鄒 龍， 金熠樵， 吳 賢， 黃運紅， 龍中兒

(江西師范大學 生命科學學院，江西 南昌 330022)

能源短缺、環(huán)境污染和氣候變化等問題已成為當今實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展所面臨的重要挑戰(zhàn)。國際能源署(International Energy Agency)發(fā)布的《World Energy Outlook 2015》指出，2013年全球能源需求總量是18 TW，其中化石能源(煤炭、石油、天然氣)約占80%；隨著世界人口增長和工業(yè)化程度提升，全球能源需求預計在2040年增長至24～26 TW，屆時二氧化碳(CO2)排放量將從2013年的32 Gt增長至37～44 Gt。因此，發(fā)展綠色可再生新能源替代傳統(tǒng)化石燃料受到全球格外關注。近年來，由于諸多的微生物被發(fā)現(xiàn)具有與外界環(huán)境交換電子的能力(即胞外電子傳遞過程)及相關機制研究的不斷深入，微生物電化學系統(tǒng)作為一種新型綠色能源轉換體系備受科技界青睞[1-2]，可為能源短缺和環(huán)境退化問題提供新的解決思路和技術平臺。

微生物電化學系統(tǒng)以電活性微生物作為催化劑，依賴于微生物與胞外固相電極間的電子交換，主要包括用于氧化降解有機廢物并同時產(chǎn)生電能的微生物燃料電池(Microbial fuel cells，MFCs)[3-5]、用于生物制氫的微生物電解池(Microbial electrolysis cells，MECs)[6]和用于同化CO2生產(chǎn)有機化合物的微生物電合成(Microbial electrosynthesis，MES)[7-9]等。其中，作為新型電驅動微生物合成技術，MES中的微生物能夠以電極為電子供體驅動胞內(nèi)代謝，將CO2還原為乙酸、乙醇等有機化學制品?？梢?，MES既是可再生儲能技術(將電能轉化為化學能)，又是CO2同化固定平臺，具有十分重要的能源效益和生態(tài)意義。盡管MES的研究近年來取得了較為快速的發(fā)展，但是離實際應用還有以下兩個關鍵的瓶頸需要突破：①微生物與電極間的胞外電子傳遞(Extracellular electron transfer，EET)速率較低，尚難以達到工業(yè)化要求；②產(chǎn)生的有機化合物主要以C2-化合物為主，品位較低，商業(yè)價值不高。依賴于現(xiàn)代分子生物學和現(xiàn)代工程技術的生物工程可提供解決上述兩個主要問題的方案，比如優(yōu)化微生物胞外電子傳遞鏈和構建高品位化合物的合成代謝途徑。本文將在闡明MES陰極微生物吸收胞外電子機制的基礎上，系統(tǒng)綜述近5年生物工程在促進微生物電合成轉化CO2的策略和研究進展，并就今后研究方向進行探討。

