冷靜　田華捷　黃甫　馮琴　趙瑜　胡義揚(yáng)　彭景華

摘要?目的：觀察中藥組分復(fù)方BZL方（白術(shù)多糖、梔子苷、綠原酸）對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠脂肪性肝炎（NASH）及其腸黏膜損傷的作用。方法：C57BL/6J雄性小鼠27只，隨機(jī)分為正常、模型和BZL方組，每組9只。除正常組外，其余各組均采用高脂飲食誘導(dǎo)NASH，第14周開(kāi)始，BZL方組灌胃BZL方，其余各組灌胃等量飲用水，至17周末處死取材。觀察各組小鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量、肝體比，肝組織病理（HE和天狼猩紅染色，SAF評(píng)分），檢測(cè)血漿ALT、GGT活性、LPS水平，肝組織TG含量;肝組織膠原I型和IV型、內(nèi)毒素受體CD14、TLR1、TLR2、TLR4、TLR9及炎性反應(yīng)因子IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)（real-time PCR法）;腸組織病理（HE染色）;大腸組織緊密連接zo-1、occludin、claudin mRNA表達(dá)（real-time PCR法）及蛋白表達(dá)（免疫熒光染色）。結(jié)果：高脂飲食誘導(dǎo)NASH模型中，模型組血漿ALT、GGT、LPS及肝組織TG含量較正常組顯著升高（P<0.01）;肝組織可見(jiàn)脂肪沉積、炎性反應(yīng)、氣球樣變及纖維化，SAF評(píng)分顯著高于正常組，肝組織膠原ColI、ColIV mRNA顯著升高，CD14、TLR1、TLR2、TLR4、TLR9及IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)升高（P<0.05，P<0.01）;腸組織病理變化光鏡下不明顯，大腸組織緊密連接zo-1、occludin、claudin mRNA表達(dá)降低（P<0.01），zo-1、occludin免疫熒光陽(yáng)性染色減少。BZL方可降低血漿ALT、GGT、LPS、肝組織TG含量（P<0.05，P<0.01），改善SAF評(píng)分，降低肝組織膠原ColI、ColIV mRNA表達(dá)（P<0.01），降低CD14、TLR2、TLR4、TLR9及IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)（P<0.05，P<0.01），恢復(fù)大腸組織緊密連接zo-1、occludin mRNA表達(dá)（P<0.01），恢復(fù)zo-1、occludin免疫熒光陽(yáng)性染色。結(jié)論：BZL方有效減輕高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠NASH，該作用與其保護(hù)腸黏膜、抑制LPS腸滲漏及肝組織中TLRs及炎性反應(yīng)因子密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞?非酒精性脂肪性肝炎;中藥組分復(fù)方;天然產(chǎn)物;白術(shù)多糖;梔子苷;綠原酸;腸黏膜屏障;緊密連接

Protective Effects of BZL Recipe on Intestinal Mucosal Injury in Non-alcoholic Steatohepatitis in Mice

Leng Jing1，Tian Huajie1，Huang Fu1，F(xiàn)eng Qin1，Zhao Yu1，Hu Yiyang2，3，Peng Jinghua1，2，3

（1 Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China; 2 Institute of Liver Diseases，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China; 3 Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine，Shanghai 201203，China; 4 Institute of Clinical Pharmacology，Shanghai 201203，China）

