葉曉婉，朱潤(rùn)琪，倪新程 ，張桂麗，聶雅閣，戚賀飛 ，谷萌萌，劉珍珍 ，朱大恒*

(1.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 河南 鄭州 450000； 2.華中科技大學(xué) 同濟(jì)醫(yī)學(xué)院, 湖北 武漢 430000)

植物內(nèi)生菌是指生活在健康植物的某個(gè)器官或組織內(nèi)部的微生物，它們?cè)谄渌拗髦参锷钍返哪硞€(gè)或整個(gè)生長(zhǎng)階段中參與共同進(jìn)化過(guò)程[1-5]，這些微生物與宿主植物形成了一種相對(duì)穩(wěn)定的互利共生關(guān)系。植物內(nèi)生菌不僅可以參與藥用植物自身化學(xué)藥物的合成，也可對(duì)宿主本身的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行修飾轉(zhuǎn)化，而且還可通過(guò)獨(dú)立培養(yǎng)，產(chǎn)生豐富多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物。但就應(yīng)用微生物的種類(lèi)而言，還存在大量的可利用菌種有待開(kāi)發(fā)利用，應(yīng)豐富植物內(nèi)生菌資源的研究。明黨參以根入藥，具有潤(rùn)肺化痰、養(yǎng)陰和胃、平肝、解毒之效，并用于治療肺熱咳嗽，嘔吐反胃、食少口干、目赤眩暈、疔毒瘡瘍及具滋補(bǔ)強(qiáng)壯功效[6-8]。新近研究表明，明黨參可以降低血清膽固醇及甘油三酯，有控制血小板聚集和抗凝血作用。近年來(lái)，由于人為過(guò)度采挖及對(duì)生境的破壞，明黨參的分布區(qū)和個(gè)體數(shù)量日益減少，其種群呈現(xiàn)明顯衰退傾向[9-10]。此外，明黨參自身的生物學(xué)特性如種子產(chǎn)量少、幼苗成活率低、種群自身恢復(fù)能力差等原因，也是明黨參種群難以擴(kuò)大而導(dǎo)致瀕危的重要原因之一[10-13]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于明黨參的研究大多集中于生物學(xué)特性、遺傳多樣性、系統(tǒng)進(jìn)化、藥理藥效分析以及外部環(huán)境(氣候因子、光照、土壤、水分)等方面[5,14-15]，而忽視了明黨參植物體內(nèi)環(huán)境的作用，尤其是明黨參內(nèi)生菌種群結(jié)構(gòu)與功能的研究少見(jiàn)報(bào)道。明黨參內(nèi)生菌在長(zhǎng)時(shí)間的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，為了能夠在短時(shí)間內(nèi)適應(yīng)宿主體內(nèi)微環(huán)境，可以使自身的基因信息與宿主基因信息進(jìn)行交流轉(zhuǎn)移，從而使得某些內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生抗生素類(lèi)物質(zhì)，特別是某些內(nèi)生菌具有拮抗致病菌的作用[15-16]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)在自然界中無(wú)處不在，常常引起人類(lèi)感染， 是人類(lèi)化膿感染中最常見(jiàn)的革蘭陽(yáng)性病原菌[17-18]。金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生腸毒素，對(duì)腸道破壞性大，引起急性胃腸炎；能產(chǎn)生溶血毒素，會(huì)損傷血小板破壞溶酶體；能殺死白細(xì)胞素，破壞人的白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，引起免疫系統(tǒng)紊亂[17-19]。很多疾病多因使用抗生素引起腸道菌群失調(diào)，抗生素敏感菌株受到抑制，耐藥的金黃色葡萄球菌株趁機(jī)繁殖，對(duì)人體造成損傷。本研究對(duì)鄭州市栽培明黨參內(nèi)生菌進(jìn)行了分離和拮抗菌株篩選，旨在為抗菌藥源成分的開(kāi)發(fā)提供新的來(lái)源和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)用明黨參(ChangiumsmyrnioidesWolff)采自鄭州某中草藥種植田，供試病原菌菌株金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為鄭州大學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(本實(shí)驗(yàn)室)保藏菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA))、放線菌培養(yǎng)基(改良高氏一號(hào))：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 HZQ-X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱(太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；AvantiJ-25低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman coulter公司)；BS223S電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；Eclipse E200生物顯微鏡(尼康儀器(上海)有限公司)；OLYMPUS BX53正置熒光顯微鏡(OLYMPUS)；UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；SYQ-DSX-280B手提式高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)；VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)(bioMérieux生物梅里埃公司)；Autof ms 1000全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)(安圖實(shí)驗(yàn)儀器(鄭州)有限公司)； 牛津杯(內(nèi)徑( 6.0±0.1 ) mm，外徑( 7.8±0.1 ) mm，高( 10.0±0.1 ) mm，青島海博生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 明黨參內(nèi)生菌的分離 取明黨參的組織部位(根、莖、葉)，用自來(lái)水沖洗表面泥土和其他雜質(zhì)，并在干凈的自來(lái)水中浸泡1 h。移入無(wú)菌超凈工作臺(tái)，用無(wú)菌水再次沖洗3遍，用無(wú)菌濾紙吸干表面的水分。進(jìn)行“75%乙醇-2.5%次氯酸鈉-75%乙醇”的三步表面消毒法(根組織：75%乙醇浸泡3 min，2.5%次氯酸鈉7 min，75%乙醇浸泡20 min；莖組織：75%乙醇浸泡3 min，2.5%次氯酸鈉5 min，75%乙醇浸泡18 min；葉組織：75%乙醇浸泡2 min，2.5%次氯酸鈉3 min，75%乙醇浸泡15 min)，表面消毒過(guò)后的植物組織，分別用無(wú)菌水沖洗6次，再用無(wú)菌濾紙吸干組織表面的水分。用滅菌后的鑷子、剪刀、無(wú)菌刀片分別將明黨參的根與葉組織剪切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，明黨參的莖剪切成長(zhǎng)度約為0.5 cm的組織塊。在NA、PDA、高氏一號(hào)培養(yǎng)基的平板上，分別等距接種4個(gè)根、莖、葉組織塊，每個(gè)處理重復(fù)3次。將平板依次放置到37、28、30 ℃培養(yǎng)箱中，觀察平板中組織邊緣菌落生長(zhǎng)狀況。