1 微生物電合成

MES由Nevin等[10]于2010年首次提出，將其定義為微生物(作為生物催化劑)利用電能將CO2還原為多碳有機化合物的過程。不過，有學者認為利用胞外電極實現(xiàn)有機底物的轉化或碳鏈延伸的微生物電化學催化過程也屬于MES的范疇[7]。常見的MES系統(tǒng)(圖1)由陽極室和陰極室組成，兩室被離子交換膜分隔，陽極發(fā)生微生物氧化還原態(tài)無機/有機底物或簡單電化學水解產(chǎn)生電子的反應，陰極室中的親電微生物吸收陰極電子還原CO2或其他氧化態(tài)有機物，從而實現(xiàn)物質和能量的轉化過程。可見，除了直接以溫室氣體CO2作為碳源這一獨特優(yōu)點外，MES所需的能量來源十分豐富，既可以是太陽能和風能等可再生能源所衍生的電能，也可以是生物氧化有機廢物或還原態(tài)的無機物所產(chǎn)生的生物電能，因而兼具了生態(tài)環(huán)境修復功能。另外，MES具有很高的能源轉換效率，其將電能轉換為化學能(有機產(chǎn)物中的化學鍵能)的效率超過80%[10-12]；將MES與光解水系統(tǒng)整合后，利用光能還原CO2效率可高達10%，明顯超過許多農(nóng)作物的光能利用率[13]。在MES中研究較多的微生物為自養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌，如Sporomusaovata和Clostridumljungdahlii，它們以CO2作為電子受體，通過Wood-Ljungdahl途徑還原為乙酰-CoA，進而產(chǎn)生乙酸等有機化合物，通常具有較高的產(chǎn)率和電能轉化效率[11,14-16]。污水、活性淤泥和沉積物等來源的混合微生物菌群也常用作MES的接種物，相比于純培養(yǎng)物而言，混合接種物的MES運行不需要嚴格的無菌條件，但是其代謝產(chǎn)物專一性較差，不僅會降低某一特定產(chǎn)物的轉化效率而且不利于后續(xù)目標產(chǎn)物的分離純化[17]。雖然，由于近幾年在接種物、電極材料和器件等的優(yōu)化改造方面的提升，MES還原CO2生產(chǎn)多碳有機物的產(chǎn)率得到了顯著提高，比如乙酸的產(chǎn)率可高達2.48×103M/(d·m3)[18]；但是據(jù)估算，目前MES生產(chǎn)乙酸的能耗和成本均顯著高于傳統(tǒng)的工業(yè)制備方法即甲醇碳基化法[19-20]，尚不具備商業(yè)化的條件。

圖1 微生物電合成系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic of microbial electrosynthesis system

2 陰極微生物胞外電子傳遞機制

陰極微生物吸收電極上的電子驅動細胞內(nèi)還原(合成)代謝是MES的關鍵過程，EET速率是MES效率的決定性因素之一。因此，MES陰極EET機制的解析是提高陰極微生物吸收電極電子速率和實現(xiàn)MES高產(chǎn)率的基礎。目前，已知的陰極電活性微生物的EET過程可分為兩類[21]：基于電子介體的間接傳遞和基于膜結合蛋白的直接傳遞(圖2)。

圖2 陰極微生物吸收胞外電子的機制示意圖Fig.2 Mechanism schematic of extracellular electron transfer in cathodic microorganisms

2.1 間接電子傳遞

間接EET是由外源或內(nèi)源的氧化還原活性小分子物質作為可逆電子介體所實現(xiàn)的微生物與電極間的電子傳遞過程。人工合成的外源電子介體如中性紅和甲基紫精已被證明可以介導陰極微生物胞外電子傳遞，添加甲基紫精或中性紅可將接種梭狀芽胞桿菌ClostridiumtyrobutyricumBAS 7的MES陰極產(chǎn)丁酸的產(chǎn)率提高1.3倍[22]，中性紅可顯著增加MES陰極還原CO生產(chǎn)揮發(fā)性脂肪酸的庫倫效率[23]，它們的引入顯著增加電子交換速率或者通過改變電子流向而調節(jié)胞內(nèi)還原力(NADH水平)[22,24]。

2.2 直接電子傳遞

直接EET是指不需要依賴任何電子介體，附著在電極上生長的微生物可憑借細胞外膜或周質中的氧化還原蛋白與電極直接接觸而實現(xiàn)電子交換。目前，關于陰極電活性微生物直接EET機制的研究尚較為鮮見，并且主要集中在異化金屬還原菌Geobatersulfurreducens和Shewanellaoneidensis，它們是研究EET機制的模式菌株，均被證實具有雙向EET特性(通常將產(chǎn)電微生物輸出胞內(nèi)電子稱為正向EET，親電微生物吸收胞外電子稱為反向EET)。G.sulfurreducens電極生物膜中細胞在吸收電極電子時，其編碼細胞外膜色素蛋白和鞭毛的基因表達水平要低于輸出電子時的水平，但是編碼周質色素蛋白PCCH的基因在吸收電子時轉錄水平卻較高，而且缺失該基因會嚴重抑制電極生物膜吸收胞外電子的能力，然而對輸出電子過程沒有明顯影響，提示G.sulfurreducens的雙向EET過程可能涉及兩條不同的路徑[31]。與此不同的是，Mtr(CymA-MtrABC/OmcA)途徑被證明同時參與S.oneidensis的雙向EET過程，其吸收胞外電子的路徑很可能為輸出胞內(nèi)電子的逆轉[32]。產(chǎn)乙酸菌和產(chǎn)甲烷菌被報道可以在相對高電勢(-0. 4～-0.5 V)下吸收電極電子驅動乙酸或甲烷的合成，由于該電勢條件下不利于電極產(chǎn)生H2作為電子介體，因而推測它們也可能存在直接EET機制[33-34]，但仍然存在爭議，需要對其分子機制進行進一步研究。另外，產(chǎn)電微生物還可憑借被稱為“細菌納米線”的菌毛直接輸出胞內(nèi)電子并實現(xiàn)較長距離的電子傳遞[35]，但是尚未見“細菌納米線”介導反向EET過程的報道。

