張一彤， 韓 雪， 張 毅， 祁贊梅， 邊詩(shī)宇， 孫曉琦

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110122)

Listr1遺傳位點(diǎn)是控制小鼠感染單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)后生存時(shí)間的遺傳位點(diǎn)。該遺傳位點(diǎn)是由Boyartchuk博士采用特殊的數(shù)量性狀位點(diǎn)分析方法確定的高質(zhì)量李斯特菌感染易感位點(diǎn)。其與微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記D5Mit205緊密連鎖[1]。將BALB/c鼠和C57BL/6鼠進(jìn)行多次雜交與回交后，獲得了在BALB/c小鼠基因背景下引入C57BL/6小鼠Listr1遺傳位點(diǎn)的同類系小鼠，即C.B6By-Listr1小鼠。并應(yīng)用該鼠對(duì)Listr1遺傳位點(diǎn)功能進(jìn)行研究顯示C.B6By-Listr1小鼠對(duì)李斯特菌易感性增強(qiáng)，并且Listr1遺傳位點(diǎn)可通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟固有免疫系統(tǒng)的應(yīng)答來(lái)影響小鼠對(duì)李斯特菌的易感性[2]。瘧疾是世界上最嚴(yán)重的感染性疾病之一，WHO報(bào)告顯示，2016年大約有2.16億瘧疾病例，比2015年增加約500萬(wàn)例，死亡人數(shù)達(dá)到44.5萬(wàn)人[3]。在人體內(nèi)，瘧原蟲(chóng)的感染可分為紅外期(肝細(xì)胞內(nèi))的裂體增殖和紅內(nèi)期(紅細(xì)胞內(nèi))的裂體增殖及配子體形成過(guò)程[4-5]。肝臟固有免疫不僅在瘧疾肝內(nèi)期發(fā)揮作用[6]，同時(shí)也參與紅內(nèi)期抗瘧疾免疫應(yīng)答。Frank等[7]對(duì)肝臟固有免疫系統(tǒng)在抗紅內(nèi)期瘧疾免疫中發(fā)揮的作用進(jìn)行了總結(jié)與分析，其中包括：激活TLR受體，急性期反應(yīng)、庫(kù)普細(xì)胞吞噬作用、細(xì)胞因子介導(dǎo)的抗炎反應(yīng)，激活T細(xì)胞和B細(xì)胞的免疫效應(yīng)。由于瘧原蟲(chóng)與李斯特菌均為胞內(nèi)寄生病原體，二者均可在肝內(nèi)進(jìn)行繁殖或在肝內(nèi)被清除，推測(cè)Listr1遺傳位點(diǎn)可能通過(guò)調(diào)控肝臟固有免疫系統(tǒng)來(lái)影響小鼠對(duì)瘧疾的易感性，目前相關(guān)研究鮮有報(bào)道。本研究建立了C.B6By-Listr1小鼠和BALB/c小鼠感染P.y17XL的模型，觀察兩種小鼠感染率、生存率、感染后肝臟組織病理?yè)p傷情況及感染早期肝臟分泌細(xì)胞因子的差異情況，以期探討Listr1遺傳位點(diǎn)影響小鼠對(duì)瘧疾易感性的可能性及其初步作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及瘧原蟲(chóng) C.B6By-Listr1小鼠：將BALB/c鼠和C57BL/6鼠進(jìn)行多次雜交與回交后得到的在BALB/c小鼠基因背景下引入C57BL/6小鼠Listr1遺傳位點(diǎn)的同類系小鼠，由美國(guó)麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院Victor Boyartchuk實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。瓊脂糖凝膠電泳鑒定小鼠基因型如圖1。此小鼠對(duì)李斯特菌易感性增強(qiáng)[2]。BALB/c小鼠：購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物科技有限公司(許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001)。實(shí)驗(yàn)用鼠為6～8周雌性小鼠。致死型約氏瘧原蟲(chóng)P.y17XL，液氮凍存，由BALB/c小鼠周期復(fù)蘇傳代。