表面消毒效果的檢驗(yàn)：對(duì)照組實(shí)驗(yàn)采用組織印跡法，將經(jīng)過(guò)以上消毒處理的根、莖、葉組織放入NA、PDA、高氏一號(hào)培養(yǎng)基內(nèi)，使滅菌材料表面與培養(yǎng)基接觸20 min左右，再移開(kāi)明黨參組織塊，將其置于相同條件下培養(yǎng)相同時(shí)間，檢驗(yàn)平板是否有菌落長(zhǎng)出?？瞻讓?duì)照實(shí)驗(yàn)采用植物最后一次表面消毒的無(wú)菌水清洗液作為陰性對(duì)照，取90 μL涂布于空白分離培養(yǎng)基上，同實(shí)驗(yàn)組相同條件下培養(yǎng)相同的天數(shù)，若沒(méi)有菌落長(zhǎng)出，說(shuō)明植物表面消毒徹底，則實(shí)驗(yàn)組分離出來(lái)的菌株為內(nèi)生菌。

1.2.2 明黨參內(nèi)生細(xì)菌的純化與保存 待平板中組織塊邊緣長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的菌落后，用接種環(huán)挑取少許邊緣菌落接種到新的NA培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)，待菌落生長(zhǎng)后重復(fù)此操作6次以上，直到經(jīng)多次純化后，得到單一純菌落。定期觀察，選取優(yōu)勢(shì)單菌落劃線純化并斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 明黨參內(nèi)生細(xì)菌拮抗金黃色葡萄球菌的初篩 采用混菌法進(jìn)行拮抗致病菌的初篩：在超凈工作臺(tái)中，將NB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌菌液1.5 mL加入到45 ℃、150 mL的NA培養(yǎng)基中，充分混勻后，取20 mL加入無(wú)菌90 mm培養(yǎng)皿中，制成含致病菌平板。距平板中央1.5 cm 處接種6 mm的內(nèi)生菌菌碟(用打孔器打取培養(yǎng)24 h的明黨參內(nèi)生菌邊緣的單菌落菌塊)，37 ℃恒溫培養(yǎng)，定期觀察抑菌狀況。