相比于間接電子傳遞，基于電極與細胞直接接觸的電子傳遞途徑通常被認為具有更快的動力學和更低的能量損耗[36]，但是對于一個特定的MES而言，有限的器件和電極尺寸往往無法提供足夠大的接觸面積，從而限制了直接電子傳遞的利用率。另外，在較厚的電極生物膜中，外層微生物細胞通常比包裹在生物膜內(nèi)部的細胞具有更高的代謝活力，而直接電子傳遞途徑似乎無法保證其快速交換電子的需求。間接電子傳遞的速率往往依賴于電子介體的濃度，因而可通過提高MES電解液中電子介體的量，實現(xiàn)快速的EET，但是間接電子傳遞在MES實際應用中面臨著“洗出”及二次環(huán)境污染的問題。通過基因改造或代謝工程手段提高MES中電活性微生物自身產(chǎn)生的內(nèi)源性電子介體的分泌量，或者采用固定化技術將電子介體控制在電極界面周圍等策略，也許既可以較大提高EET速率，又可有效解決間接電子傳遞在實際應用過程中所面臨的困難。

3 生物工程強化MES策略與應用

陰極微生物的胞外電子吸收速率和代謝途徑是決定MES產(chǎn)物及其轉化效率的關鍵，理想的MES微生物催化劑不僅需要快速地吸收胞外電極電子并將其與胞內(nèi)還原代謝偶聯(lián)，還需要具備捕獲固定CO2的代謝途徑。但是，具有高EET速率的天然電活性菌(如Geobaterspp.和Shewanellaspp.)通常缺乏還原CO2合成高附加值產(chǎn)物的代謝途徑，而大多數(shù)工業(yè)生產(chǎn)菌一般又不具有EET能力，所以需要通過適當?shù)牟呗院褪侄芜M行調控或改造，使兩者有機整合(圖3)。

圖3 MES陰極微生物特性需求Fig.3 The properties of cathodic microorganisms for MES

3.1 增強胞外電子傳遞能力

近年來對產(chǎn)電微生物EET分子機制的研究不斷深入以及基因編輯工具的發(fā)展，在通過基因工程和代謝調控手段增強天然產(chǎn)電菌EET方面取得了一定研究進展[37]。比如，通過過表達綠膿菌素合成途徑中的甲基轉移酶基因phzM，增強了Pseudomonasaeruginosa分泌綠膿菌素(即電子介體)的能力，從而使得該菌株的正向EET能力得到了較大提高[38]。最近，Yang等[39]通過合成生物策略將Bacillussubtilis中編碼核黃素的核心基因簇(ribADEHC)引入S.oneidensisMR-1中進行異源表達，使得其核黃素分泌量提高了25.7倍，顯著增強了核黃素介導的間接電子傳遞，該工程菌雙向胞外電子傳遞速率均得到了10倍以上的提高。另外，Min等[40]通過同源過表達核黃素合成基因簇(ribDCBAE)和金屬還原酶基因簇(mtrCAB)也使得S.oneidensisMR-1的雙向胞外電子傳遞速率得到了較大提升。通過基因調控改變細胞內(nèi)還原當量水平(NADH/NAD+比值)從而提高正向EET速率在S.oneidensisMR-1和P.aeruginosa等產(chǎn)電菌中也同樣得到實現(xiàn)[41-42]。盡管已有多種策略可用于提高S.oneidensis等天然電活性菌的正、反向EET過程，但是這些電活菌一般缺乏利用胞外電子合成高附加值產(chǎn)物的代謝途徑。有報道稱S.oneidensisMR-1可吸收電極電子實現(xiàn)延胡索酸還原為琥珀酸的過程[32]，但是該反應不涉及CO2的同化，并非真正意義上的微生物電合成。

