葉珊珊 李瑩潔 李 卉 姚香君 王再興

天皰瘡(pemphigus)是一種侵犯皮膚、黏膜的慢性自身免疫性大皰病，以患者血清中測得橋粒芯糖蛋白抗體為該病的主要特征[1]。Th17細胞是一種新型的T細胞亞群，作為免疫反應的主要效應細胞，在自身免疫性疾病、慢性炎癥的發(fā)生中起著關鍵性作用[2]。目前已有許多自身免疫性疾病被報道與Th17有關，如類風濕關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及銀屑病等[1]，但在天皰瘡中的研究非常少見，相關的細胞因子與趨化因子在天皰瘡中的作用也不清楚。本文通過檢測患者血清中Th17細胞相關的細胞因子與趨化因子，探討其在天皰瘡發(fā)病中的作用機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2017年12月至2018年8月安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚科收治的31例天皰瘡患者作為病例組，男15例，女16例，平均年齡(57.23±14.56)歲，經(jīng)臨床、組織病理和天皰瘡自身抗體檢測明確診斷分型的尋常型天皰瘡18例(58.06%)，落葉型天皰瘡7例(22.58%)，紅斑型天皰瘡6例(19.35%)。另選取明確診斷為大皰性類天皰瘡(Bullous pemphigoid，BP)初發(fā)患者15例，男6例，女9例，平均年齡(67.20±10.87)歲及20名排除自身免疫性疾病、惡性腫瘤、感染等疾病的健康體檢者作為對照組，其中男9名，女11名，平均年齡(52.75±13.50)歲。在31例天皰瘡患者中，有23例患者疾病控制穩(wěn)定后留有血清樣本。

按照目前國際公認的天皰瘡病情評估方法，即天皰瘡面積指數(shù)(pemphigus disease area index, PDAI)，將患者入院時的皮膚及黏膜活動性的損害情況進行嚴重程度的量化分級，根據(jù)患者病情所獲分值，分為輕度(0～8分)、中度(9～24分)、重度(≥25分)。其中輕度組6例(19.35%)、中度組15例(48.39%)、重度組10例(32.26%)三組。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集及處理 抽取31例治療前和23例治療后天皰瘡患者、15例BP及20名健康對照者外周靜脈血5 mL，靜置沉淀2 h后，以3000 r/min的速度離心，5 min后吸取上層血清樣本，置于-80℃冰箱保存以備檢測。

1.2.2 實驗方法 應用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清中Th17相關的細胞因子IL-6、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23和趨化因子CXCL-8、CCL-5水平。實驗嚴格按照試劑盒(Abcam產(chǎn)品，英國)標準操作程序進行。

2 結(jié)果

2.1 病例組與兩組對照組細胞因子與趨化因子的比較 病例組與類天皰瘡組及健康對照組兩兩比較發(fā)現(xiàn)，病例組血清中Th17相關細胞因子和趨化因子水平明顯高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；而病例組與類天皰瘡組比較發(fā)現(xiàn)IL-21在兩組間具有顯著的差異性(P<0.05)，即病例組中IL-21水平明顯低于類天皰瘡組，而其它細胞因子未見明顯差別(P>0.05)。見表1。

表1 三組細胞因子與趨化因子水平比較

注：*病例組與類天皰瘡組比較，P<0.05，有統(tǒng)計學差異

2.2 不同亞型天皰瘡患者血清細胞因子與趨化因子的比較 尋常型、落葉型、紅斑型天皰瘡三組間經(jīng)方差分析比較，差異無顯著性(P>0.05)。見表2。

2.3 不同嚴重程度的天皰瘡患者血清細胞因子與趨化因子的比較 三種不同嚴重程度的天皰瘡患者血清中Th17相關因子水平的統(tǒng)計結(jié)果顯示：IL-17、IL-21、IL-22、IL-23、CCL-5與疾病嚴重程度顯著相關(P<0.05)；并且血清IL-23水平在三組間比較具有明顯差異，且疾病程度越重，細胞因子表達水平越高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；IL-6、CXCL-8差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表3。

2.4 天皰瘡患者治療前后細胞因子與趨化因子的比較 在天皰瘡患者治療前后血清中Th17相關細胞因子與趨化因子的比較發(fā)現(xiàn)，IL-6、IL-10、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23和CXCL-8均較治療前呈現(xiàn)明顯下降趨勢(P<0.001)，而CCL-5水平也有下降，但不顯著(P>0.05)。見表4。

表2 不同亞型天皰瘡患者血清細胞因子與趨化因子的比較

表3 不同嚴重程度的天皰瘡患者血清細胞因子與趨化因子的比較

注：*P<0.05,差異有統(tǒng)計學意義

表4 治療前后細胞因子與趨化因子水平比較

3 討論

天皰瘡是一種自身抗體導致的皮膚疾病，在患者血清和皮損處檢測出針對橋粒芯糖蛋白1和 3(desmoglein，Dsg1和Dsg3)特征性IgG自身抗體，B細胞產(chǎn)生致病性抗體是引起棘層細胞松解，皮膚、黏膜出現(xiàn)特征性水皰的關鍵因素，而T細胞亞群及其相關因子在誘導和維持天皰瘡抗體的產(chǎn)生中起著重要作用[1]。近年來，新型CD4+亞群Th17細胞被發(fā)現(xiàn)參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)病過程而逐漸受到關注。直至2008年，Arakawa等[2]通過免疫組化染色試驗，發(fā)現(xiàn)天皰瘡患者皮損中Th17細胞及其細胞因子IL-17呈現(xiàn)高度表達狀態(tài)，首次揭開了探討Th17細胞及相關因子在天皰瘡發(fā)病機制研究的序幕。