Abstract?Objective：To observe the effects of Chinese Medicine BZL recipe（composed of Atractylodes macrocephala polysaccharide，chlorogenic acid，and geniposide）on non-alcoholic steatohepatitis（NASH）and intestinal mucosal injury induced by high-fat diet in mice. Methods：Twenty seven male C57BL/6J mice were randomly divided into the normal group，the model group，and BZL group，with 9 rats in each group. Except the normal group，the other groups were induced by NASH. From the 14th week，mice in BZL group were administrated with BZL recipe by gavage daily，and the other mice were administrated with same dose distilled water. Till the end of 17th week，the mice were killed for collection materials. The body weight，food intake，liver-to-body ratio，liver histopathology（HE and Sirius red staining，SAF score）were observed in each group. Plasma ALT，GGT activity，LPS level，liver tissue TG content，liver tissue collagen type I and type IV，endotoxin receptor CD14，TLR1，TLR2，TLR4，TLR9 and inflammatory factors IL-1β，TNF-α mRNA expression（real-time PCR），intestinal histopathology（HE staining），large intestine tissue tight junction zo-1，occludin，claudin mRNA expression（real-time PCR）and protein expression（immunofluorescence staining）were detected.Results：In the high-fat diet induced NASH model，plasma ALT，GGT，LPS and liver tissue TG levels in the model group were significantly higher than those in the normal group（P<0.01）; liver tissue showed fat deposition，inflammation，balloon-like changes and fibrosis. SAF score was significantly higher than the normal group. Liver tissue collagen ColI，ColIV mRNA increased significantly，and CD14，TLR1，TLR2，TLR4，TLR9 and IL-1β，TNF-α mRNA expression increased（P<0.05，P<0.01）; The pathological changes of intestinal tissue were not obvious under light microscope. The expression of zo-1，occludin and claudin mRNA in the large intestine was decreased（P<0.01），and the immunofluorescence staining of zo-1 and occludin was decreased. BZL recipe can reduce plasma ALT，GGT，LPS，liver tissue TG content（P<0.05，P<0.01），improve SAF score，reduce liver tissue collagen ColI，ColIV mRNA expression（P<0.01），reduce CD14，TLR2，TLR4，TLR9，IL-1β and TNF-α mRNA expression（P<0.05，P<0.01），restored the expression of zo-1 and occludin mRNA in the large intestine，and restored the immunofluorescence staining of zo-1 and occludin. Conclusion：BZL recipe can effectively alleviate NASH induced by high-fat diet，which is closely related to the protection of intestinal mucosa，inhibition of LPS intestinal leakage and TLRs and inflammatory factors in liver tissue.

Key Words?Non-alcoholic steatohepatitis; Chinese medicine components combination; Natural products; Atractylodes macrocephala polysaccharide; Geniposide; Chlorogenic acid; Intestinal mucosa barrier; Tight junction

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.03.014

非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷，疾病譜包括非酒精性肝脂肪變（Non-alcoholic Fatty Liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（Non-alcoholic Steatohepatitis，NASH）、肝硬化和肝細(xì)胞癌[1]。NAFLD是全球最常見(jiàn)的慢性肝病之一，普通成人NAFLD患病率在6.3%～45%，其中10%～30%為NASH[2]。與NAFL比較，NASH患者不良結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)高，若不積極防治，易進(jìn)展為肝硬化、肝功能衰竭和肝細(xì)胞癌，心血管疾病和惡性腫瘤的發(fā)生率也隨之增加[3-5]。新進(jìn)的研究發(fā)現(xiàn)“腸道因素”在NAFLD發(fā)病過(guò)程中起到了重要作用，如腸黏膜屏障損傷可使肝臟直接暴露于腸道內(nèi)的抗原物質(zhì)（如腸道細(xì)菌、腸源性內(nèi)毒素），導(dǎo)致肝臟一系列的免疫反應(yīng)[6]，引發(fā)或加重NASH。

BZL方來(lái)源于本課題組總結(jié)的臨床治療NAFLD經(jīng)驗(yàn)方——祛濕化瘀方。前期研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠腸黏膜損傷，祛濕化瘀方改善NASH同時(shí)對(duì)腸黏膜屏障具有保護(hù)作用[7]。進(jìn)而對(duì)祛濕化瘀方各味中藥的代表性有效成分（綠原酸、虎杖苷、白術(shù)多糖、梔子苷和姜黃素）以不同劑量、肝組織三酰甘油（Triglyceride，TG）為參數(shù)，進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)篩選，得到的回歸方程提示，白術(shù)多糖266.67 mg/kg、綠原酸3.33 mg/kg、梔子苷45 mg/kg所構(gòu)成的組分復(fù)方降低肝組織TG的作用最明顯，并命名為“BZL”方[8-9]。已證實(shí)BZL方能夠有效減輕高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠NAFLD[10]，本研究擬通過(guò)觀察BZL方對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠NASH腸黏膜損傷的作用，進(jìn)一步揭示其防治NASH的作用機(jī)制。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動(dòng)物?SPF級(jí)C57BL/6J健康雄性小鼠27只，8周齡，體質(zhì)量23～28 g，購(gòu)自北京聯(lián)合利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度20～25 ℃，濕度60%～70%，燈照周期12 h（7：00-19：00燈照，19：00-7：00黑暗）。獲得上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：SZY201610010。

