易玉玲， 宋 瑱， 雍江堰， 黃筱雪， 李 燕*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，四川 成都 611137；2.重慶兩江新區(qū)第一人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，重慶 401121)

白色念珠菌是一種二相性真菌，從形態(tài)上分為酵母相和菌絲相，在血清等菌絲形成誘導(dǎo)因素的作用下，白色念珠菌可發(fā)生由酵母相到菌絲相的菌態(tài)轉(zhuǎn)換。已有研究證實(shí)白色念珠菌的菌態(tài)轉(zhuǎn)換其實(shí)是白色念珠菌由定殖菌向致病菌轉(zhuǎn)變的一種標(biāo)志，與白色念珠菌致病性和生物膜形成密切相關(guān)[1-2]。研究表明菌絲的形成可以提高白色念珠菌對(duì)機(jī)體組織的侵襲力與黏附性，而沒(méi)有菌絲形成能力的白色念珠菌表現(xiàn)出毒性減低、致病力減弱等特點(diǎn)[3]。另一方面，菌絲的形成可以維持成熟生物膜結(jié)構(gòu)的完整性和多層體系，菌絲的缺乏可以導(dǎo)致生物膜形成能力減弱甚至不形成，而生物膜是造成白色念珠菌高感染性以及高耐藥性的主要因素[4]。因此，研究如何抑制酵母相和菌絲相的菌態(tài)轉(zhuǎn)換對(duì)治療白色念珠菌生物膜感染具有重要作用。本研究選擇了道地藥材黃連的主要活性成分鹽酸小檗堿作為干預(yù)藥物，探討其對(duì)白色念珠菌酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)換的抑制作用及其機(jī)制，為臨床抗白色念珠菌感染提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-10231，購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心，為氟康唑敏感菌株。

1.1.2 主要藥物及試劑 鹽酸小檗堿(成都普菲德生物技術(shù)有限公司)，RPMI1640培養(yǎng)基(GBICO)，hochest染色試劑(Solarbio)，Trizol Rengent(Invitrogen)，Trans Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix(北京全式金公司)，TransStart Green qPCR Super Mix(北京全式金公司)。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 恒溫37 ℃孵育箱(DH-500)購(gòu)自北京中興偉業(yè)儀器有限公司，超凈工作臺(tái)(SW-QJ-2FD)購(gòu)自Airtech公司，倒置熒光顯微鏡(DMI8-M)購(gòu)自德國(guó)徠卡公司，熒光定量PCR儀(qtower2.2)購(gòu)自德國(guó)耶拿分析儀器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 白色念珠菌菌絲形成的體外動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè) 挑取沙氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h的白色念珠菌置于無(wú)菌生理鹽水中，顯微鏡下用牛鮑氏計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，然后用RPMI1640液體培養(yǎng)基稀釋成1×106cfu/mL的菌液，將稀釋好的菌液按照3 mL/孔的量加入到含有無(wú)菌玻片的6孔板中，37 ℃條件下分別于2、4、6、8 h結(jié)束培養(yǎng)。將上述培養(yǎng)結(jié)束后的玻片取出，用PBS輕輕漂洗3次，置于新的6孔板中加入配制好的hochest工作液進(jìn)行染色。室溫放置5～10 min后，棄去染色液，用PBS洗滌2～3次，置于倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果[5]。

