韓 悅 姚 煦

特應(yīng)性皮炎(Atopic dermatitis，AD)是一種常見的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性過敏性皮膚病，好發(fā)于兒童，可伴有過敏性鼻炎、哮喘和食物過敏，臨床表現(xiàn)為劇烈瘙癢，嚴(yán)重影響患兒的生活質(zhì)量和身心發(fā)育，是皮膚科最受關(guān)注的疾病之一[1,2]。近年來AD的發(fā)病率呈迅速升高的趨勢(shì)，有報(bào)道顯示我國多城市兒童AD發(fā)病率為12.94%[3]。然而目前AD發(fā)病機(jī)制尚未完全揭示，因此，積極探索AD的發(fā)病機(jī)制具有十分重要的意義。隨著科技的發(fā)展，生物信息學(xué)已成為預(yù)測(cè)基因功能、調(diào)控信號(hào)通路最重要的手段之一[4]，如果能應(yīng)用生物信息技術(shù)手段預(yù)測(cè)AD患兒血清中的某些基因功能和參與的信號(hào)通路，那么對(duì)輔助AD的臨床診治具有非常重要的科學(xué)意義。

microRNAs(miRNA)是一類真核生物體內(nèi)分泌的長度為21～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈微小RNA，它能與mRNA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并參與基因的調(diào)控，是重要的基因表達(dá)調(diào)控因子[5,6]。所以，我們可以通過分析AD患兒外周血中miRNA芯片信息并通過生信學(xué)軟件和數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)其靶基因的功能和調(diào)控的信號(hào)通路來研究其對(duì)AD診治的意義。故本文擬基于高通量測(cè)序技術(shù)利用生物信息學(xué)方法分析miRNA在兒童AD中的表達(dá)差異及潛在的應(yīng)用價(jià)值，為臨床尋找潛在的藥物靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 資料與研究方法

1.1 芯片信息 從NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公共數(shù)據(jù)平臺(tái)GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫中下載的GSE 62404數(shù)據(jù)集，為人類芯片miRNAs表達(dá)譜數(shù)據(jù)，芯片平臺(tái)是GPL 9460(Applied Biosystems Human TaqMan Low Density Array，TLDA, v1.0)，該芯片數(shù)據(jù)包括8例AD患兒和8名健康兒童血清中miRNAs表達(dá)譜，本研究選擇全部的芯片信息來進(jìn)行下一步的分析。

1.2 數(shù)據(jù)歸一化及差異miRNA分析 用R語言軟件包對(duì)芯片表達(dá)矩陣進(jìn)一步預(yù)處理及差異miRNA分析。利用R 3.4.1軟件edgeR包運(yùn)用RMA 算法對(duì)下載數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正、標(biāo)準(zhǔn)化，即將測(cè)序數(shù)據(jù)歸一化。利用R gplots包繪制熱圖，計(jì)算差異表達(dá)miRNA的篩選符合以下條件：①P<0.05 ；②|logFC|≥2。結(jié)合文獻(xiàn)選取最具差異表達(dá)的miRNA-126進(jìn)行后續(xù)分析，并利用miRBase數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/)分析其序列及保守性。

1.3 靶基因的預(yù)測(cè) 利用mirTarbase數(shù)據(jù)庫(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)來預(yù)測(cè)miRNA-126靶基因，并統(tǒng)計(jì)相關(guān)靶基因總數(shù)。

1.4 靶基因的GO功能注釋及KEGG信號(hào)通路富集 利用cytoscape3.5.1及其插件ClueGO、CluePedia對(duì)靶基因進(jìn)行GO(gene ontology)功能注釋和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號(hào)通路富集。GO注釋功能富集主要有：生物學(xué)過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)。繪制KEGG網(wǎng)絡(luò)互作圖，以明確靶基因參與調(diào)控的信號(hào)通路之間的關(guān)系。對(duì)富集的GO注釋和KEGG信號(hào)通路注釋做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析通過計(jì)算差異P值，篩選出P<0.05差異的GO功能注釋和KEGG信號(hào)通路富集。