1.1.2?藥物?BZL方由白術(shù)多糖（純度85%，批號(hào)ZL20170129，南京澤朗醫(yī)藥有限公司），梔子苷（純度98%，批號(hào)170106，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司）與綠原酸（純度98%，批號(hào)161227，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司）組成。

1.1.3?主要儀器?M5多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices）;Aperio AT Turbo數(shù)字化病理掃片機(jī)（德國(guó)Lecia）;T100 PCR儀（美國(guó)Bio-Rad）;Applied Biosystems ViiA7 PCR儀（美國(guó)Thermo Fisher）;FV10I激光共聚焦顯微鏡（日本OLYMPUS）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備?C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常（n=9）、模型（n=9）和BZL方組（n=9）。正常組予10%脂肪熱能對(duì)照飼料（貨號(hào)D12450B，美國(guó)Research Diet公司），模型組與BZL方組予60%脂肪熱能高脂飼料（貨號(hào)D12492，美國(guó)Research Diet公司），自由進(jìn)食17周。

1.2.2?給藥方法?造模第14周開(kāi)始進(jìn)行藥物干預(yù)。BZL方組小鼠予配制好的BZL方（白術(shù)多糖266.67 mg/（kg·d）、綠原酸3.33 mg/（kg·d）、梔子苷45 mg/（kg·d））灌胃，正常組和模型組予等體積滅菌飲用水灌胃，至17周末。取腹腔靜脈血液于EDTA抗凝管中，4 ℃，500 g/min，離心15 min，分離血漿;各取兩份約1 cm×1 cm肝組織、約1 cm長(zhǎng)度大小腸組織分別放入中性福爾馬林及OCT包埋膠中固定，余下組織放入2 mL離心管液氮保存后，轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱凍存，待測(cè)。

1.2.3?檢測(cè)指標(biāo)與方法

1）血漿丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）檢測(cè)?生化試劑盒檢測(cè)（賴氏法），試劑盒購(gòu)自南京建成生物研究所，按說(shuō)明書(shū)操作。

2）肝組織三酰甘油TG檢測(cè)?稱取肝組織100 mg，放入無(wú)水乙醇和丙酮各750 μL液體中，65 Hz勻漿，90 s/次，3次。4 ℃靜置過(guò)夜。4 ℃，3 000 r/min離心15 min，取上清液用于TG測(cè)定。TG試劑盒購(gòu)于浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司，按說(shuō)明書(shū)操作。

3）組織病理?肝臟與腸組織（小腸和大腸）采用HE染色觀察，肝組織膠原纖維采用天狼猩紅染色觀察。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組的推薦意見(jiàn)[1]，肝組織病理采用SAF積分[11]評(píng)定，評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。見(jiàn)表1。其中，NASH的定義為5%以上的肝細(xì)胞脂肪變合并小葉內(nèi)炎性反應(yīng)和肝細(xì)胞氣球樣變性，不合并肝纖維化或僅有輕度纖維化（F0-1）為早期NASH;合并顯著肝纖維化或間隔纖維化（F2-3）為纖維化性NASH;合并肝硬化（F4）為NASH肝硬化[1]。

4）血漿內(nèi)毒素（Lipopolysaccharide，LPS）檢測(cè)?LPS試劑盒購(gòu)于Associates of CAPE COD Incorporated，鱟試劑法，按說(shuō)明書(shū)操作。

5）肝臟與大腸組織mRNA表達(dá)real-time PCR檢測(cè)?總RNA提取、cDNA合成及real-time PCR均采用試劑盒（總RNA提取試劑盒，貨號(hào)B511321，生工生物工程上海有限公司;cDNA合成試劑盒，貨號(hào)1708891，Bio-Rad公司;real-time PCR試劑盒，貨號(hào)RR420A，TaKaRa公司）按照說(shuō)明書(shū)操作。所用引物由生工生物工程上海有限公司合成，引物序列。見(jiàn)表2。

