周巖 母漢友 王淑芬 汪瑞忠

【關(guān)鍵詞】 原發(fā)性肝癌;細胞增殖;細胞侵襲;BUB1B

Clinical significance of BUB1B in hepatocellular carcinomaand its effect on proliferation and invasion of hepatoma cells Zhou Yan， Mu Hanyou，Wang Shufen， Wang Ruizhong. Department of Clinical Laborat-ory， Pudong New Area Peoples’ Hospital， Shanghai 201299， China

Corresponding author， Wang Ruizhong， E-mail： wrzhd@ qq. com

【Abstract】 Objective ?To investigate the expression and clinical significance of BUB1B in patients with hepatocellular carcinomaand（HCC）， and to evaluate its effect on the proliferation and invasion of human liver cancer cells in vitro. ?Methods The clinical data and the information of gene expression were collected from GEO database （GSE121248）. The differentially-expressing genes were screened and analyzed via bioinformatics analysis. A small interfering RNA vector was designed targeting BUB1B. The effect of BUB1B gene on the proliferation and invasion of liver cancer cells was assessed by silencing the expression of BUB1B gene. The knockdown efficiency was detected by quantitative real-time PCR. The proliferating and invasion abilities were evaluated by cell proliferation assay and wound healing test. The effect of the expression levels of BUB1B gene upon the clinical prognosis of HCC patients was assessed by KM-plotter database. ?Results The silence sequences 1 and 2 could significantly silence the expression of BUB1B mRNA （t=8.41， P=0.001; t=10.43， P < 0.001）. The proliferating ability of hepatoma cell line HepG2， which knocked down the expression of BUB1B gene， was significantly weakened （t=13.94， P < 0.001）. The invasion ability was also reduced at 8 h after knocking down the expression of BUB1B gene （t=14.94， P < 0.001）. The survival rate of HCC patients with high expression of BUB1B gene （n=127） was significantly lower than that of their counterparts with low expression of BUB1B gene （n = 237） [HR = 2.01 （1.42 ～ 2.86）， P = 6.6×10-5]. Further analysis found that the expression of BUB1B gene exerted no effect on the clinical prognosis of HCC patients with a medical history of hepatitis （n = 150） [HR = 1.88 （0.89 ～ 3.99）， P=0.093]， whereas it acted as a molecular biomarker to predict the clinical prognosis of HCC patients without a medical history of hepatitis （n = 167） [HR = 2.84 （1.75 ～ 4.61）， P = 1.1×10-5]. ?Conclusions The BUB1B gene is highly expressed in HCC patients， which can promote the proliferation and invasion of liver cancer cells. BUB1B gene is a potential molecular biomarker for predicting the clinical prognosis of HCC patients with no medical history of hepatitis.

【Key words】 Hepatocellular carcinomaand;Proliferation;Invasion;BUB1B

原發(fā)性肝癌（HCC）目前在全球癌癥相關(guān)死亡率中居第二位，且HCC在全球的發(fā)病率仍在上升，將很快超過100萬/年的發(fā)病率[1-2]。HCC同樣是我國常見的惡性腫瘤之一，患者主要集中在40 ～ 50歲，隨著肝癌腫瘤標(biāo)志物在HCC早期診斷中的應(yīng)用，其早期治療的總體療效明顯改善，但是病因和發(fā)病機制尚未確定[3-4]。研究HCC發(fā)生的相關(guān)分子機制以及尋找預(yù)測肝癌患者預(yù)后的標(biāo)志物是臨床診治工作中面臨的重要問題。最近研究表明紡錘體檢測蛋白BUB1B（又名BUBR1）在腫瘤發(fā)生發(fā)展中存在重要意義，該蛋白是有絲分裂過程中重要的功能蛋白，在多種癌癥發(fā)生中具有重要作用，但是在肝癌中的作用研究較少[5-8]。該研究主要從GEO數(shù)據(jù)庫出發(fā)，篩選出HCC中高表達的差異表達基因BUB1B，通過小干擾RNA的方法沉默該基因表達，研究BUB1B基因?qū)Ω伟┘毎鲋?、侵襲以及對HCC患者預(yù)后的影響。