圖1 不同基因型小鼠的電泳形態(tài)Fig.1 Electrophoresis form of different genetype miceF:Listr1位點(diǎn)雜合同類系種鼠；B:C.B6By-Listr1同類系小鼠；C:BALB/c小鼠F:Listr1 locus heterozygous congenic mice；B:C.B6By-Listr1 congenic mice；C:BALB/c mice

1.1.2 主要試劑 Trizol、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 、SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)購(gòu)自大連寶生物公司；Giemsa染液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 光學(xué)顯微鏡(Eclipse E100，日本Nikon)；PCR儀(S1000 Thermal Cycler，美國(guó)BIO-RAD)；Realtime PCR(7500，美國(guó)Applied Biosystems)；電泳儀(EPS 300，Tanon)；凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc-It 310，美國(guó)UVP)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 C.B6By-Listr1實(shí)驗(yàn)組：6～8周齡、雌性C.B6By-Listr1小鼠經(jīng)腹腔注射1×104P.y17XL感染紅細(xì)胞。BALB/c對(duì)照組：6～8周齡、雌性BALA/c小鼠經(jīng)腹腔注射1×104P.y17XL感染紅細(xì)胞。感染后第3天開(kāi)始，對(duì)小鼠尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，顯微鏡檢計(jì)數(shù)紅細(xì)胞感染率，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)瘧原蟲(chóng)血癥水平、生存率。

1.2.2 HE染色法觀察肝臟組織的病理?yè)p傷情況 于P.y17XL感染后第5天取小鼠脫頸處死，取肝臟組織于門(mén)靜脈處進(jìn)行灌流，放入4%多聚甲醛中固定，常規(guī)制備石蠟切片進(jìn)行蘇木素-伊紅染色并對(duì)其組織損傷情況進(jìn)行觀察。觀察內(nèi)容包括：組織結(jié)構(gòu)破壞的嚴(yán)重程度及瘧色素沉積情況。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子mRNA水平 分別于感染后第1、2、5天處死小鼠，取少量肝臟組織，使用Trizol試劑提取總RNA，按PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。取100 ng RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，按SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒說(shuō)明書(shū)配制20 μL PCR反應(yīng)體系,于7500(Applied Biosystems，USA)實(shí)時(shí)定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。熱循環(huán)過(guò)程：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。使用肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，特異性引物序列見(jiàn)表1。

表1 所用引物

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，兩組數(shù)據(jù)間比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 P.y17XL 感染BALB/c和C.B6By-Listr1小鼠的原蟲(chóng)血癥和生存率的比較

如圖2所示，C.B6By-Listr1小鼠與BALB/c小鼠經(jīng)腹腔感染P.y17XL 寄生的紅細(xì)胞(pRBC)，于感染后第3天在外周血可見(jiàn)瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞，隨后原蟲(chóng)血癥逐漸升高。C.B6By-Listr1小鼠的感染率較BALB/c小鼠上升快，感染后4～8 d C.B6By-Listr1小鼠蟲(chóng)血癥水平顯著高于BALB/c小鼠(P<0.05)。C.B6By-Listr1小鼠感染率于感染后第7天達(dá)到高峰81.7% 并開(kāi)始死亡，于感染后第9天全部死亡；BALB/c小鼠于感染后第8天開(kāi)始出現(xiàn)死亡，至第9天半數(shù)的BALB/c小鼠死亡；其余的BALB/c小鼠于感染率達(dá)高峰后開(kāi)始下降，在感染后第13天仍然存活。兩種小鼠生存率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。表明C57BL/6小鼠來(lái)源的Listr1遺傳位點(diǎn)可以影響小鼠對(duì)P.y17XL的易感性，該位點(diǎn)使小鼠對(duì)P.y17XL的抗性降低。