在工業(yè)生產(chǎn)菌中引入外源EET傳遞通路將其轉變?yōu)殡娀钚跃?，可能是拓展微生物電化學技術應用和實現(xiàn)高效電驅動微生物合成的重要渠道。Jensen等[43]通過異源表達色素蛋白MtrCAB編碼基因，在大腸埃希菌(Escherichiacoli)中重塑了S.oneidensisMR-1的部分胞外電子傳遞鏈，使得E.coli還原可溶性Fe3+離子和不溶性α-Fe2O3的速率分別提高了8倍和4倍，實現(xiàn)了E.coli的胞外電子傳遞過程。在該工程菌中繼續(xù)引入外源CymA蛋白可進一步提高E.coli的正向EET速率和細胞生長量[44]。有研究表明，在E.coli中引入CymA-MtrCAB胞外電子傳遞鏈不僅將電流輸出提高8倍，而且會對胞內(nèi)代謝流的分布產(chǎn)生一定影響[45]，這為代謝調控的應用提供了基礎。在E.coli中成功重塑外源胞外電子傳遞通路為開發(fā)具有工業(yè)應用價值的電活性生產(chǎn)菌提供了新思路，盡管該領域的研究暫時聚焦于正向EET途徑，但相信隨著反向EET分子機制研究的不斷深入，在工業(yè)生產(chǎn)菌中構建反向EET通路從而實現(xiàn)真正意義上的電驅動微生物合成將成為可能。

3.2 調控胞內(nèi)合成代謝

親電微生物在獲得快速吸收胞外電極電子的基礎上，要實現(xiàn)高效的微生物電合成還需具備將所吸收的電子轉化為還原力驅動胞內(nèi)合成代謝的能力；同時，反向EET過程所偶聯(lián)的代謝途徑的類型決定了最終的產(chǎn)物種類。模式電活性菌S.oneidensisMR-1除了被證明可利用胞外電子還原延胡索酸生成琥珀酸外，Jeon等[46]研究證實提供胞外電流還可將S.oneidensisMR-1工程菌(異源表達Ehrlich途徑中2-酮異戊酸脫羧酶基因kivD和乙醇脫氫酶adh)的異丁醇產(chǎn)量提高近1倍，提示可通過有效的代謝調控策略將天然電活性微生物改造為產(chǎn)高附加值生物制品的宿主菌。產(chǎn)乙酸菌以CO2作為電子受體的主要產(chǎn)物為C2-化合物乙酸，通過基因工程手段可調控其胞內(nèi)代謝流從而獲得其他多碳化合物如丙酮、異丙醇和丁酸等(圖4)[47-49]，具有更高的應用價值。產(chǎn)乙酸菌能夠利用Wood-Ljungdahl途徑同化兩個CO2分子合成一個乙酰-CoA，乙酰-CoA的代謝流向是決定MES終產(chǎn)物的關鍵。Ueki等[49]通過基因改造對C.ljungdahlii進行多重代謝調控，包括引入異源的乙酰-CoA合成丁酸途徑、失活乙酰-CoA轉化為乙酸和乙醇的途徑等，從而使得該菌株能將約50%碳源或70%電子流用于丁酸的生產(chǎn)，說明可通過遺傳改造產(chǎn)乙酸菌的Wood-Ljungdahl途徑從而電化學合成比乙酸價值更高的有機化合物。

