林向楠 李紅光 李際濤 李磊 金海榮 馬忠堂

[摘要]目的 探討電刺激陰莖海綿體神經(jīng)測定海綿體內(nèi)壓法（簡稱電刺激法）在1型糖尿病小鼠模型勃起功能障礙評價中的應用效果。方法 將30只SPF級8周齡C57BL6J小鼠隨機分為對照組（n=10）和實驗組（n=20），實驗組小鼠給予腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）誘導1型糖尿病模型，隨機選取10只作為后續(xù)實驗對象。8周后，電刺激小鼠陰莖海綿體神經(jīng)，記錄勃起時的海綿體內(nèi)壓最大值（ICPmax），間隔10 min，重復測量3次。記錄電刺激之前小鼠的平均系統(tǒng)血壓（MSBP），使用ICPmax/MBSP評估小鼠的勃起功能。結果 實驗組3次測得的ICPmax和ICPmax/MBSP差異無顯著性（P>0.05），對照組3次測得的值差異也無顯著性（P>0.05），但兩組組間每次測得的ICPmax和ICPmax/MBSP差異均有顯著性（t=17.71～18.27，P<0.05）。結論 在1型糖尿病小鼠模型中，應用電刺激法測量海綿體內(nèi)壓是一種安全、穩(wěn)定、可重復的理想方法。

[關鍵詞]糖尿病，1型;陰莖勃起;電刺激;小鼠

[中圖分類號]R698.1;R587.1

[文獻標志碼]A

[文章編號] 2096-5532（2019）05-0528-04

doi：10.11712/jms201905006

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

勃起功能障礙（ED）是指陰莖持續(xù)不能達到和（或）維持足夠勃起以獲得滿意的性生活[1]。有調(diào)查結果顯示，在40～69歲的人群中ED的發(fā)病率高達52%[2]。ED是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，目前全球范圍內(nèi)的糖尿病病人約有3億5 000萬[3]，而高達75%的糖尿病病人有不同程度的ED，且發(fā)病年齡比普通人群提前10～15年，并隨著年齡和病程的增長而加重[4]。目前我國人口正呈現(xiàn)老齡化趨勢，因此老年男性糖尿病病人ED的防治越來越受到關注。如何有效評價糖尿病性ED的海綿體內(nèi)壓，是對其后續(xù)治療的有力保障。國外常用的評價勃起功能的方法是電刺激陰莖海綿體神經(jīng)測定海綿體內(nèi)壓法（簡稱電刺激法），而國內(nèi)運用此方法的報道不多，且研究對象多為大鼠。目前1型糖尿病小鼠模型的建立已經(jīng)成熟，本研究就該方法在1型糖尿病小鼠模型ED評價中的應用效果進行觀察。

1 材料與方法

1.1 材料

8周齡SPF級C57BL6J小鼠30只，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司（經(jīng)山東省實驗動物中心質(zhì)檢合格）。多導生理記錄儀、鉑金雙極電極、電刺激儀（美國BIOPAC公司），Visitech Systems BP-2000小動物無創(chuàng)血壓分析系統(tǒng)（美國INC公司），鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司），解剖顯微鏡及顯微手術器械（德國徠卡公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與建模 實驗小鼠飼養(yǎng)于濱州醫(yī)學院醫(yī)藥研究中心的SPF級動物房，隨意取食物和水，飼養(yǎng)環(huán)境：光/暗周期12 h/12 h，室溫（22±2）℃，濕度50%～55%。隨機選擇10只小鼠，給予標準飲食、自由飲水，設為對照組;余20只小鼠設為實驗組，給予高脂飲食、自由飲水，腹腔注射STZ（用pH值4.5的0.1 mol/L冰檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液配制20 g/L的STZ溶液，注意避光，即配即用）50 mg/（kg·d），連續(xù)5 d，8周后測禁食10 h后的空腹血糖濃度，高于16.7 mmol/L者即為1型糖尿病建模成功[5]，從中隨機選取10只進行后續(xù)實驗。

