨肉瘤治療的一線藥物已基本達(dá)成共識，但化療方案和治療時間還存在較大差異[3]。個體化治療的興起對化療方案提出了新的要求。為了得到更加有效的化療方案，制備適宜的臨床前模型至關(guān)重要。目前常用的臨床前模型包括細(xì)胞株模型、細(xì)胞株異種移植(cell-derived xenograft，CDX)模型和源自患者的異種移植(patient-derived xenograft，PDX)模型等。細(xì)胞株的培養(yǎng)與使用方便快捷，但在體外培養(yǎng)過程中缺乏腫瘤在體內(nèi)生長的微環(huán)境，反復(fù)傳代后為適應(yīng)體外培養(yǎng)環(huán)境而發(fā)生變異，不能較好地反映腫瘤的異質(zhì)性和患者的個體特征，也不具有免疫系統(tǒng)。將細(xì)胞株植入免疫缺陷鼠，建立CDX模型[4]，所得到的腫瘤組織相較于細(xì)胞株具有有限的瘤內(nèi)異質(zhì)性和免疫系統(tǒng)，但依然不能反映患者的個體特征。PDX模型實現(xiàn)了患者腫瘤組織在免疫缺陷鼠體內(nèi)成瘤，保留了患者的分子表型和基因型，可以很好地預(yù)測后期臨床結(jié)果[5]。本研究收集骨肉瘤患者的腫瘤組織標(biāo)本，建立該患者腫瘤細(xì)胞的CDX模型和PDX模型，為骨肉瘤患者化療方案的研究奠定基礎(chǔ)。

資料與方法

一、資料

1.腫瘤細(xì)胞：患者，女，24歲，2016年8月21日因“右小腿近端疼痛”就診于中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨腫瘤科。診斷為右脛骨骨肉瘤。接受3次新輔助化療后，與2016年11月2日接受右脛骨上段和下段腫瘤切除及假體重建術(shù)。術(shù)后接受12次輔助化療并定期復(fù)查。2018年4月13日病理學(xué)檢查結(jié)果提示：穿刺物鏡下為梭形細(xì)胞腫瘤，細(xì)胞具輕度異性，初步考慮間葉源性惡性腫瘤。2018年4月27日在接受化學(xué)治療期間出現(xiàn)持續(xù)發(fā)熱和腫塊疼痛、增大，遂停止化學(xué)治療。2018年5月17日接受右大腿截肢術(shù)。術(shù)中獲取患者新鮮活性腫瘤組織。

2.實驗動物：使用4～6周齡BALB/c裸鼠15只(購于江蘇集萃藥康生物技術(shù)有限公司)。飼養(yǎng)于中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物實驗中心SPF級實驗室[動物使用許可證：SYXK(粵)2015-0108]。

本研究獲中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)?；颊吆炇鹬橥鈺?。

二、方法

1.原代腫瘤細(xì)胞的獲取：于截肢術(shù)術(shù)中切取患者腫瘤包膜下無壞死區(qū)域。使用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)對活性標(biāo)本進(jìn)行震蕩洗滌，去除標(biāo)本組織中的血液。將標(biāo)本剪切為2 mm3組織塊，加入少量胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)重新懸浮，以眼科鑷將組織塊逐塊貼附于直徑10 cm培養(yǎng)皿中，于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中靜置4 h，添加完全培養(yǎng)基(高糖DMEM培養(yǎng)基添加10%FBS、1%青霉素和鏈霉素和1%谷氨酰胺，均購自美國Gibco公司)，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

待組織塊中大量細(xì)胞遷出后，使用0.25%胰蛋白酶37℃消化3 min，收集細(xì)胞，標(biāo)記為原代(P0)。收集的細(xì)胞重新種植后，標(biāo)記為第1代(P1)。細(xì)胞長滿90%培養(yǎng)皿時，分別使用0.25%胰蛋白酶37℃消化3 min和5 min，收集不同消化時間的細(xì)胞。將不同消化時間的細(xì)胞以培養(yǎng)液重新懸浮后，反復(fù)貼壁，進(jìn)一步將成纖維細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分離。重復(fù)胰蛋白酶消化、反復(fù)貼壁、靜置培養(yǎng)3次后，觀察到多邊形和球形腫瘤細(xì)胞。使用滅菌后的棉簽劃去周邊成纖維細(xì)胞，得到原代腫瘤細(xì)胞。對其進(jìn)行擴(kuò)增，至第5代(P5)得到腫瘤細(xì)胞比例較高的原代腫瘤細(xì)胞。

2.CDX模型的建立：取指數(shù)增長期第10代(P10)原代腫瘤細(xì)胞，使用0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，計數(shù)后使用PBS重新懸浮。使用10只裸鼠分為2組，分別建立皮下和脛骨原位CDX模型，每組5只。75%乙醇溶液消毒BALB/c裸鼠皮膚后，在小鼠背部皮下注射75 μl細(xì)胞懸液(含150萬個細(xì)胞)，脛骨髓腔注射20 μl細(xì)胞懸液(含150萬個細(xì)胞)。30 d后以頸椎脫臼方法處死小鼠，收集腫瘤組織，使用4%多聚甲醛固定，制備石蠟切片。