圖2 P.y17XL 感染C.B6By-Listr1小鼠和BALB/c小鼠后不同時(shí)間原蟲(chóng)血癥水平(A)及生存率(B)Fig.2 Parasitemia rate(A) and survival rate (B) of BALB/c and C.B6By-Listr1 mice infected with P.y17XL*：組間差異具有顯著性，P<0.05，圖4同*： indicates the significant difference between groups P<0.05,same Fig.4

2.2 P.y17XL感染BALB/c和C.B6By-Listr1小鼠后肝臟組織病理?yè)p傷情況比較

兩種小鼠感染率自感染后第3天起逐漸上升，感染后第5天開(kāi)始出現(xiàn)較大差異，故選取第5天的肝臟組織進(jìn)行染色。如圖3所示，HE染色可見(jiàn)兩種小鼠肝臟組織均出現(xiàn)了一定程度的損傷：肝細(xì)胞排列雜亂疏松、大小不一，肝竇擴(kuò)張和腫脹，肝細(xì)胞萎縮溶解。不同之處如下：C.B6By-Listr1小鼠中可見(jiàn)到明顯的瘧色素的沉積(箭頭示)，而B(niǎo)ALB/c小鼠全片基本未見(jiàn)到。由此表明，Listr1遺傳位點(diǎn)影響了瘧原蟲(chóng)在肝臟內(nèi)的增殖和清除過(guò)程。

2.3 P.y17XL感染C.B6By-Listr1和BALB/c小鼠肝臟組織,炎性細(xì)胞因子分泌情況的比較

分別于P.y17XL感染C.B6By-Listr1小鼠和BALB/c小鼠后第0、1、2、5天取肝臟組織，Realtime-PCR檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ的分泌情況,如圖4所示，未感染狀態(tài)下的兩種小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ的分泌水平均相差不大；IFN-γ的分泌量在感染早期并未見(jiàn)到明顯的升高，在感染后期分泌量有所增高，但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。TNF-α 和IL-6的分泌量早期隨著時(shí)間的推移逐漸增高，感染后24 h還未見(jiàn)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，48 h可見(jiàn)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。BALB/c小鼠顯著高于C.B6By-Listr1小鼠(P<0.05)。IL-1β的分泌量未觀察到隨時(shí)間變化的規(guī)律，在感染后24 h分泌量有輕微升高，48 h仍未觀察到明顯的升高，且未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由此表明，P.y17XL感染后BALB/c小鼠肝臟的炎癥反應(yīng)上調(diào)，即BALB/c小鼠P.y17XL感染早期肝內(nèi)天然免疫的炎癥反應(yīng)強(qiáng)于C.B6By-Listr1小鼠。

圖3 P.y17XL感染小鼠后第5天肝臟組織病理?yè)p傷情況(HE染色)Fig.3 Pathological damage after five days of P.y17XL infection in mouse liver(HE Staining)A: C.B6By-Listr1小鼠;B: C.B6By-Listr1小鼠;C:BALB/c小鼠;D:BALB/c小鼠A: C.B6By-Listr1 mice;B: C.B6By-Listr1 mice;C:BALB/c mice;D:BALB/c mice

圖4 BALB/c 小鼠和C.B6By-Listr1小鼠感染 P.y17XL后IFN-γ(A) IL-1β(B)、IL-6(C)、TNF-α(D)的分泌情況Fig.4 The mRNA level of IFN-γ(A)， IL-1β(B)，IL-6(C)，TNF-α(D)in the liver of BALB/c and C.B6By-Listr1 mice infected with P.y17XL