Th17細胞是一種分泌特征性IL-17的輔助T細胞亞群[3]。初始CD4+-CD161+Th細胞在特異性的細胞因子，如TGF-β、IL-6、IL-1β、IL-21、IL-23協(xié)同作用下激活STAT3信號傳導途徑，誘導RORγt的過度表達，從而促進Th17細胞的分化和細胞因子IL-17、IL-22的產(chǎn)生[4]。趨化因子作為一種調(diào)節(jié)細胞運輸、控制免疫細胞遷移的信號肽[5]，與Th17細胞介導組織炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關。目前，國內(nèi)對趨化因子在天皰瘡中的作用尚無相關研究。

體內(nèi)B細胞分泌主要的自身抗體IgG1和IgG4，與表皮結(jié)構(gòu)蛋白相結(jié)合后可能直接誘導水皰的形成，或間接激發(fā)炎癥通路，包括補體激活、白細胞向病灶聚集、大量蛋白酶釋放導致皮損的發(fā)生[6]。IL-6是一種炎性細胞因子，參與炎癥反應，誘導B細胞增殖、終末分化及免疫球蛋白的分泌[7]；而IL-21作為Th17細胞自分泌細胞因子，與IL-4協(xié)同后可誘導CD40L刺激性B細胞產(chǎn)生IgG1抗體[8]從而發(fā)揮致病作用。我們實驗結(jié)果與既往研究一致的是，在天皰瘡患者血清或皮損檢測到IL-6、IL-21的強陽性表達[9，10]，兩種因子或許也可在細胞免疫階段促進B細胞抗體分泌，致高濃度的抗Dsg抗體產(chǎn)生而導致天皰瘡的發(fā)病。IL-21促進了Th17作用，同時也抑制幼稚CD4+T分化為Treg細胞的能力，致使兩種細胞失衡[11]；另有研究表明，刺激離體Dsg3后也檢測到了分泌IL-21的特異性自身反應性T細胞[10]，這些發(fā)現(xiàn)均提示與疾病的發(fā)生有關。

IL-17是Th17細胞最重要的效應因子，為T細胞誘導炎癥反應早期的啟動因子，活化后的T細胞產(chǎn)生的CCL-5/RANTES具有很強的募集單核細胞、Th1、Th17和嗜酸粒細胞的能力,從而誘導炎性因子的過度表達[12]，而與炎癥反應過程中產(chǎn)生的CXCL-8/IL-8共同作用下，可募集中性粒細胞趨化至炎癥部位[13]；在我們的實驗中，也發(fā)現(xiàn)天皰瘡患者血清中三者均有不同程度的升高，這或許可在一定程度上解釋天皰瘡病理中見真皮淺層中性粒細胞、嗜酸粒細胞等浸潤的原因。而有學者認為，IL-8的增加可能不是導致天皰瘡形成的直接原因，是皮膚屏障受損后炎癥反應的結(jié)果[1]。但也有研究表明，在表皮中炎癥因子和趨化因子的過度表達，如IL-6、CXCL-8、MCP-1可導致中性粒細胞活化，細胞內(nèi)活性氧(ROC)的釋放，導致真皮表皮交界處的破壞[14]。在皮膚中，IL-22介導表皮的增生、脫落，角質(zhì)形成細胞的增殖和終末分化等生物學過程。同時有研究發(fā)現(xiàn)， CCL-5與IL-22具有相互抑制現(xiàn)象[15]，但在我們的研究中，并未體現(xiàn)這一特點。曾有學者發(fā)現(xiàn)天皰瘡患者治療后，IL-22的水平呈現(xiàn)上升趨勢[16]，并且不同以往的研究[15，17]，IL-22在不同亞型比較也未發(fā)現(xiàn)明顯的差異性，這或許與本實驗樣本量有限有關，目前還需擴大樣本數(shù)量作深入研究。

IL-23不僅是啟動Th17細胞分化的關鍵因素，也是增強Th17擴增、穩(wěn)定細胞、維持功能、發(fā)揮慢性炎癥反應的重要因子[5]。Timoteo等[17]在天皰瘡患者血清中同樣發(fā)現(xiàn)IL-23水平升高，并且伴隨IL-6與IL-17的表達增強，這與我們的發(fā)現(xiàn)一致。而在我們的研究中，IL-23不僅在天皰瘡患者血清中明顯升高，并且與疾病的嚴重程度呈正相關，提示其表達水平可用于評估天皰瘡的嚴重程度。有人提出，Th17細胞的致病性與IL23/IL23R信號通路過度激活有關[18]?；蛟S，IL23/Th17軸可能是揭示天皰瘡發(fā)病機制的新途徑[19]，為天皰瘡的治療提供最有希望的靶點之一。

綜上所述，我們通過研究發(fā)現(xiàn)Th17相關細胞因子和趨化因子在天皰瘡等自身免疫性皰病中呈異常表達，并且在疾病控制穩(wěn)定后細胞因子水平呈現(xiàn)下降的趨勢，因而認為它們可能在介導炎癥反應、趨化效應細胞，以及誘導B細胞分化特異性抗體等方面，參與疾病的發(fā)生。部分因子水平與天皰瘡嚴重程度具有一定相關性，這也提示著Th17相關因子與疾病狀態(tài)有關，并且IL-23的表達差異有助于判斷天皰瘡的嚴重程度，為臨床的診斷治療提供了重要依據(jù)。

在后續(xù)研究中，我們擬進一步檢測天皰瘡皮損及皰液中Th17相關因子的水平，并分析天皰瘡特異性抗體與分子水平的相關性，對Th17相關細胞因子在天皰瘡發(fā)病中的作用進行深入研究。