彭秀穎 劉慧玲 徐敏儀 陶金 吳斌

【關鍵詞】 衰老;小腸上皮細胞;增殖;β-catenin;CyclinD1

The effect of aging on the morphology and proliferation rate of small intestinal epithelial cells in mice Peng Xiuying， Liu Huiling， Xu Minyi， Tao Jin，Wu Bin. Department of Gastroenterology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Wu Bin， E-mail： binwu001@ hotmail. com

【Abstract】 Objective To observe the changes of the morphology， cell count and the proliferation rate of the small intestinal epithelium in mice during aging. ?Methods Mice were divided into the young （3-month group， n=9）， the middle-aged （12-month group， n=9） and the old groups （19-month group， n=9）. Each mouse received intraperitoneal injection of 5-Bromo-2-deoxyUridine （Brdu） at a dose of 100 mg/kg body weight. At 24-， 48- and 72-h after administration， 3 mice were sacrificed in each group and the jejunum and ileum tissues were collected and prepared for morphological observation. The proliferation rate of cells was analyzed by Brdu immunofluorescent staining. The expression levels of β-catenin and cyclinD1 were quantitatively measured. ?Results Compared with 3-month-old mice， 12-month-old mice had longer villus， deeper crypt， more goblet cells， Paneth cells and stem cells. In the 19-month-old mice， the number of goblet cells and Paneth cells in the ileum， and the number of stem cells in the ileum and jejunum were significantly less compared with those in the 12-month-old mice. Brdu staining demonstrated that the number of Brdu positive cells and the migration length in the 19-month-old mice were significantly reduced compared with those in the other two groups（all P < 0.017）. The expression levels of β-catenin and cyclinD1 were significantly down-regulated in the 19-month-old mice（all P < 0.017）. ?Conclusions During the process of aging， the proliferation rate of the small intestinal epithelial cells is reduced， the crypt depth， the number of goblet cells， Paneth cells and stem cells are decreased in mice.

【Key words】 Aging;Small intestinal epithelium;Proliferation;β-catenin;CyclinD1

小腸黏膜的主要功能是吸收和防御，其中腸上皮發(fā)揮了重要作用。小腸上皮細胞主要分為吸收性腸上皮細胞、杯狀細胞、潘氏細胞、內分泌細胞、干細胞等，小腸上皮更新速度快，約4 ～ 5 d

更新1次，而隱窩中的潘氏細胞壽命約1個月。隨著年齡增長，腸道功能逐漸減退[1-3]。對此已有相關研究，但因為取材位置、年齡選取等原因，結果各不相同。

本實驗選取3個年齡段的小鼠，分別為3、12和19個月，分別對應人類年齡的青年、中年和老年階段[4]。重點研究小腸增殖功能隨衰老發(fā)生的變化，計數絨毛和隱窩長度以及各類細胞的個數，測定腸上皮更新的速度，并檢測增殖相關的蛋白含量。

材料與方法

一、實驗動物

無特定病原體（SPF）C57BL/6野生型小鼠27只，分為3 ～ 4個月（3個月組）、12 ～ 13個月（12個月組）、18 ～ 20個月（19個月組）3個年齡段。每年齡段各9只，雌雄不限。其中3 ～ 4個月小鼠體質量25 ～ 30 g、12個月以上小鼠體質量30 ～ 40 g，在中山大學附屬第三醫(yī)院動物房繁育養(yǎng)殖。動物實驗符合倫理學要求。

二、主要試劑

5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu，Abcam）;蘇木

素染液、伊紅染液、PAS染液;Brdu抗體、cycli-nD1抗體（Abcam）、MMP-7抗體、Olfm4抗體、

PCNA抗體、β-catenin抗體（Cell Signaling Techn-ology）、β-actin抗體（Sigma）;DAB顯色液（DAKO）、488波長抗大鼠熒光染液、594波長抗兔熒光二抗（ThermoFisher）。

三、實驗步驟

1.動物處理

按100 mg/kg的量腹腔注射Brdu溶液，分別在24、48和72 h之后，每組隨機取3只小鼠處死。小鼠處死后，從幽門往下5 cm取2 cm進行石蠟包埋切片，再取45 cm刮取黏膜蛋白（空腸）;再從回盲部開始，向上取2 cm進行石蠟包埋，再取4 ～ 5 cm刮取黏膜蛋白（回腸）。本實驗已通過中山大學附屬第三醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準。

