王東 劉國(guó)新 董作青 楊中軍 陳健

[摘要]目的?通過(guò)生物信息學(xué)分析，篩選舌鱗狀細(xì)胞癌（鱗癌）組織和正常組織差異表達(dá)基因（DEGs），篩選關(guān)鍵基因，為進(jìn)一步的研究提供參考。方法?從公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO）下載舌鱗癌芯片數(shù)據(jù)，利用R語(yǔ)言L(fǎng)imma程序包篩選DEGs，利用韋恩圖篩選不同數(shù)據(jù)集的共同DEGs，對(duì)共同DEGs進(jìn)行GO和KEGG富集分析、蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析及網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵基因生存分析。結(jié)果?篩選出不同數(shù)據(jù)集的共同DEGs 297個(gè)，這些基因參與血管新生、細(xì)胞黏附、氧化還原等過(guò)程，并參與細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路、黏著斑通路、小細(xì)胞肺癌通路、Toll樣受體信號(hào)通路和代謝通路，與舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。同時(shí)篩選出THBS1、CRP、HMMR、TFPI2、SDS、ANLN等6個(gè)關(guān)鍵基因，其表達(dá)上調(diào)，與頭頸部鱗癌病人的預(yù)后顯著相關(guān)。結(jié)論?篩選出的關(guān)鍵基因有助于加深對(duì)舌鱗癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的理解，同時(shí)可為后續(xù)的臨床研究提供一定的理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]舌腫瘤;癌，鱗狀細(xì)胞;寡核苷酸序列分析;計(jì)算生物學(xué);數(shù)據(jù)挖掘

[中圖分類(lèi)號(hào)]R739.86

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]?2096-5532（2019）05-0505-05

doi：10.11712/jms201905001

[開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

舌癌是口腔頜面部常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率有所上升。雖然現(xiàn)階段以手術(shù)為主的綜合治療取得了一定的效果，但是舌癌易轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除難度大，術(shù)后易復(fù)發(fā)，手術(shù)常常造成病人語(yǔ)言、進(jìn)食、呼吸等功能的障礙和顏面的畸形[1-2]。目前舌癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確。因此，在分子層面上揭示舌癌的發(fā)病機(jī)制，篩選舌癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，可能為舌癌的防治提供重要的靶點(diǎn)和標(biāo)志物?；蛐酒且环N高通量獲取生物信息的技術(shù)，能高效檢測(cè)并分析腫瘤組織和正常組織差異表達(dá)基因（DEGs）[3]。本研究擬通過(guò)分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO）提供的舌鱗狀細(xì)胞癌（簡(jiǎn)稱(chēng)鱗癌）相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)，篩選DEGs，并對(duì)DEGs進(jìn)行功能富集分析，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行生存分析，為進(jìn)一步在分子水平研究舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為舌鱗癌的診斷和治療提供一定的理論依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1?資料和方法

1.1?數(shù)據(jù)檢索

在GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中檢索“tongue cancer”，下載舌鱗癌基因芯片數(shù)據(jù)。每個(gè)數(shù)據(jù)集均需符合以下條件：①實(shí)驗(yàn)用人舌鱗癌組織和正常組織進(jìn)行比較;②數(shù)據(jù)集來(lái)自全基因組 RNA 表達(dá)芯片。

1.2?獲得DEGs

應(yīng)用R語(yǔ)言（https：//www.r-project.org/）對(duì)基因芯片原始數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋和過(guò)濾，用Bioconductor（http：//bioconductor.org/）提供的RMA算法對(duì)各原始芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正及歸一化等預(yù)處理。采用Limma程序包對(duì)腫瘤組織和正常組織樣本的基因表達(dá)值進(jìn)行比對(duì)，以表達(dá)倍數(shù)變化值的對(duì)數(shù)值（log2FC）絕對(duì)值>1且調(diào)整后P<0.05為閾值，獲得各數(shù)據(jù)集的DEGs。采用韋恩圖（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）的方法獲取各數(shù)據(jù)集的共同DEGs。

1.3?GO和KEGG富集分析

利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)各數(shù)據(jù)集的共同DEGs進(jìn)行GO分析和KEGG分析。

1.4?蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

利用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）對(duì)各數(shù)據(jù)集共同DEGs編碼蛋白的相互作用進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。應(yīng)用Cytoscape_v3.6.1軟件插件Cytohubba尋找蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中與舌鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵基因。