1.2.2 小鼠勃起功能實驗 以6 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠（66～80 mg/kg），將小鼠仰面固定于動物解剖操作臺上。剃去小鼠下腹部手術區(qū)域毛發(fā)，沿陰莖縱軸剪開陰莖包皮，分離包皮和白膜，充分暴露陰莖海綿體。取陰莖包皮切口向上延續(xù)2～3 cm，切開皮膚及腹壁，打開腹膜，用紗布條攢成球擠開腸道，增加手術操作空間。分離恥骨聯(lián)合前肌肉組織，充分暴露前列腺，在前列腺后外側，識別盆神經(jīng)節(jié)，沿尿道方向尋及陰莖海綿體神經(jīng)，從底部穿過鉑金雙極電極并固定妥當。用充滿肝素生理鹽水的頭皮針穿入陰莖海綿體中部，頭皮針通過三通閥門連接注射器和壓力換能器，推注少許肝素生理鹽水可見陰莖勃起，證明穿刺連接正確，術畢。

1.2.3 觀察指標 電刺激小鼠的陰莖海綿體神經(jīng)，兩組給予相同強度的電刺激：電壓1或5 V，波寬1 ms，頻率13 Hz，刺激時間60 s，間隔10 min，共刺激3次[6]。記錄小鼠陰莖勃起時海綿體內(nèi)壓最大值（ICPmax）。在電刺激之前用Visitech Systems BP-2000無創(chuàng)尾壓測量系統(tǒng)檢測兩組小鼠血壓[7]。計算ICPmax/平均系統(tǒng)血壓（MSBP）。

1.2.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行分析，實驗所得計量數(shù)據(jù)以[AKx-D]±s表示，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

實驗組小鼠體質(zhì)量明顯低于對照組、隨機血糖和空腹血糖顯著高于對照組（t=13.40～35.70，P<0.05），而兩組血壓比較差異無顯著性（P>0.05）。見表1。兩組MSBP比較差異無顯著性（P>0.05）。給予小鼠電刺激后，海綿體內(nèi)壓迅速升高，持續(xù)電刺激期間，壓力先是迅速增加，然后進入平臺期，增加的幅度減弱，電刺激60 s時壓力達到最大值，停止電刺激，壓力迅速降低，恢復到基礎值左右。每組小鼠3次電刺激測量的ICPmax和ICPmax/MBSP差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而兩組組間每次測得的ICPmax和ICPmax/MBSP差異均有顯著意義（t=17.71～18.27，P<0.05）。見表2。

3 討論

ED是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，5型磷酸二酯酶（PDE5）抑制劑是目前治療ED的常用藥物，但其對糖尿病病人的有效率要遠低于非糖尿病病人[8]。其他治療如海綿體內(nèi)注射血管活性物質(zhì)、尿道內(nèi)栓劑、陰莖假體植入等方式[9]，能獲得一定效果，但均不理想。因此需要更深入地研究1型糖尿病ED的發(fā)病機制及探索有效的新治療方式。以病人為研究對象進行性功能研究因為受到倫理、道德、法律等限制，無法開展基礎實驗的研究，目前多是以動物模型作為實驗基礎[10]。因此，選擇合適的實驗對象建立1型糖尿病模型，并在此基礎上開展ED的生理、病理生理和藥理學等各方面的研究，是將實驗結果安全有效地外推到人體應用的保障。

在ED研究中，選擇合適的實驗動物需要考慮諸多因素，根據(jù)研究者的目的、動物成本、動物繁殖周期等因素，可以考慮貓、狗、兔、大鼠、猴等動物，小鼠近來也用于研究[11]。目前國內(nèi)最常用來研究糖尿病及其并發(fā)癥的實驗動物是大鼠，因為其具有抗感染能力強、繁殖快、易飼養(yǎng)、相對經(jīng)濟等優(yōu)點[12]。但與小鼠相比，大鼠應用于實驗所需的耗材及試劑仍然相對較多，因此國內(nèi)外對于糖尿病性ED的實驗研究越來越多地選擇小鼠作為實驗對象。