3 討 論

本研究應(yīng)用C.B6By-Listr1同類系小鼠作為實(shí)驗(yàn)組，BALB/c小鼠作為對(duì)照組，探討了Listr1遺傳位點(diǎn)影響小鼠對(duì)P.y17XL易感性的可能性及其初步作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C.B6By-Listr1同類系小鼠于感染P.y17XL后原蟲(chóng)血癥水平高于野生型BALB/c小鼠，生存率顯著降低。表明Listr1遺傳位點(diǎn)不僅控制小鼠對(duì)李斯特菌的易感性，也控制小鼠對(duì)瘧疾的易感性。同一遺傳位點(diǎn)對(duì)不同胞內(nèi)寄生菌易感性的調(diào)控此前已有報(bào)道。Boyartchuck等發(fā)現(xiàn)，控制小鼠對(duì)結(jié)核桿菌(mycobacteriumtuberculosis,MTB)易感性的sst1[8]遺傳位點(diǎn)也控制小鼠對(duì)李斯特菌的易感性，并發(fā)現(xiàn)其作用與IFN-γ激活巨噬細(xì)胞分泌活性氧自由基的過(guò)程有關(guān)[9-10]。最終發(fā)現(xiàn)sst1遺傳位點(diǎn)中的Ipr1基因通過(guò)蛋白SP110誘發(fā)巨噬細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和抑制抗凋亡因子的過(guò)程[11]來(lái)影響小鼠對(duì)結(jié)核分枝桿菌和李斯特菌的易感性[12-13]。

疾病的易感性與基因多態(tài)性息息相關(guān)[14-16]。Listr1遺傳位點(diǎn)涵蓋了11.4 Mb長(zhǎng)度的基因組區(qū)域，包含了100多條注釋基因，其中的10個(gè)是編碼CXC家族趨化因子的[2]。我們發(fā)現(xiàn)Listr1遺傳位點(diǎn)中Cxcl11等位基因處有一框移突變，該突變使得小鼠不能合成完整的趨化因子CXCL11。CXCL11可參與肝臟固有免疫系統(tǒng)組分穩(wěn)態(tài)的調(diào)控,誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生干擾素，趨化白細(xì)胞的遷移[17]。瘧原蟲(chóng)通過(guò)瘧蚊傳播，由血進(jìn)入肝臟入侵肝細(xì)胞，并進(jìn)行大量的無(wú)性增殖，隨后裂殖子從肝細(xì)胞中釋放，入侵紅細(xì)胞在紅細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無(wú)性增殖，導(dǎo)致周期性發(fā)熱、肝脾腫大、貧血等臨床癥狀，此紅內(nèi)期階段和瘧疾的發(fā)病率與死亡率直接相關(guān)[18]。而肝臟固有免疫也參與紅內(nèi)期抗瘧疾免疫應(yīng)答。Wunderlich等發(fā)現(xiàn)在致死性的P.chabaudi感染中，血清中IL-1β、TNF-α和IL-6產(chǎn)生2個(gè)波峰，第1個(gè)波峰在第1天，第2個(gè)波峰在蟲(chóng)血癥最高的第8天。與此同時(shí)肝臟也檢測(cè)到產(chǎn)生雙時(shí)相性的編碼IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA[19-20]。為了解C.B6By-Listr1小鼠與BALB/c小鼠感染約氏瘧原蟲(chóng)后Listr1遺傳位點(diǎn)對(duì)肝內(nèi)免疫的調(diào)控作用，我們對(duì)兩種小鼠肝內(nèi)病理和炎癥應(yīng)答情況進(jìn)行了分析。