對象與方法

一、臨床資料的獲取與差異基因篩選

選擇NCBI網(wǎng)站的Gene Expression Omnibus（GEO） 數(shù)據(jù)庫，在NCBI主頁的搜索下拉菜單中選擇GEO DataSets，搜索hepatocellular carcinomaand關(guān)鍵詞，在左邊項目欄中依次選擇Series、Expression profiling by array和tissue，在右邊Top Organisms中選擇Homo sapiens，在檢索的目錄中選

擇GSE121248數(shù)據(jù)集[9]。該數(shù)據(jù)集顯示了107例HCC患者的臨床信息以及基因表達信息，包括70例HCC組織和37例癌旁組織。下載得到該芯片的原始數(shù)據(jù)CEL格式文件以及臨床信息表格Series Matrix Files， 將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Agilent 公司的軟件Gene SpringGX，分析得到差異表達基因。

二、生存分析

生存分析中的HCC患者來自KM-plotter數(shù)據(jù)庫，包括364例HCC患者，具體臨床信息包含是否有肝炎病毒感染史等信息[10]。通過選擇對應(yīng)的篩選條件獲得生存曲線。

三、實驗儀器及材料

實驗儀器：美國Applied Biosystems公司7300 實時熒光定量PCR儀，德國Eppendorf公司的冷卻離心機，美國Thermo Fisher公司的恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱和超凈工作臺。Nikon公司細胞倒置顯微鏡。

實驗材料：天根公司的RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Biotool公司的SYBR Green熒光染料real-time PCR試劑盒，胎牛血清FBS和DMEM高糖培養(yǎng)基購買自Hyclone公司，雙抗（青霉素+鏈霉素）購買自Gibco公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購買自美國Thermo Scientific公司，siRNA-BUB1B購買自拓然生物。

四、實驗方法

1. 細胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1 d將HepG2細胞鋪板，轉(zhuǎn)染時密度約70%，在250 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中加入5 μl siRNA-BUB1B混勻，在250 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中加入5 μl Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑混勻，靜置5 min后，將siRNA混合液滴入轉(zhuǎn)染試劑混合液中，靜置20 min，滴入細胞上清中，4 ～ 6 h后換含有FBS的DMEM培養(yǎng)基，48 h后檢測沉默效率。（沉默序列1：CGGAAGAAGATCTAGATGT，沉默序列2：AGCAGAGTTGTCTAAGCCT）。

2. 熒光定量PCR

用天根RNA抽提試劑盒提取細胞RNA，將抽提的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用Biotool公司的SYBR Green試劑盒檢測BUB1B基因的mRNA表達水平。BUB1B上游引物：5’- CTCGTGGCAATACAGCTYCA-3’，下游引物：5’- CTGGTCAATAGCTCGGCTTC-3’。內(nèi)參GAPDH上游引物：5’-CTACA ATGAGCTGCGTGTGG-3’，下游引物：5’-CTACAATGAGCTGCGTGTGG-3’。采用兩步法擴增程序：95℃30 s，1個循環(huán);95℃15 s，60℃1 min，40個循環(huán);95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，1個循環(huán)。

3. 細胞增殖

將轉(zhuǎn)染siRNA-BUB1B與對照組細胞分別種到6孔板中，每個細胞種4個復(fù)孔，分別在第3、5日將細胞消化下來，進行細胞計數(shù)，根據(jù)細胞數(shù)目畫折線圖。

4. 劃痕實驗

將轉(zhuǎn)染siRNA-BUB1B與對照組細胞分別種到6孔板中，待細胞長滿后，用細胞刮子在每個孔中按照預(yù)先劃好的輔助線進行劃直線，將劃好線的細胞用無FBS的DMEM培養(yǎng)8 h，顯微鏡下拍照，并統(tǒng)計劃痕距離，從而反映細胞的侵襲能力。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5進行作圖以及統(tǒng)計學(xué)分析，BUB1B基因的沉默效率檢測，細胞增殖實驗（細胞數(shù)目），GEO數(shù)據(jù)庫中HCC差異表達基因以及細胞遷移距離采用獨立樣本t檢驗， P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，采用Kaplan-Meier曲線以及l(fā)og-rank檢驗分析BUB1B表達與HCC患者預(yù)后間的關(guān)系。