1.2.2 鹽酸小檗堿抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的MIC測(cè)定 參考2017版美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)[6]推薦的微量稀釋法并略作改良。將鹽酸小檗堿溶于DMSO中，配制成質(zhì)量濃度為256 μg/mL的原液，無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌備用，用RPMI1640對(duì)原液進(jìn)行倍比稀釋，質(zhì)量濃度為256～0.5 μg/mL，按照1.2.1所述菌液配制方法，配制成4×103cfu/mL的菌液。將配制的藥液和菌液分別按照每孔100 μL加至96孔板，使每孔菌液終濃度達(dá)到2×103cfu/mL，藥物終濃度為128～0.25 μg/mL，37 ℃培養(yǎng)24 h后用XTT試劑測(cè)定其細(xì)胞含量，酶標(biāo)儀測(cè)定A450，計(jì)算抑制率，以抑制80%白色念珠菌生長(zhǎng)為MIC值。另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照：只加菌液與RPMI1640培養(yǎng)基；陰性對(duì)照：只加RPMI1640培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 hochest染色法觀察鹽酸小檗堿作用下菌絲表觀形態(tài)的變化 實(shí)驗(yàn)分為5組，分別為對(duì)照組(不加藥)、氟康唑組、128 μg/mL鹽酸小檗堿組、32 μg/mL鹽酸小檗堿組、8 μg/mL鹽酸小檗堿組。按照1.2.1中配制方法配制白色念珠菌菌懸液，其濃度為2×106cfu/mL，將稀釋好的菌液按照每孔1.5 mL加入到含有無(wú)菌玻片的6孔板中，然后按照實(shí)驗(yàn)分組的要求向6孔板中加入1.5 mL相應(yīng)的藥液，37 ℃培養(yǎng)4、6 h后用hochest進(jìn)行染色，染色5～10 min后置于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)鹽酸小檗堿對(duì)白色念珠菌菌絲形成關(guān)鍵基因的影響 同上述操作方法配制菌液，向6孔板中加入白色念珠菌菌液(1.5 mL/孔)，按照1.2.3的實(shí)驗(yàn)分組要求加入相應(yīng)的藥液(1.5 mL/孔)，37 ℃培養(yǎng)24 h。根據(jù)Trizol法要求提取各組總RNA，并用微量核酸儀測(cè)定樣品RNA濃度。隨后按照全式金逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書要求將RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。參考文獻(xiàn)[7-9]設(shè)計(jì)并在上海生工生物工程公司合成內(nèi)參與目的基因引物(見表1)，并按照全式金熒光定量試劑盒說(shuō)明書用RT-PCR擴(kuò)增菌絲形成關(guān)鍵基因(EFG1、HWP1、ECE1和ALS1)，RT-PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，40次；于 60～95 ℃做溶解曲線分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，以act1為內(nèi)參基因，采用相對(duì)定量2-ΔΔct法對(duì)RT-PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表1 各基因特異性引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽酸小檗堿抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的MIC值

鹽酸小檗堿對(duì)浮游狀態(tài)下的白色念珠菌ATCC10231顯示出明顯的抗菌活性，其MIC值均為32 μg/mL。

2.2 白色念珠菌芽管/菌絲形成動(dòng)態(tài)過(guò)程

實(shí)驗(yàn)用hochest染色法對(duì)培養(yǎng)0～8 h的白色念珠菌進(jìn)行染色，從而觀察芽管/菌絲形成動(dòng)態(tài)過(guò)程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白色念珠菌在培養(yǎng)2 h左右形成大量芽生孢子；4 h左右開始形成較為明顯的芽管；隨后6 h進(jìn)一步延伸，此時(shí)形成的芽管較4 h長(zhǎng)，且出現(xiàn)少量的假菌絲；之后8 h大量假菌絲形成，并交織在一起，結(jié)果見圖1。

圖1 ATCC10231芽管/菌絲形成動(dòng)態(tài)過(guò)程Fig.1 The dynamic formation process of germ tubes/hyphal of ATCC10231

2.3 藥物干預(yù)下ATCC10231菌絲生長(zhǎng)情況

鹽酸小檗堿作用于 ATCC10231 4 h和6 h后，倒置熒光顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)情況表明，鹽酸小檗堿對(duì)ATCC10231的菌態(tài)轉(zhuǎn)換具有較強(qiáng)的抑制作用，但僅限于高濃度和中濃度鹽酸小檗堿，低濃度無(wú)明顯抑制作用；與氟康唑組相比較，高濃度鹽酸小檗堿抑制效果明顯優(yōu)于氟康唑，而中濃度與低濃度鹽酸小檗堿抑制作用不及氟康唑；同時(shí)與培養(yǎng)4 h的白色念珠菌相比，培養(yǎng)6 h的白色念珠菌菌絲鏡下情況與之類似，但其菌落數(shù)相對(duì)增加，菌絲相對(duì)更成熟。其中，128 μg/mL鹽酸小檗堿組和4 μg/mL氟康唑組以酵母相細(xì)胞為主，且數(shù)量較對(duì)照組明顯減少；32 μg/mL鹽酸小檗堿組以酵母相細(xì)胞和菌絲相共同存在，菌絲相對(duì)較短，且數(shù)量顯著減少；8 μg/mL鹽酸小檗堿組均以菌絲相細(xì)胞為主，數(shù)量變化不明顯，結(jié)果見圖2。

