朱博文　黃煜　鄭晶　顏莉莉　林慧　張清宇

[摘要] 目的 探討阻斷趨化因子通路CXCL12/CXCR4、CXCR7及細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號通路，對人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用。方法 將子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞懸液與基質(zhì)膠按1∶1混合，調(diào)整細胞密度為7.5×1010/L，取200 μL注射于裸鼠右側(cè)背部肩胛皮下，制備子宮內(nèi)膜癌動物模型，建模成功后隨機分為AMD3100組、PD98059組、Anti-CXCR7組、AMD3100+Anti-CXCR7組和NaCl組（對照組），每組6只。各組裸鼠分別經(jīng)腹腔給予相應(yīng)藥物，每3 d給藥1次，共3周。觀察荷瘤裸鼠的狀態(tài)及移植瘤的生長情況，繪制腫瘤生長曲線，計算抑瘤率;應(yīng)用RT-PCR方法檢測各組瘤體組織中凋亡抑制基因Survivin mRNA的表達。結(jié)果 治療周期結(jié)束后，AMD3100組、PD98059組、Anti-CXCR7組、AMD3100+Anti-CXCR7組腫瘤體積及質(zhì)量均低于對照組，抑瘤率明顯高于對照組，瘤體組織Survivin mRNA的表達低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=11.35～72.27，P<0.01）;AMD3100組、PD98059組、Anti-CXCR7組、AMD3100+Anti-CXCR7組腫瘤體積、質(zhì)量、抑瘤率及瘤體組織Survivin mRNA的表達比較差異均無顯著性（P>0.05）。結(jié)論 阻斷CXCL12的特異性受體CXCR4、CXCR7以及細胞內(nèi)ERK信號通路，能夠抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞裸鼠移植瘤的生長，其機制可能與瘤體組織凋亡抑制基因Survivin的下調(diào)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 受體，CXCR4;趨化因子CXCL12;CXCR7;細胞外信號調(diào)節(jié)MAP激酶類;子宮內(nèi)膜癌

[中圖分類號] R737.33 ?[文獻標(biāo)志碼] A ?[文章編號] ?2096-5532（2019）04-0442-05

[ABSTRACT] Objective To investigate the inhibitory effects of blocking the chemokine pathways CXCL12/CXCR4 and CXCR7 and extracellular regulated protein kinase （ERK） signaling pathway on subcutaneous xenografts of human endometrial carcinoma Ishikawa cells in nude mice. ?Methods Endometrial carcinoma Ishikawa cell suspension was mixed with Matrigel at a ratio of 1∶1， and the cell density was adjusted to 7.5×1010/L; 200 μL of the mixture was subcutaneously injected into the right back scapula of nude mice to establish an animal model of endometrial carcinoma. After successful modeling， the animals were randomly divided into AMD3100 group， PD98059 group， anti-CXCR7 group， AMD3100+anti-CXCR7 group， and NaCl group （control group）， with 6 animals in each group. Each group was administered intraperitoneally the corresponding drug， once every 3 d for 3 weeks. The status of tumor-bearing nude mice and the growth of transplanted tumor were observed. The tumor growth curve was plotted， and the tumor inhibition rate was calculated. The mRNA expression of apoptosis-inhibiting gene survivin in tumor tissues of each group was measured by RT-PCR. ?Results At the end of treatment cycle， the AMD3100 group， PD98059 group， anti-CXCR7 group， and AMD3100+anti-CXCR7 group had significantly lower tumor volume and weight， a significantly higher tumor inhibition rate， and significantly lower expression of Survivin mRNA in tumor tissues than the control group （F=11.35-72.27，P<0.01）. There was no significant difference in tumor volume and weight， tumor inhibition rate， and Survivin mRNA expression in tumor tissues between the AMD3100 group， the PD98059 group， the anti-CXR7 group， and the AMD3100+anti-CXCR7 group （P>0.05）. ?Conclusion Blocking CXCL12 specific receptors CXCR4 and CXCR7 and intracellular ERK signaling pathway can inhibit the growth of xenografts of endometrial carcinoma Ishikawa cells in nude mice， which may be related to the down-regulation of apoptosis-inhibiting gene Survivin in tumor tissues.