1.2.4 明黨參內(nèi)生細(xì)菌拮抗金黃色葡萄球菌的復(fù)篩 將初篩有效果的內(nèi)生菌菌株接種到NB液體培養(yǎng)基中37 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h后，制成種子液。然后在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌操作，取5 mL的種子液置于95 mL的NB發(fā)酵液中37 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，經(jīng)0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾獲取上清液，上清液抑菌活性檢測(cè)采用文獻(xiàn)[20-21]的牛津杯雙層平板擴(kuò)散法進(jìn)行，略有改動(dòng)：在超凈工作臺(tái)中，90 mm無(wú)菌培養(yǎng)皿中加10 mL 1.2%的水瓊脂，凝固后距平板中心1.5 cm 處分別放置2個(gè)牛津杯，再取NB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌菌液1.5 mL(OD600值為2.481)接種至45 ℃、150 mL的NA培養(yǎng)基中混合均勻后，迅速取20 mL加入至培養(yǎng)皿中，凝固后取出牛津杯，以NB培養(yǎng)基為對(duì)照，在牛津杯2個(gè)小孔中分別加入100 μL無(wú)菌生理鹽水(0.85%，CK)和100 μL發(fā)酵液上清液，于4 ℃冰箱中靜置6 h，37 ℃培養(yǎng)6～12 h后，測(cè)量抑菌圈直徑(diameter of inhibition zone，DIZ)，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，結(jié)果取平均值。

1.2.5 明黨參內(nèi)生拮抗菌的鑒定 ①形態(tài)學(xué)鑒定：將明黨參內(nèi)生細(xì)菌菌株接種到NA平板上，37 ℃條件下培養(yǎng)1 d，觀察其菌落形態(tài)并記錄；挑取菌落邊緣少量菌體用草酸銨結(jié)晶紫染液進(jìn)行單染色，顯微鏡觀察。②Autof ms 1000全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測(cè)：拮抗病原菌的內(nèi)生細(xì)菌接種到NA平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h后，分別取單菌落于1.5 mL 離心管(含300 μL去離子水)中，振蕩混勻；再加入900 μL無(wú)水乙醇，充分混勻；室溫12 000 r/min離心4 min，倒去上清，再次離心，除去上清；40 ℃恒溫干燥沉淀2 min；加入10 μL裂解液1(70%甲酸)，振蕩混勻，加入同體積的裂解液2(100%乙腈)，充分混勻；室溫12 000 r/min離心4 min；吸取1 μL上清液，滴加到樣品靶板上，另任意選一靶點(diǎn)滴加1 μL質(zhì)譜儀校準(zhǔn)品，并在室溫下晾干；晾干后，取1 μL基質(zhì)溶液覆蓋在上述樣品點(diǎn)上，并在室溫下晾干，將樣品靶板放入質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定。③16S rDNA基因序列同源性分析：明黨參內(nèi)生菌的16S rDNA序列由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。內(nèi)生菌的基因組DNA提取按照Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒操作，PCR擴(kuò)增按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程，進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，在150 V、100 mA、20 min下觀察電泳圖，純化DNA目的條帶，用PCR 引物直接測(cè)序PCR產(chǎn)物。登陸NCBI網(wǎng)頁(yè)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，選取同源性較高的10組16S rDNA序列進(jìn)行DNA多序列比對(duì)，利用MEGA 6.06軟件采用鄰接法(NJ, Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，通過(guò)自展法(Bootstrap Method)1 000次檢驗(yàn)進(jìn)行置信度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 明黨參內(nèi)生菌的分離與篩選

從新鮮的明黨參植株中，經(jīng)空白對(duì)照試驗(yàn)和對(duì)照組驗(yàn)證、分離、純化，確認(rèn)獲得49株內(nèi)生細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在不同組織中明黨參植株獲得的菌株數(shù)量存在一定的差異，菌株數(shù)量根中最多，莖中最少。根據(jù)平板中菌落初步特征(菌落大小、菌落顏色、菌落透明度、菌落邊緣情況、是否凸起)，初步分為29株。

2.2 內(nèi)生細(xì)菌拮抗金黃色葡萄球菌的初篩

利用混菌法對(duì)分離得到的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行拮抗金黃色葡萄球菌抑菌活性的篩選，結(jié)果顯示有4株內(nèi)生細(xì)菌的菌碟周?chē)尸F(xiàn)出抑菌圈，對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出明顯的抑菌性，分別為NMY1、NMJ10、NMG10、PMG3。通過(guò)初步觀察抑菌圈，可以發(fā)現(xiàn)菌株NMJ10、PMG3都具有較強(qiáng)的抑菌性，菌株NMG10不僅具有抑菌圈，還可以在致病菌的平板生長(zhǎng)良好。