圖2 各藥物干預(yù)下白色念珠菌菌絲態(tài)微觀形態(tài)Fig.2 The micromorphology of Candida albicans hypahal under drug intervention A為4 h干預(yù)：A1：對(duì)照組，A2：4 μg/mL氟康唑組，A3：128 μg/mL鹽酸小檗堿組，A4：32 μg/mL鹽酸小檗堿組，A5：8 μg/mL鹽酸小檗堿組；B為6 h干預(yù)：B1：對(duì)照組，B2：4 μg/mL氟康唑組，B3：128 μg/m鹽酸小檗堿組，B4：32 μg/mL鹽酸小檗堿組，B5：8 μg/mL鹽酸小檗堿組A：the stage of 4 h, A1: the control group, A2: the fluconazole under 4 μg/mL, A3: the berberberine hydrochloride under 128 μg/mL, A4: the berberberine hydrochloride under 32 μg/mL, A5: the berberberine hydrochloride under 8 μg/mL;B: the stage of 6 h, B1: the control group, B2: the fluconazole under 4 μg/mL, B3: the berberberine hydrochloride under 128 μg/mL, B4: the berberberine hydrochloride under 32 μg/mL, B5: the berberberine hydrochloride under 8 μg/mL

2.4 藥物干預(yù)后菌絲形成關(guān)鍵基因相對(duì)表達(dá)情況

RT-PCR結(jié)果表明，鹽酸小檗堿對(duì)ATCC10231菌絲形成關(guān)鍵基因EFG1、HWP1、ECE1、ALS1的表達(dá)具有一定抑制作用。在ATCC10231的4 h階段干預(yù)組中，128 μg/mL鹽酸小檗堿組與氟康唑組HWP1和ECE1表達(dá)降低，32 μg/mL鹽酸小檗堿組EFG1和ALS1的表達(dá)降低，而低濃度鹽酸小檗堿無(wú)明顯抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與氟康唑組相比，128 μg/mL鹽酸小檗堿組HWP1表達(dá)相對(duì)降低，ECE1表達(dá)相對(duì)增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在ATCC10231的6 h階段干預(yù)組中，與對(duì)照組比較，氟康唑組EFG1、HWP1、ECE1和ALS1表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時(shí)128 μg/mL鹽酸小檗堿組HWP1、ECE1和ALS1表達(dá)降低，32 μg/mL鹽酸小檗堿組EFG1、HWP1和ALS1表達(dá)降低，而8 μg/mL鹽酸小檗堿組對(duì)菌絲形成相關(guān)基因的表達(dá)無(wú)明顯抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與氟康唑組比較，僅有128 μg/mL鹽酸小檗堿組ALS1的表達(dá)降低，但差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他組基因表達(dá)均相對(duì)增加。與4 h階段干預(yù)組各基因表達(dá)量相比較，6 h階段干預(yù)組中128 μg/mL鹽酸小檗堿組ECE1和ALS1的表達(dá)以及32 μg/mL鹽酸小檗堿組EFG1和ALS1的表達(dá)均相對(duì)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，128 μg/mL鹽酸小檗堿組HWP1的表達(dá)相對(duì)增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。具體結(jié)果見圖3和表2。