[KEY WORDS] receptors， CXCR4; chemokine CXCL12; CXCR7; extracellular signal-regulated MAP kinases; endometrial neoplasms

子宮內(nèi)膜癌（EC）是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在某些發(fā)達國家其發(fā)病呈年輕化的趨勢[1-2]。在中國EC的發(fā)病率近年來也呈現(xiàn)出上升趨勢[3]。由于其發(fā)病機制尚未明確，對于臨床晚期病人特別是復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移者，目前的治療手段仍較為局限。近年來，EC發(fā)生中腫瘤細胞內(nèi)信號通路的異常受到學(xué)者們廣泛關(guān)注[4-6]。多數(shù)研究證實，趨化因子CXCL12及其受體CXCR4、CXCR7在多數(shù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，尤其是其在EC生物學(xué)行為中的作用及其機制成為目前研究的熱點[7]。已有研究證實，特異性小分子抑制劑靶向干預(yù)腫瘤細胞內(nèi)信號通路，能夠抑制EC細胞的增殖[8-9]。體外研究顯示，趨化因子通路CXCL12/CXCR4、CXCR7在EC細胞生物學(xué)行為中發(fā)揮正向調(diào)控的重要作用，且CXCL12/CXCR4生物軸通過激活ERK通路上調(diào)Survivin蛋白表達，從而引發(fā)Ishikawa細胞一系列增殖和侵襲效應(yīng)，而應(yīng)用小干擾RNA靶向沉默CXCR4、CXCR7的表達后，Ishikawa細胞的增殖及侵襲能力均降低，并且在細胞周期中出現(xiàn)S期阻滯[10-12]。體內(nèi)實驗將化學(xué)合成的CXCR4-siRNA和（或）CXCR7-siRNA局部注射于荷瘤裸鼠瘤體內(nèi)，結(jié)果顯示靶向沉默CXCR4及CXCR7的表達后，體內(nèi)腫瘤細胞的增殖能力明顯受限[13]。本研究擬建立EC裸鼠移植瘤動物模型，模擬腫瘤在體內(nèi)生長的微環(huán)境，將CXCR4特異性拮抗劑AMD3100（商品名普樂沙福）、ERK信號通路阻斷劑PD98059、CXCR7中和抗體Anti-CXCR7經(jīng)腹腔注射于荷瘤裸鼠體內(nèi)，觀察移植瘤的生長情況并檢測瘤體組織內(nèi)凋亡抑制基因Survivin的表達，探討AMD3100、PD98059、Anti-CXCR7對EC裸鼠皮下移植瘤生長的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 細胞及實驗動物來源

EC Ishikawa細胞由青島大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室提供。SPF級雌性BALB/c裸鼠30只，4～5周齡，體質(zhì)量14～18 g（購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），飼養(yǎng)于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部SPF級動物中心，適應(yīng)1周后用于實驗。

1.2 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國），胎牛血清（PAN，德國），青鏈霉素混合液、2.5 g/L胰蛋白酶消化液（北京索萊寶，中國），Matrigel基質(zhì)膠（B&D，美國）;AMD3100、PD98059（MCE公司，美國），Anti-CXCR7（Abcam，英國），TRIzol（Invitrogen，美國），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa，日本）。Survivin和GAPDH PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 Ishikawa細胞培養(yǎng) 將Ishikawa細胞培養(yǎng)于含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清、10 g/L青鏈霉素混合液的DMEM完全培養(yǎng)基中，于恒溫37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底75%～85%時，使用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

1.3.2 動物模型建立及分組 離心收集Ishikawa細胞后PBS重懸，將細胞懸液與Matrigel基質(zhì)膠1∶1混勻調(diào)整細胞密度為7.5×1010/L。裸鼠置于超凈工作臺內(nèi)，消毒皮膚后，將細胞懸液200 μL（約1.5×107個細胞）注射于裸鼠右側(cè)背部肩胛皮下，于SPF環(huán)境中飼養(yǎng)。每天觀察裸鼠狀態(tài)、注射部位腫瘤大小及硬度。1周后，觀察所有裸鼠右側(cè)肩胛背部皮下移植瘤（直徑>5 mm），將荷瘤裸鼠隨機分為AMD3100組（6 mg/kg）、PD98059組（50 mg/kg）、Anti-CXCR7組（1 μL）、AMD3100+Anti-CXCR7組（6 mg/kg AMD3100+1 μL Anti-CXCR7）、對照組（生理鹽水），每組6只。各組分別經(jīng)腹腔注射相應(yīng)藥物，每3 d注射1次，共3周。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 裸鼠移植瘤生長情況 每次用藥前分別用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）、短徑（b），根據(jù)公式（V=ab2/2）計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。治療結(jié)束后，脫頸處死所有裸鼠，于超凈工作臺內(nèi)剝離瘤體，去除脂肪及血污后稱質(zhì)量，計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（對照組瘤質(zhì)量-治療組瘤質(zhì)量）/對照組瘤質(zhì)量×100%。按照金氏公式計算q值以協(xié)助驗證聯(lián)合用藥是否有疊加抑瘤效應(yīng)，q<0.85表示聯(lián)合用藥有拮抗作用，q>1.15表示有協(xié)同作用，q值0.85～1.15表示有相加作用[14]。