將備好的石蠟切片置于組織切片架上并置入烘箱，65℃靜置30 min。將組織切片置于通風(fēng)櫥中，自然冷卻至室溫，依次在二甲苯、梯度(100%、90%、80%、70%、60%)乙醇溶液和超純水中復(fù)水。使用濾紙吸干水分后，浸入蘇木素染料中3 min，取出組織切片，使用超純水洗去多余的蘇木素。再次吸干水分后，滴加1%鹽酸乙醇溶液，分化5 s，使用超純水清洗后，吸干水分，加入1%氨水乙醇溶液返藍(lán)10 s，使用超純水清洗后，吸干水分。浸入伊紅溶液中20 min，使用超純水清洗后，吸干水分，滴加乙醇脫水，滴加中性樹膠，使用蓋玻片封片。風(fēng)干后顯微鏡下檢查。

3.PDX模型的建立：使用BALB/c裸鼠5只。將骨肉瘤患者新鮮活性腫瘤組織剪成2 mm×2 mm×3 mm 的組織塊，使用FBS混懸。75%乙醇溶液消毒小鼠皮膚后，以眼科剪在小鼠背部剪開約0.6 mm長的切口，于切口兩側(cè)皮下分別接種腫瘤組織，每只小鼠接種3～4個部位，以手術(shù)縫合線縫合切口。將小鼠置于保溫毯上，待蘇醒后放回籠盒中。

將從患者身上獲得的活性腫瘤組織標(biāo)記為P0腫瘤組織，移植于BALB/c裸鼠體內(nèi)首次形成的腫瘤組織(體積為800～1 500 mm3)標(biāo)記為P1移植腫瘤組織。植入小鼠體內(nèi)5個月后，P1組織體積達(dá)到900 mm3，收獲腫瘤組織。將得到的腫瘤組織分為3部分：第1部分用以重復(fù)上述操作，以建立穩(wěn)定的PDX模型；第2部分用以剪碎至10 mm3，加入凍存液(10%DMSO+90%FBS)凍存于液氮罐；第3部分用以制備HE染色切片。

結(jié) 果

一、患者腫瘤組織標(biāo)本

患者腫瘤組織標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞異型性明顯，存在病理性核分裂，形態(tài)符合間葉源性惡性腫瘤(圖1)。

二、原代細(xì)胞的獲取

患者活性腫瘤組織塊遷出的細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化和反復(fù)貼壁方法處理后，可以觀察到呈多邊形的細(xì)胞，形態(tài)與纖維狀的成纖維細(xì)胞明顯不同(圖2A)。刮去成纖維細(xì)胞后再進(jìn)行種植擴(kuò)增，所獲得細(xì)胞具有類上皮樣細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)，多為多邊形，部分為球形(圖2B)。

三、CDX模型的建立

小鼠皮下和脛骨原位CDX成瘤率均為100%。P10腫瘤細(xì)胞在脛骨髓腔成瘤后，逐漸侵襲骨組織。收取標(biāo)本時，小鼠脛骨橫截面可見骨肉瘤組織由肌肉組織包裹，未見骨組織(圖3A)。腫瘤組織內(nèi)存在壞死，腫瘤細(xì)胞核質(zhì)比較大，呈多核，存在有核分裂像(圖3B)。皮下腫瘤組織與周邊組織有明顯的分界(圖3C)。腫瘤細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核質(zhì)比較大，呈多核，核分裂明顯(圖3D)。

圖1患者腫瘤組織標(biāo)本病理學(xué)表現(xiàn)(HE)A腫瘤組織標(biāo)本全貌B腫瘤細(xì)胞存在核分裂像，符合間葉源性惡性腫瘤特點(diǎn)(×400)

圖2原代腫瘤細(xì)胞(×100)A反復(fù)貼壁后的細(xì)胞形態(tài)B腫瘤細(xì)胞生長形態(tài)

圖3CDX模型腫瘤組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE)A脛骨髓腔成瘤及周邊組織形態(tài)B腫瘤細(xì)胞成無規(guī)排列，核質(zhì)比較大(×400)C皮下成瘤及周邊組織形態(tài)D腫瘤細(xì)胞多核分布，核分裂像明顯(×400)

四、PDX模型的建立

PDX成瘤率為60%。小鼠腫瘤組織有明顯的包膜(圖4A)，細(xì)胞與患者腫瘤組織細(xì)胞形態(tài)基本相似，呈異型性，核質(zhì)比較大，存在核分裂像(圖4B)。

圖4PDX模型腫瘤組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE)A腫瘤及周邊組織形態(tài)B腫瘤組織與患者腫瘤組織相似，細(xì)胞間質(zhì)較多，存在核分裂像(×400)