圖3 藥物干預(yù)后白色念珠菌菌絲形成關(guān)鍵基因相對(duì)表達(dá)情況Fig.3 The relative expression level of key genes of hyhal formation A為4 h干預(yù)：A1：對(duì)照組，A2：氟康唑組，A3：128 μg/mL鹽酸小檗堿組，A4：32 μg/mL鹽酸小檗堿組，A5：8 μg/mL鹽酸小檗堿組；B為6 h干預(yù)：B1：對(duì)照組，B2：氟康唑組，B3：128 μg/mL鹽酸小檗堿組，B4：32 μg/mL鹽酸小檗堿組，B5：8 μg/mL鹽酸小檗堿組;結(jié)果均以各自對(duì)照組表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)“1”進(jìn)行相對(duì)比較，*表示與各自對(duì)照組相比，P<0.05A:the stage of 4 h, A1： the control group, A2： the fluconazole under 4 μg/mL, A3： the berberberine hydrochloride under 128 μg/mL, A4： the berberberine hydrochloride under 32 μg/mL, A5： the berberberine hydrochloride under 8 μg/mL；B： the stage of 6 h, B1： the control group, B2： the fluconazole under 4 μg/mL, B3： the berberberine hydrochloride under 128 μg/mL, B4： the berberberine hydrochloride under 32 μg/mL, B5： the berberberine hydrochloride under 8 μg/mL；Getting the results by comparing with the expression level of control group ,and * indicats that compared with the control group, the difference is significant (P<0.05)

3 討 論

白色念珠菌是一種條件致病菌，是醫(yī)院獲得性感染與社區(qū)感染主要病原菌之一。近年來(lái)隨著抗生素濫用、免疫力低下以及生物材料的廣泛應(yīng)用，白色念珠菌已成為臨床重要的病原微生物，其中生物膜的形成是該菌感染率和耐藥性不斷增強(qiáng)的重要因素，而酵母相與菌絲相的菌態(tài)轉(zhuǎn)換對(duì)生物膜形成至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)菌絲相細(xì)胞是白色念珠菌的主要致病形式，可以增強(qiáng)白色念珠菌對(duì)宿主上皮細(xì)胞的黏附及侵襲力，有利于躲避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊[10]。白色念珠菌的菌態(tài)轉(zhuǎn)換主要受EFG1調(diào)節(jié)的cAMP信號(hào)途徑的調(diào)控，外界環(huán)境因素作用于轉(zhuǎn)錄因子EFG1而發(fā)揮作用，進(jìn)而通過(guò)調(diào)節(jié)菌絲形成特異性基因的表達(dá)影響菌絲的生長(zhǎng)[11-12]。常見的菌絲特異性基因包括細(xì)胞伸長(zhǎng)相關(guān)蛋白ECE1、菌絲細(xì)胞壁蛋白(hyphal wall protein, HWP) 1等，ECE1和HWP1作為菌絲形成特異性基因，在酵母狀態(tài)下不表達(dá)，在菌絲狀態(tài)下大量表達(dá)，其表達(dá)受到EFG1轉(zhuǎn)錄因子的正向調(diào)控。此外，EFG1還可以正向調(diào)控細(xì)胞黏附相關(guān)基因ALS1的表達(dá)，ALS1為凝集素樣序列基因家族即ALS基因家族所編碼，在生物膜形成過(guò)程中ALS1高度表達(dá)，ALS1基因缺失可致生物膜形成障礙。