1.4.2 實時熒光定量RT-PCR檢測各實驗組瘤體組織Survivin mRNA表達 用TRIzol試劑提取移植瘤組織中的總RNA，使用分光光度計（IMPLEN，德國）檢測樣本中RNA濃度及純度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，按熒光定量PCR說明書加入相應(yīng)體積引物后，置于LightCycler PCR儀（Roche，瑞士）中進行Real Time PCR反應(yīng)。應(yīng)用LightCycler 96分析軟件自動計算出目的基因Survivin及內(nèi)參GAPDH的Ct值，以2-△△Ct計算目的基因的相對表達量[15]。Survivin及GAPDH的引物序列見表1。實驗重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料結(jié)果用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) ?果

2.1 各組移植瘤的生長情況比較

治療期間，各組裸鼠生長良好，飲食、大小便、精神狀態(tài)可，無皮膚潰爛及意外死亡。各組裸鼠治療前體質(zhì)量、腫瘤體積比較差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;治療后AMD3100組、PD98059組、Anti-CXCR7組、AMD3100+Anti-CXCR7組的腫瘤體積與對照組相比均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=72.27，P<0.05）;但AMD3100組、PD98059組、Anti-CXCR7組、AMD3100+Anti-CXCR7組腫瘤體積差異無顯著性（P>0.05）。見表2、圖1。

2.2 各組移植瘤質(zhì)量比較

與對照組比較，AMD3100組、PD98059組、An-ti-CXCR7組、AMD3100+Anti-CXCR7組的腫瘤質(zhì)量均明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=11.35，P<0.01）;4個組間腫瘤質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.3 各組抑瘤率比較

AMD3100組、PD98059組、Anti-CXCR7組、AMD3100+Anti-CXCR7組抑瘤率與對照組相比均明顯升高，差異有顯著性（F=22.94，P<0.01），但4組間的抑瘤率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。應(yīng)用金氏公式計算得出q=0.60，提示聯(lián)合用藥有拮抗作用。2.4 各組移植瘤組織Survivin mRNA表達比較? 本文AMD3100組、PD98059組、Anti-CXCR7組和AMD3100+Anti-CXCR7組移植瘤組織內(nèi)的Survivin mRNA的相對表達量均較對照組明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=17.16，P<0.01），4組間Survivin mRNA相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

3 討 ?論

EC好發(fā)于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后女性，嚴(yán)重影響女性身體健康及生活質(zhì)量，早期EC經(jīng)手術(shù)治療有明顯改善，但發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)病人即使采用聯(lián)合放化療和（或）激素治療，也不能明顯改善預(yù)后。近年來，隨著對腫瘤分子機制和信號通路研究的深入，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注小分子靶向藥物在EC治療中的應(yīng)用，并取得了一定的效果。有研究發(fā)現(xiàn)，在EC中PI3K/AKT/mTOR通路的改變最為常見，該信號通路的激活與EC發(fā)展及不良預(yù)后有關(guān)，它似乎存在于所有實體瘤中[16]。臨床上，對于復(fù)發(fā)、要求保留生育功能的EC病人，分子靶向藥物治療成為重要選擇，這些藥物包括酪氨酸激酶（TK）抑制劑[17]、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路抑制劑[18]、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）抑制劑[19]、蛋白激酶B（Akt）抑制劑[20]、PI3K/mTOR雙重抑制劑[21]、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抑制劑[22]、表皮生長因子受體（EGFR）抑制劑[23]、人類表皮生長因子受體（HER2/neu）抑制劑[24]。