糖尿病動物模型的構建方法主要有3種：實驗性糖尿病動物模型、自發(fā)性糖尿病動物模型和轉基因糖尿病動物模型[13]。其中自發(fā)性糖尿病動物模型因為繁殖飼養(yǎng)成本太高，其應用受到一定限制，而利用基因敲除技術制備的轉基因糖尿病動物模型還未廣泛應用，因此目前最常用的是實驗性糖尿病動物模型。最經(jīng)典的建立糖尿病動物模型的方法是腹腔或靜脈注射STZ，STZ通過特異性破壞動物胰島β細胞，引起胰島素合成釋放減少，進而導致動物血糖升高[14]。STZ引起β細胞死亡的機制主要為：①烷化胰島β細胞DNA鏈，使其斷裂;②烷化一些細胞內(nèi)的關鍵酶如ADP核糖體合成酶，導致ATP生成障礙，細胞內(nèi)ATP含量降低，從而引起β細胞死亡[15]。STZ的溶液制劑不穩(wěn)定，pH值在3.5～4.5范圍之外，放置在常溫環(huán)境中會迅速降解，因此最好是用檸檬酸緩沖液現(xiàn)配現(xiàn)用，并置于冰盒上，在盡可能短的時間內(nèi)完成操作。

目前常用的注射方式是靜脈注射和腹腔注射，前者注射難度相對較高，容易出現(xiàn)操作誤差，而腹腔注射易操作、準確、方便。程祎等[16]通過對比不同注射劑量的建模成功率和死亡率發(fā)現(xiàn)，STZ的注射劑量為60 mg/kg時，既能避免劑量過大引起器官損傷導致動物死亡，又能避免劑量過小而降低建模成功率、浪費實驗動物。

目前文獻報道的檢測、評價勃起功能的方法有陰莖海綿體測壓[17]、性行為直接觀察如阿撲嗎啡實驗[18]、勃起時肌電圖圖譜測量[19]、多普勒超聲檢測陰莖動脈血流變化[20]等。STEERS等[21]和CHEN等[22]分別以大鼠和小鼠為實驗對象成功測量了陰莖海綿體內(nèi)的壓力。對實驗動物勃起功能的檢測和[LL]評價要遵循客觀、準確、簡單易行的原則，通過電刺激誘導陰莖勃起測量陰莖海綿體內(nèi)壓力的方法，因為能通過換能器直接讀取海綿體內(nèi)的壓力，不受外界環(huán)境和實驗者主觀因素的影響，能夠客觀、公正地評價陰莖勃起功能，成為國內(nèi)外評價陰莖勃起功能的標準方法。SEZEN等[23]首次報道了以電刺激法測量海綿體內(nèi)壓，并獲得成功。

本實驗參考國外相關文獻的電刺激參數(shù)[5]，以C57BL6J小鼠為實驗對象，在STZ誘導糖尿病模型成功后8周，電刺激小鼠陰莖海綿體神經(jīng)，比較兩組小鼠的海綿體內(nèi)壓，結果顯示糖尿病小鼠較對照組明顯下降，與既往研究結果一致。在實驗操作過程中，我們的經(jīng)驗是：小鼠的體積較小，生理解剖肉眼難辨，需要借助解剖顯微鏡和顯微手術器械，以減少對周圍組織和臟器的損傷，減少操作過程中出血，避免失血過多對實驗數(shù)據(jù)產(chǎn)生影響;識別前列腺后外側的陰莖海綿體神經(jīng)時，可以用無菌棉球將周圍腸管推開，提供充分的操作空間。

本研究利用電刺激法測量小鼠陰莖海綿體內(nèi)壓，兩組均連續(xù)給予3次電刺激，間隔10 min，得到的勃起功能指標基本一致，無明顯變化，而兩組之間勃起功能指標比較差異有統(tǒng)計學意義。表明電刺激法能有效反映糖尿病小鼠與正常小鼠海綿體內(nèi)壓的差異，可以為1型糖尿病性ED提供評價的客觀依據(jù)?？傊?，電刺激法測量海綿體內(nèi)壓，應用于小鼠糖尿病模型中安全、可靠、可重復，是一種理想的評價勃起功能的方法。

[參考文獻]

[1]NIH Consensus Conference. Impotence. NIH consensus deve-lopment panel on impotence[J]. JAMA， 1993，270（1）：83-90.

[2]JOHANNES C B， ARAUJO A B， FELDMAN H A， et al. Incidence of erectile dysfunction in men 40 to 69 years old：longitudinal Results from the Massachusetts male aging study[J]. The Journal of Urology， 2000，163（2）：460-463.

[3]CHENG S K， PARK E Y， PEHAR A， et al. Current progress of human trials using stem cell therapy as a treatment for diabetes mellitus[J]. American Journal of Stem Cells， 2016，5（3）：74-86.