取兩種小鼠感染率開(kāi)始出現(xiàn)較大差異即感染后第5天的肝臟組織HE染色進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)C.B6By-Listr1小鼠肝臟中有較明顯的瘧色素沉積，而B(niǎo)ALB/c小鼠肝臟中幾乎未見(jiàn)瘧色素的沉積。瘧色素(hemozoin,HZ)是由瘧原蟲(chóng)在代謝宿主紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白過(guò)程中，所產(chǎn)生的一種亞鐵血紅素結(jié)合體，它可隨瘧原蟲(chóng)寄生的紅細(xì)胞破裂而釋放，并且很快會(huì)被吞噬細(xì)胞所吞噬沉積在組織當(dāng)中[21]。瘧色素在C.B6By-Listr1同類系小鼠肝內(nèi)大量沉積，一方面印證了其高水平的原蟲(chóng)血癥，另一方面反映了肝臟在清除瘧原蟲(chóng)感染紅細(xì)胞中的作用。我們的前期研究中顯示BALB/c小鼠肝臟表達(dá)趨化因子CXCL11受體CXCR3、CXCR7的CD14+的細(xì)胞數(shù)量高于C.B6By-Listr1同類系小鼠。由此推測(cè)BALB/c小鼠對(duì)瘧原蟲(chóng)感染紅細(xì)胞的清除可能好于C.B6By-Listr1小鼠，從而使其原蟲(chóng)血癥水平得到控制。同時(shí)也觀察到BALB/c小鼠肝細(xì)胞肝板腫脹，空泡變多，胞質(zhì)更加疏松，有輕微的脂肪變性，提示BALB/c小鼠肝內(nèi)炎癥反應(yīng)可能強(qiáng)于C.B6By-Listr1小鼠。

為進(jìn)一步了解BALB/c小鼠感染P.y17XL早期肝內(nèi)是否存在與單核巨噬細(xì)胞活化相關(guān)的炎癥反應(yīng)，取P.y17XL感染后兩種小鼠肝臟組織進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)感染后48 h，IL-6、TNF-α的分泌水平均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。TNF-α擁有廣泛的生物學(xué)功能，主要由激活的巨噬細(xì)胞釋放，也可由抗原刺激的T細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞和肥大細(xì)胞分泌，是機(jī)體適應(yīng)性免疫和固有免疫的重要組成部分[22]。而IL-6是可在體內(nèi)發(fā)揮多種作用的細(xì)胞因子，在炎性環(huán)境下，成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞均可合成IL-6發(fā)揮相應(yīng)的作用[23]。我們檢測(cè)到IL-6、TNF-α的分泌水平BALB/c小鼠要高于C.B6By-Listr1小鼠，與此前觀察到的兩種小鼠肝內(nèi)CD14+細(xì)胞數(shù)量差異相符，提示肝內(nèi)CD14+單核/巨噬細(xì)胞可能參與肝內(nèi)抗瘧原蟲(chóng)免疫應(yīng)答。另一方面，Robinson等[24]的研究顯示瘧疾肝內(nèi)期產(chǎn)生的細(xì)胞因子也會(huì)在紅內(nèi)期產(chǎn)生系統(tǒng)性的影響。綜上，在瘧疾感染過(guò)程中，Listr1遺傳位點(diǎn)發(fā)揮一定的調(diào)控作用，影響小鼠肝臟對(duì)入侵瘧原蟲(chóng)的清除，影響肝臟虐色素的沉積和肝臟炎性細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而對(duì)小鼠蟲(chóng)血癥和生存情況造成影響，肝內(nèi)CD14+單核/巨噬細(xì)胞可能參與此調(diào)控的過(guò)程。

瘧疾至今仍是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，本研究為瘧疾感染后體內(nèi)產(chǎn)生的復(fù)雜免疫反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制提出了可能的遺傳位點(diǎn)，有助于研究者更好地理解機(jī)體瘧疾感染的抵抗機(jī)制，為進(jìn)一步干預(yù)瘧疾進(jìn)程提供參考。同時(shí)鑒于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Listr1遺傳位點(diǎn)對(duì)肝內(nèi)天然免疫功能的影響，該位點(diǎn)可能不僅控制肝內(nèi)抗感染免疫，還可能在其他的一些肝臟疾病如病毒性肝炎、非酒精性肝硬化、脂肪肝、肝癌也發(fā)揮重要作用。因此，深入研究Listr1遺傳位點(diǎn)的功能及其調(diào)控的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)具有重要意義。