CXCL12/CXCR4、CXCR7生物軸及ERK-1/2信號傳導(dǎo)通路在EC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，應(yīng)用相應(yīng)的抑制劑靶向阻斷該通路，能夠抑制EC細胞的增殖，說明該通路的特異性阻斷劑有望成為治療EC的靶向藥物。早在2006年，REDJA等[25]就報道應(yīng)用CXCR4特異性阻斷劑AMD3100抑制CXCL12/CXCR4信號傳導(dǎo)，研究其對體內(nèi)膠質(zhì)瘤生長的抑制作用，并取得成功。而IERANO等[26]研究結(jié)果證實，CXCR4拮抗劑和CXCR7拮抗劑通過干擾CXCL12/CXCR4、CXCR7軸影響腎癌細胞mTOR信號通路的生物學(xué)效應(yīng)而用于腎細胞癌的治療;并且有研究證實，CXCR4和CXCR7可預(yù)測腎細胞癌的預(yù)后[27-28]。還有研究表明，腫瘤相關(guān)成纖維細胞通過分泌基質(zhì)細胞衍生因子-1α（SDF-1α，又稱趨化因子CXCL12）促進EC細胞的增殖、遷移和侵襲，而這一作用能夠被CXCR4特異性拮抗劑AMD3100顯著抑制[7]。CXCR7為CXCL12的另一種重要受體，與CXCR4相比，其與CXCL12親和力更高。GU等[29]的研究顯示，CXCR7 mRNA和蛋白在EC細胞系Ishikawa及原發(fā)性EC組織中均高表達，在體外實驗中siCXCR7能夠沉默EC細胞系及組織中CXCR7的表達，降低CXCR7導(dǎo)致的腫瘤細胞增殖的能力。郭瑞霞等[9]體內(nèi)實驗的結(jié)果也顯示，ERK抑制劑PD98059通過阻斷MAPK/ERK信號傳導(dǎo)通路，增加EC細胞系Ishikawa和HEC-1A細胞裸鼠移植瘤組織中腫瘤細胞的凋亡，抑制腫瘤的生長。我們前期的研究結(jié)果也證實，ERK信號通路在EC細胞增殖和侵襲中起重要作用，通過CXCL12/CXCR4生物軸激活ERK信號通路上調(diào)Survivin蛋白和MMP-2蛋白表達可引發(fā)Ishikawa細胞的增殖和侵襲[10]。研究顯示，Survivin蛋白在83%的EC中表達上調(diào)，下調(diào)Survivin蛋白表達能夠增加Ishikawa細胞的凋亡[30];CXCL12/CXCR4、CXCR7軸在EC組織及細胞中高表達，采用siRNA靶向沉默CXCR4和（或）CXCR7基因表達后，能夠抑制體內(nèi)外EC細胞的增殖[10-13]。

然而，目前關(guān)于多種小分子靶向抑制劑用于體內(nèi)EC的研究較少，并且抑制劑在體內(nèi)發(fā)揮作用的機制尚未明確。本文研究通過建立裸鼠EC移植瘤模型，將CXCL12下游通路的4種分子靶向抑制劑AMD3100、PD98059、Anti-CXCR7以及AMD3100+Anti-CXCR7用于體內(nèi)治療。結(jié)果顯示，與對照組比較，靶向抑制劑干預(yù)各組瘤體生長速度及體積均明顯減小，瘤體組織Survivin mRNA的表達也明顯下調(diào)，說明這些靶向抑制劑的抑瘤作用可能與凋亡抑制基因Survivin的下調(diào)有關(guān)。此外，本文結(jié)果還顯示，AMD3100、Anti-CXCR7聯(lián)合應(yīng)用或者單用都能夠抑制裸鼠皮下移植瘤的生長，下調(diào)瘤體組織Survivin的表達，但二者聯(lián)合應(yīng)用并不能產(chǎn)生協(xié)同抑瘤作用，這可能與存在不同信號通路的相互拮抗作用有關(guān)，與我們之前聯(lián)合使用CXCR4-siRNA和（或）CXCR7-siRNA進行體內(nèi)實驗的結(jié)果相一致[13]，說明趨化因子CXCL12與其受體CXCR4、CXCR7形成的信號通路可能相互影響。

綜上所述，趨化因子生物軸CXCL12/CXCR4、CXCR7下游的靶向抑制劑AMD3100、PD98059和Anti-CXCR7均能抑制人EC Ishikawa細胞裸鼠皮下移植瘤的生長，且能下調(diào)瘤體組織凋亡抑制基因Survivin的表達。CXCR4、CXCR7趨化因子受體拮抗劑以及ERK通路抑制劑有望成為治療EC的新型小分子靶向抑制劑，為臨床治療EC提供更多選擇?，F(xiàn)階段，已經(jīng)開發(fā)出拮抗CXCR4的小分子拮抗劑，其中一些正處于臨床試驗階段。普樂沙福（AMD3100）目前已被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床治療非霍奇金淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤[31]，但其應(yīng)用于EC的治療還需要進一步的研究。本研究結(jié)果為CXCL12/CXCR4、CXCR7通路的靶向抑制劑用于治療EC提供了實驗支持。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）