徐萍　徐小博?。裕粒裕桑粒危? Ｆｏｔｉｎａ　王三虎　趙坤

摘要：從新鄉(xiāng)市某養(yǎng)雞場的疑似新城疫病雞群中分離到1株新城疫病毒，并對該病毒分離株進(jìn)行F基因的擴增、序列測定和遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明，該新城疫病毒分離株的F基因全長為1 662 bp，F(xiàn)蛋白裂解位點區(qū)的氨基酸序列為112R-R-Q-K-R-F117，具備強毒株的特征;同源性分析表明，該新城疫病毒分離株與國內(nèi)外流行的基因Ⅶ型強毒株之間的同源性較高，為87.5%～97.7%，其中與國內(nèi)流行的基因Ⅶd型的參考毒株同源性最高，為95.4%～97.7%，而與現(xiàn)用疫苗株La Sota、Clone-30、B1、Mukteswar等同源性較低，84.2%～86.6%;系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，該新城疫病毒分離株與基因Ⅶd型參考毒株FJ882014、FJ608335和GU227738處在同一個進(jìn)化分支上，親緣關(guān)系最近。

關(guān)鍵詞：新城疫病毒;F基因;克隆;序列分析;遺傳進(jìn)化;雞

中圖分類號：Q78? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）15-0132-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.15.031? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Cloning and genetic evolution analysis of one strain of newcastle disease virus

XU Ping1，2，XU Xiao-bo1，TATIANA Fotina2，WANG San-hu3，ZHAO Kun3

（1.College of Life Science and Technology，Xinxiang University，Xinxiang 453003，Henan，China;2.Department of Veterinary Medicine，Sumy National Agrarian University，Sumy 40021，Ukraine;3.College of Animal Science and Technology， Henan Institute Science and Technology，Xinxiang 453003，Henan，China）

Abstract： A Newcastle disease virus（NDV） was isolated from ND suspected chickens of a scale chicken farm in Xinxiang. The F gene of the isolated Newcastle disease virus（NDV） was amplified and analyzed by genetic evolution. The results showed that the whole nucleotied sequence length of F gene was 1 662 bp. The sequence of amino acid of F gene at the cleavage site is 112R-R-Q-K-R-F117， which is consistent with the characteristics of strong NDV strain. Comparison of the NDV with the strong NDV of gene Ⅶ of epidemic strains from different countries， results showed that the nucleotide homology was 87.5%～97.7%， and in which the comparison with the Ⅶd was 95.4%～97.7%. Comparison of the NDV isolated with the current vaccine strains such as La Sota， Clone-30， B1， Mukteswar and so on， the nucleotide homology was 84.2%～86.6%. The phylogenetic tree analysis demonstrated that the NDV isolated and Ⅶd strains of FJ882014，F(xiàn)J608335 and GU227738 were located in the same cladogram branch.

Key words： Newcastle disease virus;F gene;cloning;sequence analysis;genetic evolution;chicken

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是引起禽類新城疫（Newcastle Disease，ND）高度接觸性、急性、敗血性傳染病的病原[1]。該病原屬于副黏病毒科禽腮腺炎病毒屬，為有囊膜的單股負(fù)鏈RNA病毒[2]。NDV基因組全長約15 kb，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為NP、P、M、F、HN和L蛋白，其中融合蛋白（F）和血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白（HN）為NDV的功能性糖蛋白[3]。兩種蛋白在機體免疫應(yīng)答和致病過程中起著極其重要的作用。HN蛋白在病毒侵染過程中起識別受體的作用，而F蛋白則參與病毒與宿主細(xì)胞及宿主細(xì)胞間融合過程，兩種蛋白均為NDV的保護(hù)性抗原。F蛋白裂解位點處的氨基酸序列對病毒毒力有著非常重要的影響，被看作判定NDV毒力的重要標(biāo)準(zhǔn)[4-6]。此外，根據(jù)F基因的高變區(qū)序列將NDV劃分為不同的基因型。對NDV分離株F蛋白的研究，有助于了解雞新城疫的發(fā)病原因。本研究從新鄉(xiāng)市某雞場分離得到的新城疫病毒對其F基因進(jìn)行克隆和分析，從分子水平闡明該毒株與其他各毒株間的差異，為該病的防控及分子流行病學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料及試劑

NDV病毒，分離自新鄉(xiāng)市某雞場;無特定病原的雞胚（SPF）購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司;大腸桿菌E.coli DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;pMD18-T vector克隆載體、Ex Taq酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、miRCURY RNA Isolation Kit、PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、普通瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司;Amp、Kan+、X-gal、IPTG、瓊脂粉購自Sigma公司;瓊脂糖、酵母粉和蛋白胨購自O(shè)XOID公司。

1.2? 病毒的繁殖

病毒經(jīng)過分離純化后，尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，每胚0.2 mL，37 ℃孵育72 h。無菌收集24 h后死亡雞胚尿囊液，并測定其血凝性。

1.3? 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank已收錄的NDV F基因序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計引物，P1：5-ATGGGCTC