結(jié) 果

一、GEO數(shù)據(jù)庫篩選出BUB1B在HCC患者中高表達

收集GSE121248數(shù)據(jù)集中HCC患者的肝癌組織以及癌旁正常組織的基因表達數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)分析肝癌組織中相比較于癌旁正常組織差異表達的基因（圖1 A），根據(jù)篩選規(guī)則（P < 0.05，fold change > 2），獲得差異表達基因表達的火山圖（圖1B），其中紡錘體檢測點蛋白BUB1B在肝癌組織中明顯高表達（表1）。

二、BUB1B促進肝癌細胞的增殖及侵襲能力

BUB1B基因在肝癌組織中高表達，但是其生物學(xué)作用并不清楚，我們利用小干擾RNA將肝癌細胞系HepG2中BUB1B基因表達沉默。通過細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，將該小干擾RNA過表達于HepG2細胞中，實時熒光定量PCR技術(shù)檢測該基因的沉默效率。沉默序列1（si-BUB1B-1）和2（si-BUB1B-2）均能有效地沉默BUB1B在HepG2中mRNA的表達（圖2A）（沉默1：t = 8.41， P = 0.001; 沉默2：

t = 10.43，P <0.001）。將低表達BUB1B基因的HepG2細胞與對照組HepG2細胞分別鋪在6孔板中（2×105），分別在第3、5日用細胞計數(shù)的方法反映這兩株細胞系的增殖能力，我們發(fā)現(xiàn)將BUB1B基因表達沉默后，細胞在長到第3日時細胞數(shù)目與對照組細胞相比并沒有差異（t = 2.60， P = 0.060），而在第5日的時候，沉默BUB1B表達的細胞的增殖能力弱于對照組細胞（t = 13.94， P < 0.001），見圖2B。除此之外，細胞劃痕實驗表明，缺少BUB1B基因表達的肝癌細胞，其細胞侵襲能力與對照組細胞相比明顯減弱，見圖2C，劃痕8 h后，細胞遷移形成的劃痕距離在2株細胞（對照組細胞與沉默2細胞）中具有統(tǒng)計學(xué)差異（t = 14.94，P < 0.001），見圖2D。

三、BUB1B是預(yù)測HCC患者預(yù)后的一個分子標(biāo)志物

BUB1B基因不僅在肝癌細胞的生長和遷移中具有重要作用，而且在HCC患者預(yù)后中同樣具有重要作用。我們在KM-plotter數(shù)據(jù)庫中收集了364例HCC患者的預(yù)后以及基因表達信息，試圖闡明BUB1B在HCC患者預(yù)后中的作用。在HCC患者中（包括肝炎病毒感染者和未感染者），高表達BUB1B（n = 127）的HCC患者的生存率差于低表達BUB1B（n=237）的HCC患者[HR = 2.01（1.42 ～ 2.86），P = 6.6×10-5]，見圖3。

肝炎病毒感染是肝癌發(fā)生過程中主要的危險因素，我們從364例HCC患者中細分出感染肝炎病毒的HCC患者（n=150）和未感染肝炎病毒的HCC患者（n=167），在2組患者中根據(jù)BUB1B基因表達的高低分為BUB1B高表達組和BUB1B低表達組，通過Kaplan-Meier生存曲線分析，我們發(fā)現(xiàn)只有在未感染肝炎病毒的HCC患者中，BUB1B高表達組的預(yù)后差于BUB1B低表達組[HR = 2.84（1.75 ～ 4.61），P =1.1×10-5]，見圖4A。而在感染肝炎病毒的HCC患者中，BUB1B高表達組與BUB1B低表達組的生存曲線差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義[HR=1.88（0.89 ～ 3.99），P = 0.093]，見圖4B。

討 論

我們研究發(fā)現(xiàn)紡錘體檢測點蛋白BUB1B在肝癌中高表達，該蛋白的高表達促進了肝癌細胞的增殖與侵襲，進一步研究發(fā)現(xiàn)，BUB1B分子的表達可以作為預(yù)測HCC患者預(yù)后的一個指標(biāo)，尤其是未感染肝炎病毒的HCC患者，這為臨床診斷HCC以及判斷HCC患者的預(yù)后提供了理論基礎(chǔ)。