2.石蠟包埋

將小腸標本在10%甲醛固定12 ～ 24 h后，放入LeicaASP200s自動脫水機脫水，約15 h，程序完成，取出樣本，在Leica包埋機中進行石蠟包埋。

3.蘇木素-伊紅（HE）染色

將玻片脫蠟、水化后，在玻片上滴加蘇木素染液，90 s后用PBST洗去，返藍后，將玻片浸入伊紅染液80 s，用清水洗去染液，脫水封片。在顯微鏡下觀察，每個玻片隨機取10個視野，30個左右絨毛和隱窩統計其長度（每組9只小鼠）。

4. PAS糖原染色

將玻片脫蠟、水化后，滴加過碘酸染液，避光染色10 min，用PBST洗去染液后，再滴加Schiff試劑，避光染色15 min，用清水洗去染液，浸入PBST數分鐘后滴加配套的蘇木素染1 min，返藍后脫水封片。在顯微鏡下觀察，每個玻片隨機取10個視野，約30個絨毛-隱窩軸統計其PAS陽性個數（每組6只小鼠）。紫紅色為PAS陽性，藍色為蘇木素。

5. MMP-7免疫組織化學染色

將玻片脫蠟、水化后，在3%過氧化氫溶液中浸泡10 min，用pH 8.0的EDTA抗原修復液高壓鍋130℃ 3 min，自然放涼后滴加MMP7抗體（1∶100），放在孵育盒中，4℃冰箱放置14 h，PBST洗去一抗，滴加兔二抗（1∶200），37℃孵育2 h。滴加DAB顯色1 min。顯色完畢后蘇木素染色1 min，脫水封片（6只）。棕色為MMP7陽性，藍色為蘇木素。

6.免疫熒光染色

注射Brdu，分別在24、48和72 h后處死小鼠，用Brdu抗體進行免疫熒光染色，統計Brdu陽性的腸上皮細胞在絨毛上的最大遷移距離和隱窩-絨毛軸上Brdu陽性細胞的個數。

將玻片脫蠟、水化后，用pH 8.0的EDTA抗原修復液高壓鍋130℃ 3 min，放涼后分別滴加OLFM4 （1∶400）（每組3只小鼠）、 Brdu（1∶100），4℃冰箱放置14 h，PBST洗去一抗。以下步驟均需要避光：分別加入熒光二抗[488抗大鼠（綠色熒光）、594 抗兔（紅色熒光）熒光二抗]，37℃孵育90 min，孵育完畢后放入DAPI溶液（約1∶30 000

稀釋）中浸泡30 min染核，用PBST浸洗數分鐘后用防淬滅熒光封片劑封片后放入4℃冰箱保存。每張玻片取10個視野，統計約30個單位的數據。紅色為Olfm4陽性，藍色為DAPI陰性，綠色為Brdu陽性。

7.提取小腸黏膜蛋白和蛋白免疫印跡實驗

按照總蛋白提取裂解液操作說明書對小腸黏膜組織總蛋白進行提取與定量，取樣本蛋白進行電泳;電泳印記轉至NC膜上;牛奶封閉2 h;分別加入如下抗體：β-catenin（1∶1 000）、cyclinD1（1∶200）、β-actin （1∶4 000），4℃放置過夜至少12 h。用TBST洗3 min洗去一抗，加入二抗（1∶5 000），常溫孵育100 ?min，TBST洗3 min。滴加發(fā)光液，在Tanon自動化學發(fā)光儀內拍照（每組3只小鼠）。

8. 絨毛上的最大遷移距離計算

Brdu陽性細胞的位置到絨毛底部的長度取最大值（如果被標記的細胞已到達絨毛頂端則將遷移距離記為絨毛長度）。

四、統計學處理

使用SPSS 20.0進行統計學分析。非正態(tài)分布以中位數（四分位數間距）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗，使用Bonferroni法進行兩兩對比，P < 0.05/3（0.017）表示差異有統計學意義。結果以箱圖顯示，箱中橫線代表中位數，箱體代表四分位差，圓點代表離散值。

結 果

一、小腸上皮的形態(tài)隨衰老的變化

空腸絨毛長度3組對比 H=113.202，P < 0.001，

3個月小鼠絨毛長度大于12個月和19個月的小鼠（P均< 0.017），而12個月的小鼠和19個月的小鼠絨毛長度比較差異無統計學意義（P = 0.232）。回腸絨毛長度3組對比H=35.636，P < 0.001，12個月小鼠絨毛較3個月的小鼠長（P< 0.017），而19個月的小鼠較12個月的小鼠更短（P < 0.017），19個月和3個月小鼠對比差異亦有統計學意義（P < 0.017），見圖1。