討 論

骨肉瘤是兒童和青少年人群常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，嚴(yán)重危害青少年身體健康。骨肉瘤主要包括3種類型，即髓內(nèi)骨肉瘤、表面骨肉瘤和骨外骨肉瘤，每種類型又可分為多個病理亞型，患者個體差異較大[6]。臨床上通過規(guī)范的手術(shù)和化學(xué)治療可以顯著改善骨肉瘤患者的預(yù)后。然而，骨肉瘤的病理多樣性和基因組異質(zhì)性導(dǎo)致其診斷困難[7]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)針對患者的個體差異，提出了個體治療概念。骨肉瘤的治療亦需要針對不同的患者，結(jié)合其病理特征和對藥物的反應(yīng)，制訂不同的個體化治療方案。

適宜的臨床前模型是制訂有效化療方案的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的骨肉瘤細(xì)胞株，由于在體外培養(yǎng)過程中缺乏體內(nèi)生長的微環(huán)境，細(xì)胞的生物學(xué)特性可能發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的改變，不能反應(yīng)患者腫瘤細(xì)胞最初的特征，不能滿足制訂個體化治療方案的需要。PDX模型是將患者新鮮的腫瘤組織植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)，保留了原代腫瘤細(xì)胞更多的特性，同時便于監(jiān)測腫瘤的生長狀況。待腫瘤生長到一定體積，可以對腫瘤組織再進(jìn)行異位或原位移植。原位移植是將腫瘤組織直接植入小鼠體內(nèi)人類原發(fā)灶對應(yīng)器官。原位移植腫瘤具有與患者腫瘤更加相似的微環(huán)境，能夠更準(zhǔn)確地模擬其來源腫瘤[8]。孫夢熊等[9]使用骨與軟組織肉瘤組織建立PDX模型，成功率為30%～40%，模型與臨床病例具有較好的相似性。Blattmann等[10]通過手術(shù)建立骨肉瘤脛骨原位PDX模型，MRI和組織病理學(xué)研究結(jié)果顯示移植后的組織與原代腫瘤組織具有相同的結(jié)構(gòu)，移植后的組織傳代3次后，基因組與原代腫瘤組織仍高度相似。但是，PDX模型存在生長周期長、費(fèi)用高和成功率低等局限性[11]。

為彌補(bǔ)PDX模型的不足，本研究在建立PDX模型的基礎(chǔ)上，分離患者的原代細(xì)胞系，并使用傳代次數(shù)較少的原代細(xì)胞系細(xì)胞進(jìn)行異種移植，建立CDX模型。一方面，原代腫瘤細(xì)胞保留了患者腫瘤細(xì)胞最初的特點(diǎn)，可以更高程度反應(yīng)患者腫瘤的特性；另一方面，在CDX模型建立過程中為腫瘤細(xì)胞提供了類似患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長所需的微環(huán)境，可避免體外培養(yǎng)引起的腫瘤細(xì)胞變異，使CDX模型可以起到類似PDX模型的作用，呈現(xiàn)出腫瘤細(xì)胞在類似患者體內(nèi)微環(huán)境下對化學(xué)治療藥物的反應(yīng)。自新鮮腫瘤組織塊遷出的細(xì)胞以紡錘狀成纖維細(xì)胞為主，未能直接觀察到腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞與成纖維細(xì)胞貼壁后的黏附強(qiáng)度不同，使用胰蛋白酶消化3 min后，大量成纖維細(xì)胞從培養(yǎng)皿上脫落，可以初步將腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分開。這兩種細(xì)胞貼壁的速度也不同，設(shè)置不同的貼壁時間并反復(fù)貼壁，進(jìn)一步篩去成纖維細(xì)胞，最終觀察到形態(tài)明顯不同于成纖維細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞。當(dāng)單位面積內(nèi)腫瘤細(xì)胞較多時，形成腫瘤細(xì)胞克隆，與成纖維細(xì)胞具有明顯的界線，使用滅菌后的棉簽劃去周邊的成纖維細(xì)胞，得到骨肉瘤原代細(xì)胞。骨肉瘤原代細(xì)胞在體外培養(yǎng)時間較短，保留了患者腫瘤的生物學(xué)特性。相較于PDX模型的建立，腫瘤原代細(xì)胞的分離過程時間較短，可以快速用于化療方案的體外研究；亦可收集分離出的成纖維細(xì)胞，用于化療方案副作用的體外研究。將分離出的原代腫瘤細(xì)胞植入小鼠皮下和脛骨髓腔，建立CDX模型。結(jié)果顯示分離出的原代腫瘤細(xì)胞具有較高的致瘤性，成瘤率為100%，所致腫瘤呈現(xiàn)惡性腫瘤的特點(diǎn)。收集成瘤后的組織，通過HE染色可見腫瘤細(xì)胞存在多核、核分裂像，與患者腫瘤細(xì)胞相似，但細(xì)胞密度高于后者。

總之，本研究分離出骨肉瘤患者的原代腫瘤細(xì)胞，同時建立CDX模型和PDX模型，彌補(bǔ)了現(xiàn)有骨肉瘤臨床前模型的部分不足。所建立的3個不同層面臨床前模型可以反映患者腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，可為臨床制訂有效的個性化化療方案奠定基礎(chǔ)。本研究亦有明顯的不足之處：僅有1例病例；缺少必要的方法對照；尚未開展患者個性化化療方案的研究。