6）大腸組織蛋白表達(dá)?采用免疫熒光染色觀察OCT膠包埋組織切片，厚度8 μm，浸入4 ℃丙酮15 min后PBS清洗，浸入0.2% TritonTMX-100透膜后4 ℃雙蒸水清洗，10%山羊血清室溫封閉40 min，4 ℃孵育一抗過(guò)夜，隔日取出后4 ℃ PBS清洗，37 ℃避光孵育二抗30 min，4 ℃ PBS清洗后DAPI染核，抗熒光淬滅劑封片鏡檢。所用抗體見(jiàn)表3。

1.3?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，方差齊性用最小顯著差法（Least Significant Difference，LSD）作兩兩比較，方差齊，符合正態(tài)分布的用單因素方差分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。方差不齊或者不符合正態(tài)分布的用非參數(shù)檢驗(yàn)，非參數(shù)檢驗(yàn)用中位數(shù)（四分位間距）表示，即median（Q3-Q1），以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?實(shí)驗(yàn)小鼠一般情況

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中小鼠狀態(tài)良好。造模小鼠體質(zhì)量較對(duì)照小鼠增長(zhǎng)迅速，17周末實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型組小鼠體質(zhì)量顯著高于正常組（P<0.01），BZL方干預(yù)后小鼠體質(zhì)量較模型組降低（P<0.05）。每只小鼠平均每周進(jìn)食量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組小鼠肝體比較正常組升高（P<0.05），BZL方組較模型組顯著降低（P<0.01）。見(jiàn)表4。

2.2?BZL方對(duì)NASH小鼠肝損傷的作用

2.2.1?肝組織病理?肝組織HE染色可見(jiàn)正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊。模型組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)脂肪空泡，伴有肝細(xì)胞氣球樣變，部分匯管區(qū)、小葉內(nèi)可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。BZL方組小鼠肝細(xì)胞脂肪變性及氣球樣變改變明顯減輕，偶見(jiàn)炎細(xì)胞。天狼猩紅染色可見(jiàn)正常組小鼠肝組織內(nèi)僅在血管壁、匯管區(qū)有少量膠原纖維存在;模型組小鼠肝小葉匯管區(qū)可見(jiàn)膠原纖維增粗?jǐn)U張，竇周可見(jiàn)少量膠原纖維增生;BZL方組肝小葉膠原增生較模型組不明顯。SAF積分提示模型組小鼠肝組織脂肪變、活動(dòng)度積分均較正常組明顯升高（P<0.01），證實(shí)存在肝細(xì)胞脂肪變，合并氣球樣變和小葉內(nèi)炎性反應(yīng)，符合NASH的診斷。同時(shí)纖維化積分較正常組顯著增高（P<0.01），根據(jù)指南關(guān)于NASH的定義提示為纖維化性NASH（F2）。BZL方組小鼠肝組織脂肪變與活動(dòng)度積分均較模型組明顯減輕（P<0.01），纖維化程度較模型組減輕（P<0.05），符合早期NASH（F1）的診斷。見(jiàn)圖1、表5。

2.2.2?血漿ALT、GGT活性及肝組織TG含量?與正常組比較，模型組小鼠血漿ALT、GGT活性均明顯升高（P<0.01）;BZL方組小鼠的血漿ALT、GGT活性較模型組降低（P<0.05）。模型組肝組織TG含量顯著高于正常組（P<0.01），BZL方組肝組織TG含量較模型組顯著降低（P<0.01）。見(jiàn)表6。

2.2.3?肝組織I型和IV型膠原mRNA表達(dá)?與正常組比較，模型組小鼠肝組織ColI及ColIV mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.01），BZL方組較模型組顯著下降（P<0.01）。見(jiàn)表7。

2.3?BZL方對(duì)NASH小鼠肝組織內(nèi)毒素受體及炎性反應(yīng)因子mRNA表達(dá)的作用

與正常組比較，模型組小鼠肝組織內(nèi)毒素受體CD14、TLR9 mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.01），TLR1、TLR2、TLR4 mRNA升高（P<0.05）。BZL方組肝組織CD14、TLR4、TLR9 mRNA表達(dá)較模型組顯著降低（P<0.01），同時(shí)TLR2 mRNA表達(dá)較模型組也降低（P<0.05）。與正常組比較，模型組肝組織炎性反應(yīng)因子IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)較正常組升高（P<0.05），BZL方組較模型組降低（P<0.01，P<0.05）。見(jiàn)表8。