化能無機自養(yǎng)型細菌Cupriavidusnecator(又名Ralstoniaeutropha)具有豐富多樣的代謝途徑，是生物工程常用宿主菌，也已被成功改造應用于MES。Li等[51]將異源異丁醇和3-甲基-1-丁醇生物合成基因導入R.eutrophaH16菌株中，同時敲除其原有的聚羥基丁酸酯合成途徑，所構建的工程菌可在以電能和CO2為唯一能源和碳源的生物電化學裝置中，利用電化學還原CO2所產(chǎn)生的甲酸進而合成C4-和C5-醇。Grousseau等[50]通過在聚羥基丁酸酯合成能力缺失突變株C.necatorRe2133中過表達自身的β-酮硫解酶基因phaA和CoA-轉移酶基因ctf以及異源表達Clostridium屬來源的乙酰乙酸脫羧酶基因adc和乙醇脫氫酶基因adh，從而構建了能以果糖為唯一碳源的異丙醇生物合成途徑。該工程菌株隨后被應用于微生物電化學裝置中，能以CO2作為碳源，同時以電化學產(chǎn)生的H2作為能源，合成滴度高達216 mg/L的異丙醇[52]。最近，Krieg等[53]的研究表明，在C.necator中引入外源甲戊二羥酸途徑和α-蛇麻烯合成酶，可使該菌株在直接以電極電流作為電子供體和CO2作為電子受體及碳源的條件下合成α-蛇麻烯，每克細胞干重的α-蛇麻烯產(chǎn)量可高達17 mg，從而開辟了微生物電合成生產(chǎn)萜烯類物質的綠色途徑。因此可以看出，通過巧妙的代謝調控可實現(xiàn)多種有機化合物的微生物電合成，從而解決目前微生物電合成產(chǎn)物(乙酸為主)品位低、商業(yè)應用價值不高的瓶頸。

3.3 構建有限的混合微生物群體

單一菌株用于MES的接種物有利于闡述電子傳遞機制等基礎問題，但是其通常只能實現(xiàn)一些相對簡單或單一的物質轉化。另外，過度的基因改造和代謝修飾往往又會對菌株的生長速度、抗性等產(chǎn)生不利影響。有些菌株具有的較好電化學活性或特殊物質轉化能力的，但其不清楚的遺傳背景或缺乏相應的基因操作手段往往會限制其在MES中的應用潛力。雖然，活性淤泥等天然混合微生物菌群用于MES接種物可實現(xiàn)多種的電子傳遞過程和較豐富的代謝流，但是其菌群組成復雜且在MES運行過程中不穩(wěn)定，所形成的副產(chǎn)物多，不利于體系的可控運行和后續(xù)的產(chǎn)物分離純化。人為構建有限的混合微生物群體可能是一種有效的解決方案，通過不同的微生物在該體系中扮演著特定的角色以及它們間的相互關聯(lián)，不僅可以利用不同的代謝途徑實現(xiàn)生物合成產(chǎn)物種類的多樣性，還可以提高電子流和物質流的速度和可控化進程。Marshall等[54]通過分析MES陰極微生物群體的轉錄活性和模擬電驅動合成代謝通路，發(fā)現(xiàn)不同菌株在該體系中充當不同的生態(tài)位，比如Acetobacterium是群體中主要的固碳者，Sulfurospirillum通過呼吸作用消耗溶液中少量氧氣，而Desulfovibrio被認為在電極上產(chǎn)生氫化酶、甲酸脫氫酶和細胞色素等參與質子還原產(chǎn)氫的過程。