HCC嚴重威脅人類的生存和健康，尤其是在中國。盡管甲胎蛋白是診斷HCC的最佳標(biāo)志物，但是仍有10% ～ 20%的HCC容易漏診[11]。肝癌診斷的標(biāo)志物比如異常凝血酶原、癌胚抗原、癌抗原（CA199）等在HCC的診斷中具有重要意義[12-14]。除此之外，多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用對HCC診斷的敏感度以及特異度同樣具有重要的意義。盡管多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用可以輔助診斷HCC，但是由于HCC誘發(fā)因素以及病理類型較復(fù)雜，在診斷肝癌過程中還有許多盲點，我們發(fā)現(xiàn)BUB1B在HCC中表達增加，且與肝癌細胞的增殖和侵襲有關(guān)，有望成為診斷的潛在標(biāo)志物。但是BUB1B與甲胎蛋白在HCC中的表達比較在此并未涉及，后續(xù)研究將集中在比較BUB1B與甲胎蛋白作為HCC診斷分子標(biāo)志物上的差異，闡明BUB1B在診斷某種特定HCC中的作用以及與甲胎蛋白聯(lián)合應(yīng)用診斷HCC的特異性。

HCC發(fā)生過程中的兩大誘因主要是酒精與肝炎病毒的感染[15-16]。肝炎-肝硬化-肝癌是肝癌發(fā)生的三部曲，乙型病毒性肝炎是發(fā)展中國家誘發(fā)肝癌的主要因素，盡管80% ～ 90%的HCC患者是由于慢性肝炎轉(zhuǎn)變成肝硬化的過程中肝細胞癌化而進展成HCC，但是仍有部分HCC患者未曾感染肝炎病毒[17]。肝炎病毒感染誘導(dǎo)HCC的發(fā)生機制已經(jīng)研究的較為透徹，而未感染肝炎的肝癌發(fā)生機制反而研究相對較少[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)BUB1B在未感染肝炎的HCC患者中，可以作為預(yù)測HCC患者預(yù)后的理想分子標(biāo)志物，反而在肝炎病毒感染誘發(fā)的HCC患者中，BUB1B的表達與HCC患者的預(yù)后沒有太大關(guān)系，該結(jié)果可能暗示肝炎病毒的感染對BUB1B的分子表達具有一定影響，我們之后的工作也將主要集中在BUB1B在HCC中表達的分子機制。

綜上所述，我們通過HCC患者臨床大數(shù)據(jù)的差異基因篩選，發(fā)現(xiàn)紡錘體檢測點蛋白BUB1B在肝癌中高表達，體外實驗發(fā)現(xiàn)BUB1B的表達促進了肝癌細胞的增殖與侵襲，并且與HCC患者的預(yù)后有關(guān)，尤其是未感染肝炎病毒的HCC患者，該分子的表達可以作為預(yù)測HCC患者預(yù)后的分子標(biāo)志物。

參 考 文 獻

[1] Bray F， Ferlay J， Soerjomataram I， Siegel RL， Torre LA， Jemal A.Global cancer statistics 2018： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin，2018，68（6）：394-424.

[2] Llovet JM， Montal R， Sia D， Finn RS.Molecular therapies and precision medicine for hepatocellular carcinoma. Nat Rev Clin Oncol，2018，15（10）：599-616.

[3] 陳萬青，鄭榮壽，張思維，曾紅梅，鄒小農(nóng)，赫捷.2013年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析.中國腫瘤，2017，26（1）：1-7.

[4] 薛才林，楊濤，古誠鑫，蔣小峰，錢世鹍，劉世明，楊輝.溴結(jié)構(gòu)域蛋白4抑制劑JQ1促使肝癌細胞侵襲遷移的分子機制.新醫(yī)學(xué)，2017，48（7）：443-448.

[5] Pinto M， Vieira J， Ribeiro FR， Soares MJ， Henrique R， Oliveira J， Jerónimo C， Teixeira MR.Overexpression of the mitotic checkpoint genes BUB1 and BUBR1 is associated with genomic complexity in clear cell kidney carcinomas. Cell Oncol，2008，30（5）：389-395.