1.5 標(biāo)本采集 選取2017年5月至2018年5月期間我院收治的AD患兒與正常健康兒童各20名為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別采集清晨空腹外周血10 mL。本次研究均獲受試者知情并簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合AD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡小于18歲，性別不限，心、肝、腎功能良好，無其他嚴(yán)重疾病者；排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有其他皮膚疾病者、心腦血管疾病、酒精藥物濫用史、精神疾病史等。所采集的標(biāo)本2000 rpm離心取上清后均于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 試劑盒提取純化血清總RNA 使用miRNeasy Mini Kit試劑盒(QIAGEN，德國)提取標(biāo)本中miRNA，操作嚴(yán)格遵照試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行：將1mL RNA-Solv加入血清中，靜置3 min后加入200 μL氯仿冰中孵育10 min，4℃離心12000 g 15 min，將上清液加入一半體積乙醇，將硅膠柱套入集液管，吸取混合液700 μL加到HiBind RNA Mini column，離心10000 g 30～60 s，流出液放入新收集管中，加入0.9倍體積的乙醇，將MicroElute RNA column放入新收集管中，加入硅膠柱，離心10000 g 30～60 s，棄去濾液，把硅膠柱套回收集管中，加入500 μL RWB Wash Buffer，重復(fù)上述過程一次，最后用20 μL的DEPC水洗脫miRNA。將純化后的RNA于-80℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 熒光定量PCR檢測(cè)miRNA 采用HiScript? II Reverse Transcriptase試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)將提取出來的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為42℃ 3 min，60℃ 15 min，85℃ 5 min。以cDNA為模板，利用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為95℃ 2 min，1循環(huán)；60℃ 5 s，95℃ 10 s，40 個(gè)循環(huán)。以U6作為實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參基因，相對(duì)表達(dá)量以2-△△Ct形式表示，其中△CT=CT(miRNA)-CT(U6)。每孔共設(shè)副孔兩個(gè)，重復(fù)三次。miRNA-126上游引物序列：5’- ACACTCCAGCTGGGCATTATTACTTTTGG-3’，下游引物序列：5’- CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCGTACC-3’；U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 文中實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)在SPSS 20.0 軟件中統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)圖在Graghpad Prism 8軟件中繪制和編輯加工，采用獨(dú)立t檢驗(yàn)比較AD患兒和健康對(duì)照組間均數(shù)差異，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)形式表示,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)miRNAs篩選結(jié)果 通過對(duì)兩組數(shù)據(jù)的差異表達(dá)miRNAs的篩選，共獲得7個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，其中上調(diào)miRNAs 2個(gè)，下調(diào)miRNAs 5個(gè)。圖1是芯片間數(shù)據(jù)用RMA 法進(jìn)行校正后的箱圖。繪制兩組血清中miRNA的表達(dá)譜熱圖，見圖2。表1列出了AD患兒血清中對(duì)比正常兒童的差異表達(dá)的miRNAs。

圖1 芯片間數(shù)據(jù)進(jìn)行校正后的箱圖

圖2 芯片中兩組血清的miRNAs表達(dá)

圖3 miRNA-126序列及保守性

2.2 選取最具差異表達(dá)的miRNA并預(yù)測(cè)其靶基因 根據(jù)logFC值和P值并結(jié)合文獻(xiàn)選取最具差異表達(dá)的miRNA-126進(jìn)行后續(xù)生信學(xué)分析，并利用miRBase數(shù)據(jù)庫分析其序列及保守性，序列為5’端 CAUUAUUACUUUUGGUACGCG 3’端，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的保守性低于序列，詳見圖3。利用mirTarbase數(shù)據(jù)庫對(duì)miRNA-126的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見表2。

為了檢驗(yàn)miRNA-126是否在實(shí)際中具有差異表達(dá)，我們篩選了本院收治的AD患兒與正常健康兒童各20例，其中AD組年齡為(16.18±9.57)歲，男/女比例為1.86；對(duì)照組年齡為(14.63±7.09)歲，男/女比例為1.22。采用q-PCR法檢測(cè)兩組血清中miRNA-126的表達(dá)水平。相對(duì)于對(duì)照組，AD組miRNA-126的表達(dá)水平顯著降低(1.0±0.30 vs 0.46±0.19)，兩組間有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，如圖4。

表2 利用mirTarbase數(shù)據(jù)庫分析miRNA-126靶基因(前12項(xiàng))