氫營養(yǎng)細菌可高效利用H2作為能源驅動生物合成反應，但是它們不能直接從電極吸收電子作為能源或這種能力較弱?；诖?，Deutzmann等[55]將鐵腐蝕菌IS4與Methanococcusmaripaludis或Acetobacteriumwoodii組成有限混合培養(yǎng)群體分別用于產(chǎn)甲烷和產(chǎn)乙酸，其中鐵腐蝕菌IS4從陰極電極吸收電子并產(chǎn)生H2供給M.maripaludis或A.woodii利用，從而實現(xiàn)CO2的固定。Puig等[28]以Rhodobacter(作為產(chǎn)氫菌)和Clostridium(作為固碳菌)構建了電驅動合成有機酸和醇的有限混合培養(yǎng)菌群，并通過電化學手段在電極上檢測到Rhodobacter的產(chǎn)氫蛋白，從而進一步證實了生物合成的H2在MES中的關鍵作用。最近，Xiang等[56]將醋酸桿菌和脫硫弧菌共同接種于MES陰極，發(fā)現(xiàn)在添加6 mmol/L硫酸鹽的條件下乙酸產(chǎn)量和電子捕獲量比未添加硫酸鹽時分別提高了2.7倍和2.4倍。他們推測，脫硫弧菌還原硫酸根所形成的S2-(如H2S)可能具有電子介體的功能，從而提高了醋酸桿菌吸收陰極電子的能力?？梢姡瑯嫿ㄓ邢薜幕旌衔⑸锶后w在MES中的應用，目前主要體現(xiàn)在提高生產(chǎn)菌與電極間胞外電子傳遞(通過電活性菌產(chǎn)生可利用的電子介體)，鮮見通過調控不同微生物菌株間物質代謝流的偶聯(lián)從而拓展終產(chǎn)物種類的報道。

4 展 望

生物工程的理論和相關技術為突破MES兩大瓶頸，即陰極微生物EET速率慢和產(chǎn)品附加值低提供了機遇，并且在增強EET速率和提高產(chǎn)品合成效率方面取得了一定進展，但是要達到實際應用仍然面臨巨大挑戰(zhàn)。①MES陰極EET機理尚不清晰，限制了提高電子傳遞效率的理性設計。盡管對于電活性模式菌株S.oneidensis和G.sulfurreducens的正向EET過程有相對清楚的理解，但是對其反向EET過程的分子機制的研究卻不夠深入。然而這些模式菌株并非MES宿主菌的最佳選擇，對MES陰極親電微生物(包括Sporomusa屬和Clostridum屬)的吸收胞外電子機理、電生理特征和能量代謝模式知之甚少，不利于MES宿主菌的遺傳改造和代謝調控。②MES陰極微生物吸收胞外電子與胞內(nèi)代謝的偶聯(lián)機制不清楚。電合成宿主菌如何將所吸收的胞外電子與胞內(nèi)能量代謝匹配關聯(lián)，這是實現(xiàn)MES的能量和物質轉化的基礎，其關聯(lián)模式?jīng)Q定了MES合成的產(chǎn)物種類和能量轉化效率，也是實現(xiàn)MES全局調控的分子基礎。③可用基因工具箱有限，缺乏精準、高效的定量分析手段，限制了MES宿主菌開發(fā)利用的廣度和深度，難以獲得高附加值產(chǎn)品的高效生產(chǎn)。

針對MES發(fā)展所面臨的上述問題，建議在今后研究過程中應著重從以下幾方面入手。①加快基因組工具箱的開發(fā)，深入研究MES陰極EET的分子機制?；蚬ぞ呤巧钊胙芯课⑸顴ET過程并對其進行分子改造的基礎，缺乏可用的基因操作工具箱通常是限制電活性微生物研究的重要原因。②利用系統(tǒng)生物學綜合分析MES宿主菌EET路徑及其組裝和調控機制、物質與能量代謝偶聯(lián)機制等，挖掘代謝調控改造的靶位，實現(xiàn)全局調控策略。EET過程以及胞內(nèi)物質能量代謝途徑是相對復雜的非線性生物學網(wǎng)絡，需要從細胞整體水平和分子水平進行綜合分析，因此需要高度整合組學技術(基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學等)和各種定量定性分析技術(電化學分析、同位素示蹤、質譜學、原位分析手段等)進行關聯(lián)性研究，并結合數(shù)學模型進行功能預測分析，深入挖掘調控位點和重要反應途徑。③研究MES宿主菌能量代謝流(所吸收的胞外電子)和物質代謝流(CO2固定途徑)的耦合關系，通過相關途徑的改造與調控使電子流向特定產(chǎn)物合成，實現(xiàn)能量的高效利用。④研究MES內(nèi)部環(huán)境(包括電極材料)和操作條件對宿主菌能量和物質代謝的影響，為開發(fā)高性能電極材料和選擇最佳操作參數(shù)奠定基礎，從而實現(xiàn)工程化應用。