[6] Baker DJ， Dawlaty MM， Wijshake T， Jeganathan KB， Malureanu L， van Ree JH， Crespo-Diaz R， Reyes S， Seaburg L， Shapiro V， Behfar A， Terzic A， van de Sluis B， van Deursen JM.Increased expression of BubR1 protects against aneuploidy and cancer and extends healthy lifespan. Nat Cell Biol，2013，15（1）：96-102.

[7] Ding Y， Hubert CG， Herman J， Corrin P， Toledo CM， Skutt-Kakaria K， Vazquez J， Basom R， Zhang B， Risler JK， Pollard SM， Nam DH， Delrow JJ， Zhu J， Lee J， DeLuca J， Olson JM， Paddison PJ.Cancer-specific requirement for BUB1B/BUBR1 in human brain tumor isolates and genetically transformed cells. Cancer Discov，2013，3（2）：198-211.

[8] Abal M， Obrador-Hevia A， Janssen KP， Casadome L， Menen-dez M， Carpentier S， Barillot E， Wagner M， Ansorge W， Moeslein G， Fsihi H， Bezrookove V， Reventos J， Louvard D， Capella G， Robine S.APC inactivation associates with abnormal mitosis completion and concomitant BUB1B/MAD2L1 upregul-ation. Gastroenterology，2007，132（7）：2448-2458.

[9] Barrett T， Wilhite SE， Ledoux P， Evangelista C， Kim IF， Tomashevsky M， Marshall KA， Phillippy KH， Sherman PM， Holko M， Yefanov A， Lee H， Zhang N， Robertson CL， Serova N， Davis S， Soboleva A.NCBI GEO： archive for functional genomics data sets——update. Nucleic Acids Res，2013，41（Database issue）：D991-D995.

[10] Lánczky A， Nagy á， Bottai G， Munkácsy G， Szabó A， Santarpia L， Gy?rffy B.miRpower： a web-tool to validate survival-associated miRNAs utilizing expression data from 2178 breast cancer patients. Breast Cancer Res Treat，2016，160（3）：439-446.

[11] Lersritwimanmaen P， Nimanong S. Hepatocellular carcinoma surveillance： benefit of serum alfa-fetoprotein in real-world practice. Euroasian J Hepatogastroenterol，2018，8（1）：83-87.

[12] Inagaki Y， Tang W， Makuuchi M， Hasegawa K， Sugawara Y， Kokudo N. Clinical and molecular insights into the hepatocellular carcinoma tumour marker des-γ-carboxyprothrombin. Liver Int，2011，31（1）：22-35.

[13] Lee JH， Lee SW.The Roles of carcinoembryonic antigen in liver metastasis and therapeutic approaches. Gastroenterol Res Pract，2017，2017：7521987.

[14] Ma B， Liu X， Yu Z.The effect of high intensity focused ultras-ound on the treatment of liver cancer and patients’ immunity. Cancer Biomark，2018. [Epub ahead of print]

[15] Chen XZ， Zhang WK， Tang HB， Li XJ， Tian GH， Shang HC， Li YS. The ethanol supernatant extracts of liushenwan could alleviate nanodiethylnitrosamine-induced liver cancer in mice. Can J Gastroenterol Hepatol，2018，2018：6934809.

[16] Ispas S， So S， Toy M. Barriers to disease monitoring and liver cancer surveillance among patients with chronic hepatitis B in the United States. J Community Health，2018. [Epub ahead of print]

[17] Tellapuri S， Sutphin PD， Beg MS， Singal AG， Kalva SP.Staging systems of hepatocellular carcinoma： a review. Indian J Gastroenterol，2018，37（6）：481-491.

[18] Tu T， Bühler S， Bartenschlager R.Chronic viral hepatitis and its association with liver cancer. Biol Chem，2017，398（8）：817-837.

[19] Islami F， Dikshit R， Mallath MK， Jemal A.Primary liver cancer deaths and related years of life lost attributable to hepatitis B and C viruses in India. Cancer Epidemiol，2016，40：79-86.

（收稿日期：2019-01-18）

（本文編輯：楊江瑜）