[4]MALAVIGE L S， LEVY J C. Erectile dysfunction in diabetes mellitus[J]. The Journal of Sexual Medicine， 2009，6（5）：1232-1247.

[5]JIN H R， KIM W J， SONG J S， et al. Functional and morphologic characterizations of the diabetic mouse corpus cavernosum：comparison of a multiple low-dose and a single high-dose streptozotocin protocols[J].?The Journal of Sexual Medicine， 2009，6（12）：3289-3304.

[6]JIN H R， CHUNG Y G， KIM W J， et al. A mouse model of cavernous nerve injury-induced erectile dysfunction：functional and morphological characterization of the corpus cavernosum[J]. Journal of Sexual Medicine， 2010，7（10）：3351-3364.

[7]KREGE J H， HODGIN J B， HAGAMAN J R， et al. A noninvasive computerized tail-cuff system for measuring blood pressure in mice[J]. Hypertension （Dallas，Tex.：1979）， 1995，25（5）：1111-1115.

[8]HIDALGO-TAMOLA J， CHITALEY K. Type 2 diabetes mellitus and erectile dysfunction[J]. Journal of Sexual Medicine， 2009，6（4）：916-926.

[9]BURNETT A L. Erectile dysfunction management for the future[J]. Journal of Andrology， 2009，30（4）：391-396.

[10]BURNETT A L. General use of animal models for investigation of the physiology of erection[J]. International Journal of Impotence Research， 2001，13（3）：135-139.

[11]ANDERSSON K E. Penile erectile function：recommendations for future research[J]. International Journal of Impotence Research， 2000，12（Suppl 4）：S163-S167.

[12]MEHTA N， SIKKA S， RAJASEKARAN M. Rat as an animal model for male erectile function evaluation in sexual medicine research[J]. The Journal of Sexual Medicine， 2008，5（6）：1278-1283.

[13]潘衛(wèi)兵，曹石金，謝禮仁，等. 大鼠糖尿病性勃起功能障礙模型的制備[J]. 海南醫(yī)學， 2015，26（5）：629-631.

[14]ELABBADY A A， GAGNON C， HASSOUNA M M， et al. Diabetes mellitus increases nitric oxide synthase in penises but not in major pelvic ganglia of rats[J]. British Journal of Urology， 1995，76（2）：196-202.

[15]PETTEPHER C C， LEDOUX S P， BOHR V A， et al. Repair of alkali-labile sites within the mitochondrial DNA of RINr 38 cells after exposure to the nitrosourea streptozotocin[J]. The Journal of Biological Chemistry， 1991，266（5）：3113-3117.

[16]程祎，韋安陽，李煜罡. 糖尿病性勃起功能障礙大鼠模型的建立[J]. 南方醫(yī)科大學學報， 2008，28（4）：564-566.

[17]LEWIS J E， WALKER D F， BECKETT S D， et al. Blood pressure within the corpus cavernosum penis of the bull[J]. Journal of Reproduction and Fertility， 1968，17（1）：155-156.

[18]GOWER A J， BERENDSEN H G， PRINCEN M M， et al. The yawning-penile erection syndrome as a model for putative dopamine autoreceptor activity[J]. European Journal of Pharmacology， 1984，103（1/2）：81-89.

[19]MIURA T， KONDO Y， AKIMOTO M， et al. Electromyography of male rat perineal musculature during copulatory behavior[J]. Urologia Internationalis， 2001，67（3）：240-245.

[20]PARK K， SON H， KIM S W， et al. Initial validation of a novel rat model of vasculogenic erectile dysfunction with genera-lized atherosclerosis[J]. International Journal of Impotence Research， 2005，17（5）：424-430.

[21]STEERS W D， MALLORY B， DE GROAT W C. Electrophysiological study of neural activity in penile nerve of the rat[J]. The American Journal of Physiology， 1988，254（6 Pt 2）：R989-R1000.

[22]CHEN K K， CHAN J Y， CHANG L S， et al. Intracavernous pressure as an experimental index in a rat model for the eva-luation of penile erection[J]. The Journal of Urology， 1992，147（4）：1124-1128.

[23]SEZEN S F， BURNETT A L. Intracavernosal pressure monitoring in mice：responses to electrical stimulation of the caver-nous nerve and to intracavernosal drug administration[J]. Journal of Andrology， 2000，21（2）：311-315.

（本文編輯 馬偉平）