1.5?關(guān)鍵基因生存分析

利用KM plotter網(wǎng)上分析工具（http：//kmplot.com/analysis/）分析DEGs表達(dá)與頭頸部鱗癌病人生存期的相關(guān)性，評(píng)價(jià)通過(guò)生物信息學(xué)方法找到的關(guān)鍵基因?qū)膊☆A(yù)后的預(yù)測(cè)能力。登錄KM plotter網(wǎng)站，輸入基因名稱(chēng)，選擇疾病類(lèi)別，樣本數(shù)設(shè)為499，cut off值設(shè)為median，繪制生存曲線(xiàn)，篩選有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的結(jié)果以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

共檢索到3個(gè)數(shù)據(jù)集（GSE31056、GSE78060、GSE34105），其中GSE31056數(shù)據(jù)集包含24個(gè)正常樣本和24個(gè)腫瘤樣本;GSE78060數(shù)據(jù)集包含4個(gè)正常樣本和26個(gè)腫瘤樣本;GSE34105數(shù)據(jù)集包含16個(gè)正常樣本和62個(gè)腫瘤樣本。

2.2?DEGs分析

GSE31056、GSE78060和GSE34105基因芯片數(shù)據(jù)集分別篩選出DEGs為2 193、4 727和3 099個(gè)（圖1A～C）。為了減少DEGs篩選結(jié)果的假陽(yáng)性率，采用韋恩圖取交集的方法確定3個(gè)數(shù)據(jù)集的共同DEGs為297個(gè)（圖1D）。

2.3?共同DEGs的GO和KEGG分析

GO分析包括生物學(xué)過(guò)程（BP）、細(xì)胞組分（CC）和分子功能（MF）3部分。DEGs的BP主要富集于血管新生、細(xì)胞黏附、氧化還原過(guò)程、正向調(diào)控轉(zhuǎn)錄RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子;CC主要富集于朊蛋白細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外間隙、細(xì)胞外泌體、細(xì)胞外組分、細(xì)胞表面;MF主要富集于金屬內(nèi)肽酶活化、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、序列特異性DNA結(jié)合、血紅蛋白結(jié)合、蛋白結(jié)合。KEGG分析顯示，通路主要富集于細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路、黏著斑通路、小細(xì)胞肺癌通路、Toll樣受體信號(hào)通路和代謝通路。見(jiàn)表1。

2.4?蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

設(shè)置最低要求的相互作用分?jǐn)?shù)為0.4，得到297個(gè)共同DEGs編碼蛋白的相互作用關(guān)系圖（圖2）。采用 Cytoscape_v3.6.1 軟件的插件MCODE對(duì)該蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，得到了由34個(gè)共同DEGs構(gòu)成的核心模塊（圖3）。對(duì)該核心模塊進(jìn)行GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)其參與的重要BP主要是細(xì)胞黏附、正向調(diào)控基因表達(dá)作用，參與的主要信號(hào)通路有代謝和PI3K-Akt信號(hào)通路等。利用 Cytoscape_v3.6.1 軟件插件 cytohubba，采用Degree算法得到25個(gè)在共同DEGs編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因（圖4）。

2.5?生存分析

利用KM plotter網(wǎng)上分析工具分析關(guān)鍵基因表達(dá)與頭頸部鱗癌病人生存期的相關(guān)性，結(jié)果顯示，THBS1（HR=1.19～2.42，P<0.01）、CRP（HR=1.70～2.03，P<0.01）、HMMR（HR=1.10～1.88，P<0.01）、TFPI2（HR=1.00～1.73，P<0.05）、SDS（HR=1.03～1.80，P<0.05）、ANLN（HR=1.03～1.79，P<0.05）基因的表達(dá)與頭頸部鱗癌病人的預(yù)后顯著相關(guān)，這6個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)越高，病人預(yù)后越差（圖5）。

3?討論

本研究對(duì)GEO中檢索到的3個(gè)舌鱗癌相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)集進(jìn)行DEGs篩選，并對(duì)DEGs功能進(jìn)行富集分析，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析關(guān)鍵基因表達(dá)與頭頸部鱗癌病人生存期的相關(guān)性，最終篩選出6個(gè)與舌鱗癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的關(guān)鍵基因。