隱窩長度測量結果顯示，空腸隱窩長度3組對比H=100.303，P < 0.001，回腸隱窩長度3組對比H=178.778，P < 0.001;12個月的小鼠空腸和回腸的隱窩長度都較3個月的小鼠大（P均< 0.017），19個月的小鼠空腸、回腸隱窩長度均比12個月的小鼠小，回腸隱窩長度與3個月的小鼠沒有差別（P = 0.064），見圖1。

二、小腸上皮不同種類細胞個數隨衰老的變化

這3種染色的數量變化趨勢在空腸和回腸基本一致。從數值上看，這些細胞數量變化非常小。最明顯的變化是12個月小鼠比3個月小鼠數量增加。19個月小鼠與12個月小鼠相比，呈現數量減少和無明顯差異兩種情況。19個月小鼠與3個月小鼠對比，呈現數量上升和無明顯差異兩種情況，見圖2、3。

三、小腸上皮增殖速度隨衰老的變化

此結果在空腸和回腸中基本一致。綜合對比3個月的小鼠與12個月的小鼠被標記的腸上皮細胞最大遷移距離和被標記的細胞個數，未能得到一致的結果，但是19個月的小鼠在3個時間段的最大遷移距離和被標記的細胞數目都低于3個月和12個月的小鼠。3個月和12個月的小鼠，被標記的腸上皮細胞在72 h已能夠達到絨毛頂端，而19個月的小鼠則沒有一個細胞能到達頂端。雖然 3個月的小鼠空腸中，一部分絨毛在72 h未能到達頂端，但是其絨毛長度比12個月要長，因此最大遷移距離同樣大于19個月的小鼠。另外3個月和12個月的小鼠雖然在數值上沒有明顯的差異，但是觀察切片可以發(fā)現，3個月的小鼠中被標記的細胞整齊聚集，而在12個月的小鼠則明顯分散，見圖4、5。

四、增殖相關蛋白的檢測

用蛋白免疫印跡法檢測了2個與增殖有關的蛋白：β-catenin和cyclinD1。蛋白條帶結果顯示，β-catenin和cyclinD1的條帶在19個月組中明顯淺于其他2組，而3個月組和12個月組未見明顯的差異，見圖6。

討 論

衰老是生物無可避免的一種現象。隨著年齡增長，人體器官的功能將逐漸減退。老年人普遍存在消化吸收和免疫功能減退的情況，與小腸黏膜的變化有密切聯系。

按照Jacksonlab的說明書，3 ～ 6個月的小鼠對應人類年齡的20 ～ 30歲，10 ～ 14個月的小鼠對應人類年齡的38 ～ 47歲，18 ～ 24個月的小鼠對應人類年齡的56 ～ 69歲。在此之前，已有數篇文獻對此做過研究，文獻將3個月左右的小鼠與18個月以上的小鼠進行對比，得到衰老的小鼠隱窩長度增加，杯狀細胞、潘氏細胞和干細胞數目增加的結果，對于絨毛長度的結論也不盡相同[5-8]。

考慮到直接將青年組和老年組對比，時間跨度過長，其中的變化并不清晰，為了更好的觀察小鼠小腸黏膜隨年齡的變化，本實驗設立3個年齡段，對同一位置的空腸和回腸的絨毛長度、隱窩長度進行統計，并對杯狀細胞、潘氏細胞和干細胞數進行計數。絨毛長度測量結果發(fā)現，空腸和回腸的結果并不一致?？漳c的差別主要在3個月和12個月的小鼠之間，19個月小鼠與12個月小鼠沒有差別。而回腸中，12個月的小鼠絨毛長度最長，3個月和19個月小鼠比12個月小鼠長度要短，但是總體變化很細微。這說明絨毛長度的對比結果隨小腸部位不同而異。

隱窩長度的結果也不完全一致。在空腸，3個月的小鼠隱窩長度最小，而12個月和19個月沒有明顯差別。在回腸，19個月的小鼠隱窩長度低于12個月的小鼠，呈現下降趨勢。但是共同點是，12個月的小鼠比起3個月的小鼠隱窩長度要大。從空腸的結果來看，隱窩長度在3個月之后12個月之前依舊有所增長，后來在衰老過程中逐漸萎縮。