2.4?BZL方對(duì)血漿內(nèi)毒素LPS的影響

模型組小鼠血漿LPS含量高于正常組（P<0.05）。BZL方組小鼠血漿LPS含量較模型組降低（P<0.05）。見(jiàn)表9。

2.5?BZL方對(duì)NASH小鼠腸黏膜損傷的作用

2.5.1?腸組織HE染色?各組小鼠小腸和大腸組織HE染色未見(jiàn)明顯病理改變。見(jiàn)圖2。

2.5.2?大腸組織緊密連接mRNA表達(dá)?與正常組比較，模型組小鼠大腸組織zo-1、occludin、claudin mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.01），BZL方組小鼠大腸組織zo-1、occludin mRNA表達(dá)較模型組顯著升高（P<0.01），claudin mRNA表達(dá)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表10。

2.5.3?大腸組織緊密連接蛋白表達(dá)?免疫熒光染色觀察發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠大腸組織緊密連接蛋白zo-1、occludin陽(yáng)性染色較正常組弱、不連續(xù)，BZL方組小鼠大腸組織緊密連接蛋白zo-1、occludin陽(yáng)性染色較模型組更強(qiáng)。緊密連接蛋白claudin陽(yáng)性染色各組間未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖3。

3?討論

NASH引起的肝硬化已經(jīng)越來(lái)越多的成為肝移植的一種常見(jiàn)適應(yīng)證，這與NASH伴隨的肝纖維化密切相關(guān)。肝纖維化可以獨(dú)立于其他因素預(yù)測(cè)NAFLD的預(yù)后[12]，一項(xiàng)NAFLD患者的縱向研究中也證實(shí)，NASH中患者中，與長(zhǎng)期總體死亡率及肝移植相關(guān)的是纖維化，而不是其他組織學(xué)特征[13]。此外，如果一個(gè)NASH患者不伴有纖維化，未來(lái)10～20年內(nèi)發(fā)生死亡或肝相關(guān)并發(fā)癥（如腹水，靜脈曲張，肝性腦?。┑目赡苄暂^低[4]，故NASH防治中需重視組織學(xué)中纖維化的評(píng)估。SAF積分系統(tǒng)引入了“纖維化”這一組分，被新近更新的諸多指南推薦用于NASH肝組織病理學(xué)的評(píng)判，且更優(yōu)于NAS評(píng)分系統(tǒng)[1]。該積分一方面將肝纖維化程度單獨(dú)評(píng)估可以更加精確評(píng)估預(yù)后;另一方面，將NAS評(píng)分中的小葉炎性反應(yīng)與氣球樣合并，為疾病活動(dòng)度評(píng)價(jià)提供了更大空間[14]。

本研究再次驗(yàn)證了BZL方對(duì)于高脂飲食誘導(dǎo)的NASH的藥效。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，高脂飲食17周，小鼠肝小葉已能觀察到匯管區(qū)膠原纖維的擴(kuò)張及竇周纖維組織沉積較正常組小鼠增加，膠原組織mRNA檢測(cè)結(jié)果也與之相符，SAF積分提示處于NASH合病纖維化（F2）。BZL方干預(yù)后，肝組織NASH病變明顯減輕，膠原沉積也有所減輕。

腸道與肝臟在解剖上通過(guò)門(mén)靜脈相連。完整的腸黏膜屏障可以阻止腸源性抗原物質(zhì)（如細(xì)菌及其產(chǎn)物）進(jìn)入血循環(huán)。緊密連接位于腸上皮的頂端，由相鄰腸細(xì)胞的連接蛋白zo-1，occludin，claudin等組成，是腸黏膜屏障的最重要組成部分。完整的緊密連接既可以有選擇性的允許營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸，又可以防止腸腔內(nèi)有害物質(zhì)進(jìn)入循環(huán)[15]。研究[16-19]顯示，NAFLD患者和動(dòng)物模型中均存在腸黏膜損傷，在NAFLD小鼠中加重腸黏膜損傷，則其肝組織損傷（NASH、肝纖維化）可進(jìn)一步加重。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，高脂飲食16周即可誘導(dǎo)NASH小鼠合病腸黏膜損傷[7]，在本研究中雖然在NASH小鼠腸組織HE染色中未觀察到明顯的病理變化，但血漿LPS水平上升。LPS來(lái)源于腸道中的革蘭氏陰性菌，腸源性LPS可透過(guò)損傷的腸黏膜屏障進(jìn)入血循環(huán)。進(jìn)一步觀察到NASH小鼠腸組織緊密連接蛋白表達(dá)較正常組明顯下調(diào)，上述改變均提示了腸黏膜損傷。BZL方作用后，血漿LPS水平下降，大腸組織緊密連接zo-1，occludin表達(dá)均較模型組有所恢復(fù)，提示BZL方對(duì)NASH小鼠腸黏膜屏障具有保護(hù)作用。