2.3 GO功能注釋結(jié)果 針對(duì)以上預(yù)測(cè)的靶基因，然后我們進(jìn)行GO注釋和KEGG通路富集分析。通過GO注釋描述共得到11個(gè)分子功能注釋信息、28個(gè)生物學(xué)過程注釋信息，細(xì)胞組分注釋信息缺如。分析顯示miRNA-126預(yù)測(cè)靶基因集合富集在血管通透性的調(diào)節(jié)、RAC蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)皮細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)、基質(zhì)黏附依賴性細(xì)胞擴(kuò)散、活化MAPKK活性、磷蛋白結(jié)合等生物學(xué)過程和分子功能中(P<0.05)，見表3、表4。

2.4 KEGG 信號(hào)通路富集結(jié)果 在GO注釋分類的基礎(chǔ)上，利用已有生物通路數(shù)據(jù)，對(duì)基因集合中的12個(gè)基因進(jìn)行生物通路富集分析。結(jié)果顯示，在經(jīng)典通路數(shù)據(jù)庫KEGG中miRNA-126顯著富集于FoxO信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路等17個(gè)通路(P<0.05)，見圖5。

表3 miRNA-126靶基因進(jìn)行GO功能富集(生物學(xué)過程)

注：表中所列基因于GO功能富集中P<0.001

表4 miRNA-126靶基因進(jìn)行GO功能富集(分子功能)

注：表中所列基因于GO功能富集中P<0.001

圖4 兩組血清中miRNA-126的表達(dá)水平

圖中紅色字體代表靶基因，綠色及灰色字體代表靶基因參與的信號(hào)通路，圓形大小代表其權(quán)重，圓形直徑越大，說明靶基因參與該信號(hào)通路越多

圖5KEGG信號(hào)通路富集結(jié)果

3 討論

特應(yīng)性皮炎是迄今為止最常見的小兒過敏類皮膚病之一，具有一定的遺傳易感性[7]，目前其發(fā)病機(jī)制尚未清楚，涉及多個(gè)基因位點(diǎn)和多條信號(hào)通路。為明確AD的發(fā)病機(jī)制，我們應(yīng)深入探索AD發(fā)生發(fā)展中調(diào)控的基因及其背后的分子機(jī)制，為找出新的藥物治療靶點(diǎn)提供一定的理論依據(jù)。近年來，世界上開展的人類基因組計(jì)劃令高通量基因芯片技術(shù)廣泛應(yīng)用于疾病的miRNAs表達(dá)譜分析、基因克隆和尋找疾病特異分子標(biāo)志物等[8，9]。為深入了解AD發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，我們篩選了可作為AD診斷的關(guān)鍵miRNA并預(yù)測(cè)其靶基因，本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫下載的AD患兒血清和正常兒童血清中的生物芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異miRNAs分析、靶基因預(yù)測(cè)、功能聚類及信號(hào)通路富集，并利用q-PCR進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

經(jīng)過AD患兒血清和正常兒童血清中miRNAs的差異比較，共篩選出7個(gè)差異表達(dá)miRNAs，其中上調(diào)miRNAs 2個(gè)：hsa-miR-590-5p、hsa-miR-106b；下調(diào)miRNAs 5個(gè)：hsa-let-7g、hsa-miR-126、hsa-miR-491-5p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-146a。研究顯示，上調(diào)miRNA-590-5p可能以TGFβ1為靶點(diǎn)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡和自噬，從而促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制[10]；miRNA-106b參與多種細(xì)胞因子的分泌，如IL-10、IL-17、IL-23，可以干擾白塞病患兒外周血中Th17/Treg的平衡[11]；基于二代測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)let-7g參與調(diào)控肌萎縮側(cè)索硬化的發(fā)生發(fā)展，與其他的miRNAs、基因形成一個(gè)復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制[12]；在CD8+T細(xì)胞中，miRNA-491直接靶向細(xì)胞周期蛋白依賴激酶4、轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子1，同時(shí)，TGF-β在CD8+T細(xì)胞中誘導(dǎo)了miRNA-491的表達(dá)，說明miRNA-491可以作為T淋巴細(xì)胞，特別是CD8+T細(xì)胞的負(fù)調(diào)節(jié)因子[13]；軟骨細(xì)胞mTORC1可以激活miRNA-483通過靶向HDAC4基因調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展[14]；miRNA-146a在關(guān)節(jié)炎患者組織中過表達(dá)，且參與關(guān)節(jié)炎的炎癥形成[15]。綜合以上，說明這些表達(dá)差異的miRNAs在各種免疫、炎癥性疾病中均有異常表達(dá)，并通過各種機(jī)制調(diào)控該類疾病的發(fā)生發(fā)展。