為了研究不同種類的腸上皮個數是否隨衰老有所變化，分別對各標記物染色。PAS糖原染色主要識別杯狀細胞，MMP7免疫組化染色主要識別潘氏細胞。Olfm4是一種小腸干細胞標記物，研究表明，Olfm4在小鼠小腸的Lgr5+細胞中有非常高的表達量，因此可用來標記Lgr5+的小腸干細胞[9]。目前許多觀點認為，隱窩底部Lgr5陽性的細胞很有可能性是小腸干細胞。本實驗對杯狀細胞、潘氏細胞和小腸干細胞進行染色，統計不同年齡段的數目，結果比較一致。這些細胞數目在12個月的小鼠中最大，而19個月與12個月對比，空腸的杯狀細胞、潘氏細胞沒有差異，回腸的杯狀細胞、潘氏細胞則下降。而空腸與回腸的Olfm4陽性細胞數目都下降，提示Lgr5陽性的小腸干細胞數目減少。由此可見，小鼠3個月時，這幾類細胞的數目并沒有達到最大值。在3個月到12個月之間，數目依舊有所增長，隨著小鼠衰老，腸道增殖功能減退，細胞數目可能會下降。總的來說，19個月的小鼠對比12個月的小鼠，隱窩長度減少，杯狀細胞、潘氏細胞和干細胞數目都有減少的趨勢，但是不會少于3個月的水平。

Brdu是一種胸腺嘧啶核苷類似物，對小鼠進行腹腔注射，可使其摻入小腸隱窩內正在復制的DNA中，從而標記隱窩底部的腸上皮，小腸上皮在增殖、分化和成熟的過程中，一直向絨毛頂端移動，直到移動到絨毛最頂端發(fā)生凋亡。經過一段時間處死小鼠，即可通過小腸上皮當前的位置評估小腸上皮的遷移情況[10]。因此，本實驗使用Brdu標記正在復制DNA的腸上皮細胞來測定小腸增殖的速度。雖然空腸和回腸的結果具有差異，但是總體趨勢一致。綜合觀察3個時間段，19個月的小鼠在不同時間段、不同部位的條件下，最大移動距離都低于3個月和 12個月的小鼠。之前有文獻對比了2 ～ 4個月和20 ～ 22個月小鼠在72 h的移動距離，本實驗與該文獻結果一致[10]。本實驗同時統計了隱窩-絨毛軸上Brdu陽性細胞的個數，發(fā)現19個月的小鼠標記的腸上皮個數也同樣低于另外2組。19個月小鼠增殖速度明顯低于另外2組，說明其增殖功能受損。需要特別說明的是，由于Brdu溶液是一種廣泛使用的增殖標記物，如果腹腔注射不成功則不會在小腸中出現任何陽性信號。目前沒有資料表明Brdu在用于標記時對目標器官產生額外影響。在查閱過的參考文獻中，利用該標記物計算腸上皮遷移速率時，也并不針對這一操作設置空白對照組[11-13]。因此，本實驗同樣沒有設置空白對照組。

經過蛋白免疫印跡檢測的2個蛋白，其中β-catenin是經典Wnt/β-catenin通路的關鍵蛋白。cyclinD1是Wnt通路的下游蛋白，這是一種周期調控蛋白，具有促進細胞增殖的作用[14]。Wnt通路在小腸的作用是促進小腸上皮細胞增殖[15-16]。蛋白免疫印跡實驗結果表明，19個月組的β-catenin和cyclinD1表達量比另外2組減少，提示Wnt通路減弱，這或許和19個月組小鼠增殖速度減慢相關。

綜合細胞染色的結果來看，12個月的小鼠，隱窩長度增加，杯狀細胞、潘氏細胞和干細胞數目都增加，形態(tài)學上發(fā)生了較大的變化，而Brdu染色卻沒有統一的結果。其最大遷移距離略高于3個月的小鼠，但是計數標記的細胞數卻大多低于3個月的小鼠。此外，在觀察過程中可以發(fā)現，12個月的小鼠標記細胞的排列較散亂。12個月的小鼠β-catenin和cyclinD1含量與3個月對比并無差異。也許在12個月時，小鼠的增殖功能受到了一些損傷，但是仍能維持腸上皮更新的速度。而19個月的小鼠，黏膜形態(tài)和細胞數目與3個月的小鼠相近，增殖功能卻已經大幅減退。由此可見，小鼠衰老過程中，小腸形態(tài)和細胞數目的變化與小腸增殖功能的變化并不平行。這或許是因為在衰老的過程中，腸上皮單個細胞的質量一直在減退，需要更加精密的手段來檢測這種變化。

總而言之，衰老的小鼠Wnt通路減弱，導致增殖功能減退，增殖速度減慢，絨毛長度、隱窩長度減少，各種類細胞數目有減少的可能。

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（收稿日期：2019-01-18）

（本文編輯：楊江瑜）