Toll樣受體家族是NASH中最主要的識(shí)別腸源性細(xì)菌產(chǎn)物的受體家族[20-21]，其中，TLR4/CD14受體特異性識(shí)別革蘭氏陰性菌產(chǎn)物L(fēng)PS，TLR1與TLR2則介導(dǎo)宿主對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的應(yīng)答，TLR9可識(shí)別雙鏈細(xì)菌DNA[22]。特異性TLRs激活后，細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)生[23-24]，分泌參與炎性反應(yīng)和細(xì)胞死亡的生物活性細(xì)胞因子如IL-1β和TNF-α等進(jìn)一步加重肝損傷，并可能激活肝星狀細(xì)胞，進(jìn)而引發(fā)肝纖維化。本研究中，模型組小鼠肝組織TLRs受體及炎性反應(yīng)因子mRNA表達(dá)升高，部分提示了肝組織中腸源性細(xì)菌產(chǎn)物的暴露，BZL方對(duì)肝組織TLR2、TLR4、CD14、TLR9及IL-1β、TNF-αmRNA表達(dá)均有下調(diào)作用，提示BZL方可抑制腸源性細(xì)菌產(chǎn)物誘導(dǎo)的TLRs激活而產(chǎn)生炎性反應(yīng)因子，該作用與其抗NASH的藥理效應(yīng)密切相關(guān)。

目前針對(duì)NASH缺乏理想藥物。胰島素增敏劑吡格列酮雖對(duì)NASH患者生化學(xué)指標(biāo)和肝組織病變均有改善作用，但考慮長(zhǎng)期應(yīng)用的安全性，目前僅推薦用于NASH合并2型糖尿病患者的治療[25-26]。有研究發(fā)現(xiàn)維生素E 800 U/d口服2年可以使無(wú)糖尿病的NASH成人血清氨基酸轉(zhuǎn)移酶恢復(fù)正常，肝脂肪變和炎性反應(yīng)損傷得到改善[27]。然而長(zhǎng)期大劑量使用維生素E的安全性尚不明確[1]。奧貝膽酸顯著減輕NASH患者肝纖維化程度，但是該藥對(duì)脂代謝有不良影響，可導(dǎo)致皮膚瘙癢，且其有效性還需更多的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證[1]。中醫(yī)藥治療NAFLD有其特色，中藥復(fù)方多途徑、多靶點(diǎn)的藥理作用特性也與多臟器、多通路參與其中的NAFLD復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制相契合，中醫(yī)藥治療NAFLD的藥效和藥理機(jī)制值得深入的研究和挖掘。

BZL方為臨床治療NAFLD有效經(jīng)驗(yàn)方——祛濕化瘀方基礎(chǔ)上篩選得到的有效成分復(fù)方，組方相對(duì)簡(jiǎn)單，成分明確，藥理效應(yīng)得到驗(yàn)證。本研究證實(shí)BZL方對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠NASH模型具有良好的治療作用，該藥理效應(yīng)與其保護(hù)腸黏膜、抑制LPS腸滲漏及肝組織中腸源性細(xì)菌產(chǎn)物相應(yīng)受體和炎性反應(yīng)因子密切相關(guān)。

然而B(niǎo)ZL方是通過(guò)何種機(jī)理保護(hù)腸上皮細(xì)胞間緊密連接進(jìn)而保護(hù)腸黏膜屏障仍需深入研究。此外，白術(shù)多糖、梔子苷和綠原酸分別在其中起到何種作用及其相互之間的影響是今后深入研究的關(guān)鍵問(wèn)題，以期進(jìn)一步解析BZL方作用機(jī)制和配伍特點(diǎn)。

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