鹽酸小檗堿作為臨床常用中藥黃連的主要活性成分之一，具有較強(qiáng)的抗菌作用，已有證據(jù)表明鹽酸小檗堿在抗白色念珠菌感染方面具有良好的效果。王彩瑞[13]研究了丹皮酚、丁香酚、土槿乙酸以及鹽酸小檗堿4種中藥對(duì)白色念珠菌抑制作用，發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿對(duì)白色念珠菌具有明顯的抑制作用，且抑制效果最強(qiáng)，表明鹽酸小檗堿在抗白色念珠菌感染方面具有良好應(yīng)用前景。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿對(duì)白色念珠菌的抑制作用除了單用具有良好的抗菌效果，與黃芩苷、冰片聯(lián)用也顯現(xiàn)出明顯的協(xié)同抗菌作用[14]。目前鹽酸小檗堿抗白色念珠菌感染的研究主要局限于對(duì)浮游菌抑制作用的研究，對(duì)白色念珠菌酵母相向菌絲相菌態(tài)轉(zhuǎn)換的研究少見報(bào)道，其作用機(jī)制也不甚明確。因此，我們觀察了鹽酸小檗堿對(duì)白色念珠菌菌態(tài)轉(zhuǎn)換表觀和關(guān)鍵基因表達(dá)的影響，以探討其抑制作用及其分子調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究hochest染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)128 μg/mL和32 μg/mL鹽酸小檗堿均能通過(guò)抑制白色念珠菌菌絲的形成以及導(dǎo)致其數(shù)量減少，從而抑制白色念珠菌發(fā)生菌態(tài)轉(zhuǎn)換，并且128 μg/mL鹽酸小檗堿抑制作用明顯優(yōu)于32 μg/mL鹽酸小檗堿和4 μg/mL氟康唑，而8 μg/mL鹽酸小檗堿抑制作用不明顯，說(shuō)明鹽酸小檗堿對(duì)白色念珠菌菌態(tài)轉(zhuǎn)換有一定的抑制作用，可以抑制其生長(zhǎng)以及菌絲形成，但抑制作用具有一定的劑量依賴性。

表2 藥物干預(yù)后菌絲形成關(guān)鍵基因表達(dá)水平

注：P1表示與各自對(duì)照組比較，*表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；P2表示與各自氟康唑組比較；#表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

為了進(jìn)一步明確鹽酸小檗堿對(duì)白色念珠菌發(fā)生菌態(tài)轉(zhuǎn)換的抑制作用機(jī)制，分析了菌絲形成關(guān)鍵基因的表達(dá)情況。RT-PCR結(jié)果表明鹽酸小檗堿對(duì)ATCC10231菌態(tài)轉(zhuǎn)換過(guò)程中EFG1、HWP1、ECE1和ALS1的表達(dá)具有一定的抑制作用，但僅見于較高濃度的鹽酸小檗堿，低濃度鹽酸小檗堿無(wú)明顯抑制作用，并且RT-PCR結(jié)果還表明鹽酸小檗堿對(duì)6 h的菌絲形成關(guān)鍵基因的抑制作用優(yōu)于4 h，表明鹽酸小檗堿的抑制作用存在一定的劑量依賴性和時(shí)間依賴性。由此可見，鹽酸小檗堿對(duì)白色念珠菌的菌態(tài)轉(zhuǎn)換具有明顯抑制作用，其抑制作用的分子調(diào)節(jié)機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)菌絲形成關(guān)鍵基因(EFG1、HWP1、ECE1、ALS1)的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)本課題組還發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿可以抑制生物膜形成——生物膜三維結(jié)構(gòu)破環(huán)、菌絲形成受抑，其分子機(jī)制也與EFG1、HWP1、ECE1和ALS1的表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)，因此進(jìn)一步證實(shí)了菌絲形成是生物膜形成的關(guān)鍵一步，利用鹽酸小檗堿下調(diào)菌絲形成關(guān)鍵基因的表達(dá)，影響生物膜形成關(guān)鍵物質(zhì)——菌絲的形成，可以達(dá)到抑制生物膜形成的目的。

目前，臨床上針對(duì)生物膜感染提出抗生素鎖定(ALT)技術(shù)進(jìn)行治療，采用高濃度的抗生素作用于細(xì)菌生物膜，達(dá)到有效清除生物膜的目的[15]。而本研究結(jié)果表明鹽酸小檗堿可以抑制白色念珠菌的菌態(tài)轉(zhuǎn)換，但僅限于較高濃度的鹽酸小檗堿，同時(shí)鑒于白色念珠菌菌態(tài)轉(zhuǎn)換在生物膜形成中的重要作用，提示臨床可參考ALT技術(shù)加大局部藥物使用劑量，并延長(zhǎng)藥物干預(yù)時(shí)間，影響白色念珠菌菌態(tài)的轉(zhuǎn)換，從而控制白色念珠菌感染。