2.3 內(nèi)生細(xì)菌拮抗金黃色葡萄球菌的復(fù)篩

采用牛津杯雙層平板擴(kuò)散法，以金黃色葡萄球菌為指示菌株進(jìn)行初篩有效果的內(nèi)生菌菌株的復(fù)篩，菌液經(jīng)離心過(guò)濾后的上清液在含致病菌的NA培養(yǎng)基中的抑菌效果見(jiàn)圖1。由圖1可知，明黨參內(nèi)生細(xì)菌29株中有至少4株菌對(duì)金黃色葡萄球菌有很好的抑制作用,其代謝產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌有抑菌活性。試驗(yàn)通過(guò)控制致病菌的菌濃度，測(cè)定出抑菌圈直徑(DIZ),見(jiàn)表1，其中菌株NMJ10的DIZ值為20.30 mm，表明其代謝產(chǎn)物具有相對(duì)較強(qiáng)的抑菌作用。

圖1 內(nèi)生菌株對(duì)金黃色葡萄球菌的拮抗結(jié)果Fig.1 Antagonistic effect of endophytes on Staphylococcus aureus

A:菌株NMJ10代謝產(chǎn)物的抑菌效果;B:菌株P(guān)MG3代謝產(chǎn)物的抑菌效果;C:菌株NMY1代謝產(chǎn)物的抑菌效果; D:菌株NMG10代謝產(chǎn)物的抑菌效果

A： Antibacterial effect of metabolites of strain NMJ10;B：Antibacterial effect of metabolites of strain PMG3;C：Antibacterial effect of metabolites of strain NMY1;D：Antibacterial effect of metabolites of strain NMG10

表1 內(nèi)生菌株對(duì)金黃色葡萄球菌的拮抗效果

2.4 復(fù)篩菌株的培養(yǎng)及形態(tài)特征

把菌株NMY1、NMJ10、NMG10、PMG3接種到NA平板上培養(yǎng)24 h，其平板中菌落形態(tài)如圖2。菌株NMJ10在NA平板上生長(zhǎng)時(shí)菌落為圓形、邊緣不規(guī)則、表面有褶皺、呈現(xiàn)白色、菌落粗糙、不透明、大小為2～3 mm(圖2A)，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，NMJ10菌體為桿狀、兩端鈍圓、芽胞柱狀、孢囊膨大。菌株P(guān)MG3在NA平板上生長(zhǎng)時(shí)菌落為不規(guī)則圓、有凸起、呈現(xiàn)白色、菌落濕潤(rùn)、半透明、大小為5～6 mm(圖2B)，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，PMG3菌體為長(zhǎng)桿狀、芽胞柱狀、兩端鈍圓、長(zhǎng)度較長(zhǎng)。菌株NMG10在NA平板上生長(zhǎng)時(shí)菌落為米白色、不規(guī)則、四周呈現(xiàn)扁平根毛狀，菌落體積較大(圖2C)，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，NMG10菌體為芽胞橢圓柱狀、偏中生。菌株NMY1在NA平板上生長(zhǎng)時(shí)菌落為不規(guī)則圓，有褶皺，呈現(xiàn)白色，菌落較大、周?chē)胪该鳎こ?圖2D)，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，PMG3菌體為桿狀、芽胞柱狀、兩端鈍圓。

圖2 4株菌的菌落特征Fig.2 Colonial characteristics of four strains

A、B、C、D分別為NA平板上菌株NMJ10、PMG3、NMG10、NMY1菌落形態(tài)

A, B, C, and D are strains NMJ10, PMG3, NMG10, and NMY1 colony morphology on NA plates, respectively

2.5 拮抗菌株的Autof ms 1000全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測(cè)

Autof ms1000 基本原理是基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS)技術(shù)。通過(guò)離子的質(zhì)荷比與離子的飛行時(shí)間成正比，檢測(cè)樣品到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間即可檢測(cè)離子，對(duì)樣品進(jìn)行分析，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)信息比對(duì)，篩選并確定相應(yīng)圖譜，進(jìn)而得到鑒定結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同細(xì)菌屬、種的鑒定。菌株NMJ10、PMG3、NMG10、NMY1的質(zhì)譜圖譜，如圖3所示。由圖3可知，菌株NMJ10在5 798.545 m/z附近離子流強(qiáng)度最大，其峰高為2 209，峰面積為5 651 106，信噪比為45，分辨率為745；菌株P(guān)MG3在4 307.89 m/z附近離子流強(qiáng)度最大，其峰高為1 600，峰面積為2 789 635，信噪比為28，分辨率為753；菌株NMG10在4 340.531 m/z附近離子流強(qiáng)度最大，其峰高為4 655，峰面積為7 916 964，信噪比為94，分辨率為588；菌株NMY1在2 785.65 m/z附近離子流強(qiáng)度最大，其峰高為5 321，峰面積為6 130 754，信噪比為113，分辨率為474。