THBS1是血小板反應(yīng)蛋白家族中第一個(gè)被識(shí)別的蛋白，在腫瘤微環(huán)境中起重要作用。THBS1最開(kāi)始是作為細(xì)胞黏附蛋白而被人們所關(guān)注，很多研究發(fā)現(xiàn)THBS1可以在不同種群的多種細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附[4]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，THBS1表達(dá)上調(diào)可以增強(qiáng)腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移，在乳癌中，THBS1FAK信號(hào)通路與Hippo信號(hào)通路交互作用來(lái)調(diào)控YAP相關(guān)的腫瘤侵襲。鑒于其在腫瘤進(jìn)展中的重要作用，THBS1有望成為腫瘤治療的靶點(diǎn)[5]。

CRP即C反應(yīng)蛋白，是肝臟產(chǎn)生的血液檢查炎性標(biāo)志物，在炎癥狀態(tài)時(shí)表達(dá)升高，在宿主防御感染過(guò)程中起到關(guān)鍵作用[6]。PETRZYK等[7]研究表明，在結(jié)直腸癌中，肥胖相關(guān)的慢性炎癥可以通過(guò)活化JAK/STAT、MAPK、PI3K、mTOR等信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。還有研究結(jié)果表明，炎癥狀態(tài)和血漿CRP升高對(duì)多種腫瘤產(chǎn)生影響，炎性標(biāo)志物表達(dá)與結(jié)直腸癌病人轉(zhuǎn)移生存率呈負(fù)相關(guān)[8]。

HMMR是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞周期[9]。STEVENS等[10]報(bào)道，在原發(fā)性肺腺癌中HMMR呈高表達(dá)。WANG等[11]報(bào)道，在乳癌中RHAMM呈過(guò)表達(dá)，RHAMM高表達(dá)與較差預(yù)后評(píng)估值相一致。HMMR參與了調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，其高表達(dá)提示腫瘤病理分期更差、預(yù)后更差。

TFPI2的生物學(xué)功能尚沒(méi)有完全確定。有學(xué)者認(rèn)為T(mén)FPI2作為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的有絲分裂原來(lái)發(fā)揮作用[12-13]。在癌癥生物學(xué)背景下，關(guān)于TFPI2的研究主要集中在其蛋白酶抑制劑活性上。TFPI2結(jié)構(gòu)中包含3個(gè)串聯(lián)重復(fù)Kunitz-type蛋白酶抑制域[14]。由于能廣泛抑制絲氨酸蛋白酶（包括纖溶酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶），TFPI2可以在調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)重塑中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。通過(guò)廣泛抑制蛋白酶，TFPI2可以保護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)免受降解，從而抵抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。相關(guān)研究表明，TFPI2過(guò)表達(dá)可以抑制肺癌、前列腺癌、胰腺癌等多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲。TFPI2還被發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)凋亡，抑制血管新生。因此，TFPI2被認(rèn)為是一個(gè)抑癌因子。后來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，TFPI2在鱗癌細(xì)胞及組織中專(zhuān)一性過(guò)表達(dá)，與其他類(lèi)型的卵巢癌相比，卵巢鱗癌在Ⅰ期的診治率很高[15]。本研究舌鱗癌組織中的TFPI2也同樣是表達(dá)上調(diào)，對(duì)病人的預(yù)后產(chǎn)生影響。

SDS具有將絲氨酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸的作用，廣泛分布于細(xì)菌、真菌、動(dòng)植物的器官中[16]。參與氨基酸代謝的酶一般有兩種或多種異構(gòu)體，而其中一種異構(gòu)體會(huì)在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。雖然cSDS基因在腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄表達(dá)，很少翻譯為蛋白，但是其在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)仍有很重要的生理意義[17]。

ANLN是編碼蛋白基因，在大腦、胎盤(pán)、睪丸中的表達(dá)水平較高，在心臟、腎臟、肝臟、肺臟、胰腺、前列腺、脾臟中的表達(dá)水平較低[18]。研究結(jié)果表明，ANLN在多種腫瘤中呈高表達(dá)，如乳癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌等[19]。ANLN高表達(dá)是結(jié)直腸癌、胃癌、乳癌、頭頸癌預(yù)后不良的因素[20]。

本研究采用生物信息學(xué)的方法分析了舌鱗癌DEGs的相關(guān)數(shù)據(jù)，篩選了其相關(guān)的MF和信號(hào)通路，使我們更深入地了解了舌鱗癌潛在分子發(fā)生發(fā)展機(jī)制，并為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供了理論依據(jù)。

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（本文編輯?馬偉平）