在差異表達(dá)的miRNAs，我們結(jié)合既往文獻(xiàn)選取了最具表達(dá)差異的miRNA-126進(jìn)行下一步生信學(xué)分析。近年來，miRNA-126作為一個(gè)熱門非編碼RNA一直以來被廣泛的研究。我們通過生信學(xué)數(shù)據(jù)庫對(duì)miRNA-126進(jìn)行了序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)及保守性的分析，發(fā)現(xiàn)miRNA-126具有標(biāo)志性的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，經(jīng)典的莖環(huán)結(jié)構(gòu)且序列均處于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的臂上，莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的堿基保守性略低。很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)miRNA-126參與多種免疫性炎癥性疾病的分子調(diào)控機(jī)制。最新研究顯示[16]，在皮膚傷口愈合過程中，miRNA-126表達(dá)上調(diào)。miRNA-126的過度表達(dá)通過靶向抑制PLK2基因參與促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)的增殖和遷移。miRNA-126的過表達(dá)還激活了PI3 K/AKT信號(hào)通路。作為表皮中的重要組成細(xì)胞，KC在AD患者的經(jīng)皮致敏中扮演著非常重要的角色。所以基于既往文獻(xiàn)及芯片數(shù)據(jù)，我們?cè)诤Y選出的miRNA中選取miRNA-126來進(jìn)行后續(xù)分析。此外，我們收集了我院AD患兒和健康兒童各20例，利用q-PCR方法檢測(cè)兩組人外周血血清中miRNA-126的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，AD組中miRNA-126的表達(dá)顯著下調(diào)，與生信學(xué)分析結(jié)果吻合。

我們利用生信學(xué)數(shù)據(jù)庫對(duì)miRNA-126的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示共有110個(gè)基因，然后利用生信學(xué)軟件對(duì)這些基因進(jìn)行GO功能注釋及KEGG信號(hào)通路富集分析。通過GO注釋描述共得到11個(gè)分子功能注釋信息、28個(gè)生物學(xué)過程注釋信息。分析顯示靶基因主要富集在血管通透性的調(diào)節(jié)、RAC蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)皮細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)、基質(zhì)黏附依賴性細(xì)胞擴(kuò)散、活化MAPKK、磷蛋白結(jié)合等生物學(xué)過程和分子功能中。這些均與免疫與炎癥的調(diào)節(jié)具有一定的關(guān)聯(lián)性。

在GO注釋分類的基礎(chǔ)上，利用已有生物通路數(shù)據(jù)，對(duì)基因集合中的12個(gè)基因進(jìn)行生物通路富集分析。結(jié)果顯示基因顯著富集于FoxO信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路等17個(gè)通路。Kumagai等[17]KC通過NF-κB信號(hào)通路可以激活增加TSLP的釋放，從而影響AD的發(fā)生發(fā)展。最近有文獻(xiàn)顯示[18]，通過阻斷小鼠NF-kB信號(hào)通路可以下調(diào)Th2的比例，說明AD可以激活NF-κB信號(hào)通路。我們從分析結(jié)果中可以看出，miRNA-126靶向基因VCAM1、CXCL12、BCL2、NFKBIA參與NF-κB信號(hào)通路，由于miRNA-126抑制靶基因的表達(dá)，所以AD患兒血清中下調(diào)miRNA-126的表達(dá)會(huì)解除對(duì)這些靶基因的抑制作用，從而激活NF-κB信號(hào)通路。圖5結(jié)果顯示，NF-κB信號(hào)通路在靶基因參與調(diào)控的所有信號(hào)通路所占權(quán)重最大，以上生信學(xué)分析結(jié)果與既往文獻(xiàn)的結(jié)論相一致，說明NF-κB信號(hào)通路在AD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。

綜合以上所述，本文采用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)AD患兒miRNAs芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行深度挖掘和有效驗(yàn)證，從整體和微觀的角度對(duì)AD相關(guān)miRNA及其調(diào)控基因、分子功能和生物學(xué)過程進(jìn)行分析，以期在AD發(fā)生的機(jī)制研究、分子標(biāo)志物的篩選及藥物靶點(diǎn)選擇奠定理論基礎(chǔ)。