菌株NMJ10經(jīng)檢索后與數(shù)據(jù)庫(kù)中枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)的匹配分值為8.712，菌株NMG10經(jīng)檢索后與數(shù)據(jù)庫(kù)中蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)的匹配分值為8.426，菌株P(guān)MG3經(jīng)檢索后與數(shù)據(jù)庫(kù)中枯草芽胞桿菌的匹配分值為9.115，菌株NMY1經(jīng)檢索后與數(shù)據(jù)庫(kù)中枯草芽胞桿菌的匹配分值為9.179；Autofms1000鑒定結(jié)果得分在[6.0,9.0)中為屬水平參考，在[9.0,9.5)中為屬水平可信種水平參考，因此通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)可將菌株NMJ10、NMG10、PMG3、NMY1鑒定為芽胞桿菌屬。

2.6 內(nèi)生拮抗菌株16S rDNA基因序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳、純化回收DNA目的條帶、PCR引物測(cè)序，菌株NMJ10的16S rDNA基因序列全長(zhǎng)為1 423 bp，菌株P(guān)MG3的16S rDNA基因序列全長(zhǎng)為1 418 bp，菌株NMG10的16S rDNA基因序列全長(zhǎng)為1 417 bp，菌株NMY1的16S rDNA基因序列全長(zhǎng)為1 431 bp，通過(guò)BLAST同源性比對(duì)，結(jié)果表明，菌株與芽胞桿菌菌株具有高度同源性。選取與內(nèi)生菌拮抗菌株同源性較高的10株菌株的16S rDNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，菌株NMJ10與枯草芽胞桿菌(B.subtilis)、嗜熱脂肪芽胞桿菌(B.stearothermophilus)、解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)不處于一個(gè)分支，與Bacillussp. KT107處于一個(gè)分支，進(jìn)化距離較近；菌株NMY1與枯草芽胞桿菌(B.subtilis)進(jìn)化距離較近；菌株P(guān)MG3與Bacteriumwsb-1和Bacillustequilensisstrain Y11進(jìn)化距離較近；菌株NMG10與多株假蕈狀芽胞桿菌(B.pseudomycoides)處于一個(gè)分支，進(jìn)化距離較近。結(jié)合菌株形態(tài)特征、生化特性、Autof ms 1000鑒定結(jié)果，初步鑒定菌株NMJ10為芽胞桿菌屬菌株(Bacillusspp.NMJ10)，菌株NMY1為枯草芽胞桿菌(B.subtilis)，菌株P(guān)MG3為芽胞桿菌屬菌株(Bacillusspp. PMG3)，菌株NMG10為假蕈狀芽胞桿菌(B.pseudomycoides)。

圖3 菌株的Autof ms 1000全自動(dòng)微生物質(zhì)譜圖

圖4 菌株基于16S rDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of the strains

3 討 論

采用三步消毒法和平板培養(yǎng)法從鄭州市栽培明黨參健康植株的根、莖、葉中成功分離出內(nèi)生細(xì)菌，反復(fù)實(shí)驗(yàn)操作確認(rèn)消毒效果，空白對(duì)照均未發(fā)現(xiàn)有任何菌株生長(zhǎng)，終確保分離得到的29株菌株為內(nèi)生細(xì)菌。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)特征、形態(tài)學(xué)鑒定、生化特性、16S rDNA基因序列分析、遺傳圖譜分析和全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測(cè)等手段，發(fā)現(xiàn)多為芽胞桿菌屬，說(shuō)明芽胞桿菌屬優(yōu)勢(shì)菌株。從明黨參分離篩選的內(nèi)生細(xì)菌中，通過(guò)菌株初篩和發(fā)酵液復(fù)篩，有4株菌對(duì)金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抑菌活性，其中菌株NMY1為枯草芽胞桿菌(B.subtilis)，其作為重要的生防菌，有著極其廣泛的應(yīng)用價(jià)值；菌株NMG10為假蕈狀芽胞桿菌(B.pseudomycoides)，其代謝產(chǎn)物可作為生物表面活性劑，近幾年也有關(guān)于假蕈狀芽胞桿菌產(chǎn)纖溶酶的報(bào)導(dǎo)，它可作為一種新的微生物資源加以利用；另外菌株NMJ10(Bacillusspp. NMJ10)和菌株P(guān)MG3(Bacillusspp. PMG3)為芽胞桿菌屬菌株，菌株NMJ10對(duì)金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抗菌作用，有關(guān)該菌株對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)理、有效成分鑒定及其代謝特性等有待進(jìn)一步研究，同時(shí)明黨參內(nèi)生菌菌株種類(lèi)豐富，有很多有待開(kāi)發(fā)利用的微生物資源。