CAAACCTTCTACCA-3;P2：5-TCATGCTCTTGCAG

TGGCTCTCAT-3，引物序列由Invitrogen（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.4? F基因的克隆及序列測定

1.4.1? NDV基因組RNA的提取? 按TRIzol法提取La Sota毒株（陽性對照）和病料尿囊液的病毒基因組RNA，保存于-80 ℃。

1.4.2? RT-PCR擴增及目的基因的回收純化? 采用NDV特異性引物，經(jīng)RT-PCR擴增F基因。20 μL反轉(zhuǎn)錄體系為dNTP mixture 1 μL、Random 6 mers 1 μL、RNA 8 μL。65 ℃水浴5 min，再加入Rnme script II Rtose 0.5 μL、5×Prime script II Buffer 4 μL、Rnase Inhibitor 0.5 μL、Rnase H2O 5 μL。樣品加好混勻后30 ℃ 12 min，42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，即獲得反轉(zhuǎn)錄的cDNA。PCR擴增反應(yīng)體系為2×Taq MasterMix 25 μL、P1 2 μL、P2 2 μL、ddH2O 19 μL、模板cDNA 2 μL，混勻;PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性10 min;94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，30個循環(huán);72 ℃延伸10 min后4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用普通瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物再次電泳檢測。

1.4.3? NDV F基因的克隆與鑒定? 將回收純化的F基因與pMD18-T載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，于LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆于含Amp的LB液體培養(yǎng)液中37 ℃振蕩過夜，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定。將陽性質(zhì)粒送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.5? NDV F基因的分子遺傳變異分析

采用DNA Star等軟件，對分離株與國內(nèi)外NDV參考株F基因序列進(jìn)行分析，并繪制進(jìn)化樹[7-11]。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 尿囊液血凝性檢測結(jié)果

將無菌收集的雞胚尿囊液經(jīng)雞紅細(xì)胞懸液進(jìn)行直接血凝試驗測定。結(jié)果表明，尿囊液具有明顯的血凝性。

2.2? NDV F基因的RT-PCR檢測結(jié)果

利用F基因特異性引物對尿囊液進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，從尿囊液中擴增出1 700 bp的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。

2.3? NDV F基因的序列測定及結(jié)果分析

由測序結(jié)果可知，該新城疫病毒分離株全長1 662 bp，其編碼的氨基酸序列分析可知，其序列長度符合NDV病毒F基因序列長度，氨基酸裂解位點與NDV強毒株的特征相符。該毒株F蛋白裂解位點區(qū)的氨基酸序列為112R-R-Q-K-R-F117，在氨基酸序列101位和121位為賴氨酸（K）和纈氨酸（V），和基因Ⅶ NDV強毒株的特征性氨基酸一致。

2.4? 核苷酸序列同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

NDV分離株與國內(nèi)外參考株F基因的核苷酸序列同源性在84.2%～97.7%（表1）。其系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，分離株基因序列與基因Ⅶ型參考毒株同源性在87.5%～97.7%，其中與基因Ⅶd型的參考毒株同源性最高為95.4%～97.7%，處于同一分支（圖2）;而與現(xiàn)用疫苗株（La Sota、Clone-30、B1、Mukteswar等）之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，同源性較低，在84.2%～86.6%之間。

3? 討論

F蛋白是NDV感染細(xì)胞所必需的，可以促進(jìn)病毒囊膜與細(xì)胞膜的融合，從而使病毒穿入細(xì)胞膜，并脫去核衣殼進(jìn)行復(fù)制。研究表明，NDV感染細(xì)胞的前提是F蛋白首先被裂解為F1和F2，而F蛋白能否被裂解，取決于F蛋白裂解位點（112-117aa）氨基酸組成和宿主細(xì)胞的特性，定點突變技術(shù)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)蛋白裂解區(qū)域的堿性氨基酸殘基數(shù)決定了它的裂解能力和毒力，是區(qū)分毒力強弱的重要標(biāo)志[12]。研究表明，所有強毒株的裂解位點一般為112R/K-R-Q-K/R-R-F117，弱毒株的裂解位點一般為112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117[13-15]。序列分析表明，本研究分離的NDV毒株F基因的裂解位點氨基酸排列順序為R-R-Q-K-R-F，是典型的強毒株裂解位點模式。通過NDV新鄉(xiāng)分離株F基因的分子遺傳進(jìn)化分析表明，該強毒株屬于基因Ⅶ型，且與國內(nèi)流行的基因Ⅶd型毒株同源性高于95.4%，但是卻與現(xiàn)用疫苗株之間的同源性較低，也是中國新城疫免疫效果差的原因。中國目前流行的新城疫毒株主要為基因Ⅶ型，而這其中基因Ⅶd型新城疫毒株發(fā)病率占60%[16-19]。通過本研究結(jié)果可知，新城疫新型疫苗的制備需篩選與當(dāng)前流行株密切相關(guān)的毒株作為候選疫苗株，配合常規(guī)疫苗免疫，才能更好地控制新城疫的流行，進(jìn)而減少對中國養(yǎng)禽業(yè)的危害。

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