蒙成　梁慶平　黃艷花　吳地　蔣益敏　吳烈

摘要：【目的】研究不同谷物粒培養(yǎng)基配方及其培養(yǎng)條件對(duì)玉米小斑病菌產(chǎn)孢量的影響，為玉米小斑病大面積抗病鑒定工作提供保障?！痉椒ā恳杂衩仔“卟【吧途闔X5為試材，探索18種植物組織培養(yǎng)基、9個(gè)溫度梯度、9個(gè)培養(yǎng)時(shí)間段、7種高低溫誘導(dǎo)和5種不同光照等條件對(duì)玉米小斑病菌分生孢子產(chǎn)量的影響?！窘Y(jié)果】培養(yǎng)基的成分組合對(duì)玉米小斑病菌分生孢子產(chǎn)生起決定性作用，配方為高粱粒100 g+玉米葉15 g+MgSO4 0.2 g+Na3PO4 0.2 g的7號(hào)培養(yǎng)基產(chǎn)孢量最多，為16.8×104 個(gè)/g;24 ℃條件下培養(yǎng)產(chǎn)孢量最多;在20和24 ℃黑暗條件下，培養(yǎng)35 d時(shí)的產(chǎn)孢量最多;35 ℃高溫、4 ℃低溫誘導(dǎo)對(duì)玉米小斑病菌產(chǎn)孢量均有一定的促進(jìn)作用，但經(jīng)高、低溫誘導(dǎo)后產(chǎn)生的部分分生孢子一端連接1節(jié)分生孢子梗;光暗交替各12 h、光照強(qiáng)度為2000 lx的產(chǎn)孢量最多，為4.6×105個(gè)/g?！窘Y(jié)論】高粱粒100 g+玉米葉15 g+MgSO4 0.2 g+Na3PO4 0.2 g為玉米小斑病菌產(chǎn)孢最佳培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基可顯著促進(jìn)病菌產(chǎn)生分生孢子;在24 ℃、光照強(qiáng)度2000 lx光暗交替各12 h的培養(yǎng)條件下，病菌的產(chǎn)孢量最多;在35 d內(nèi)培養(yǎng)病菌，培養(yǎng)時(shí)間與產(chǎn)孢量成正比;35 ℃高溫和4 ℃低溫誘導(dǎo)對(duì)產(chǎn)孢量均有一定的促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞： 玉米;小斑病菌;接種體;產(chǎn)孢技術(shù)

中圖分類號(hào)： S432.4 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）05-1001-06

Abstract：【Objective】The aim was to investigate the effects of different grain medium formulations and culture conditions on sporulation of Bipolaria maydis， and provide a guarantee for large-scale identification of resistance to southern corn leaf blight. 【Method】The effects of eighteen plant tissue-based media， nine temperature gradients， nine culture times， seven high and lowtemperature inductions and five different light intensities on conidium formation of wild-type strain HX5 of B. maydis were studied. 【Result】Component combinations of media played a decisive role in conidium formation. Medium No.7 containing 100 g sorghum grains + 15 g corn leaves + 0.2 g MgSO4 + 0.2 g Na3PO4 showed the highest sporulation（16.8×104 spore/g）. Under 24 ℃， the sporulation was the highest. Under darkness at 20 and 24 ℃， sporulation reached the peak on day 35. Induction at 35 and 4 ℃ promoted sporulation of B. maydis to a certain extent. However， after high and lowtemperature induction， one end of partial formed conidia connected to a conidial peduncle. Under light-dark 12 h alternation and light intensity of 2000 lx， sporulation was the highest（4.6×105 spore/g）. 【Conclusion】The optimal medium for sporulation of B. maydis is 100 g sorghum grains+15 g corn leaves+0.2 g MgSO4+0.2 g Na3PO4， which can significantly promote the conidium formation of B. maydis. Under 24 ℃， light intensity of 2000 lx and light-dark 12 h alternation， the sporulation is the highest. Within 35 d， the culture time is proportional to sporulation. Induction at 35 and 4 ℃ promote sporulation of B. maydis to a certain extent.

Key words： corn; Bipolaria maydis; inoculums; sporulation technology

0 引言

【研究意義】玉米小斑?。⊿outhern corn leaf blight，SCLB）是世界玉米主產(chǎn)區(qū)的重要病害（陳利峰，2002），是我國(guó)溫暖潮濕玉米產(chǎn)區(qū)的主要葉部病害（趙聚瑩等，2010），在玉米全生育期均可發(fā)生，發(fā)病高峰期在植株抽雄后。自20世紀(jì)60年代以來(lái)，隨著我國(guó)感病玉米雜交品種的推廣應(yīng)用，玉米小斑病危害日趨嚴(yán)重，感病品種在一般發(fā)病年份可減產(chǎn)10%以上，嚴(yán)重發(fā)生年份減產(chǎn)20%～30%（龔現(xiàn)麗，2010）。因此，選育抗病自交系和雜交種是防治玉米小斑病最經(jīng)濟(jì)有效的措施（李洪連和徐敬友，2001;董懷玉等，2005;艾堂順等，2018）。在選育與利用抗病品種過(guò)程中，開展玉米小斑病抗病性鑒定是常規(guī)工作，其常用方法是將培養(yǎng)好的帶菌接種體植入玉米喇叭口中或用病菌孢子懸浮液對(duì)玉米植株進(jìn)行噴霧。因此，進(jìn)行大田抗病性鑒定接種需要大量的接種體，而獲得帶大量分生孢子的接種體或獲得大量分生孢子是順利開展玉米小斑病抗病性接種鑒定的基礎(chǔ)條件?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在不同營(yíng)養(yǎng)及培養(yǎng)環(huán)境條件下，病菌分生孢子產(chǎn)孢效果存在明顯差異。陳穎等（2003）采用燕麥、玉米、查理、彼查、PDA及PDA+宿主葉片、PDA+VB1等7種固體培養(yǎng)基培養(yǎng)玉米小斑病菌C小種，結(jié)果表明，PDA+VB1和PDA+宿主葉片2種培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株，其菌絲生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢量和致病力均顯著高于其他培養(yǎng)基。謝紅輝（2010）研究不同培養(yǎng)溫度、不同培養(yǎng)pH和不同營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)玉米小斑病病菌菌絲生長(zhǎng)量及產(chǎn)孢量的影響，結(jié)果表明，以PDA+VB1為固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲生長(zhǎng)速率及產(chǎn)孢量最大，在30 ℃下培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)速率快且產(chǎn)孢量大，在25 ℃下培養(yǎng)病菌孢子萌發(fā)速度最快，病菌菌絲在pH為8的條件下生長(zhǎng)速度最快且生長(zhǎng)量最大。楊麗敏（2012）采用不同保存方法測(cè)定玉米小斑病菌產(chǎn)孢量、菌絲生長(zhǎng)速度及對(duì)菌株致病力的影響，結(jié)果表明，保存玉米小斑病菌菌株時(shí)，用大麥作固體培養(yǎng)基，濕度為10%左右，置于5 ℃冰箱短時(shí)間（1個(gè)月）或長(zhǎng)時(shí)間（7個(gè)月）保存，菌絲生長(zhǎng)速度和產(chǎn)孢量最佳，均優(yōu)于玉米培養(yǎng)基和小麥培養(yǎng)基，且菌株致病力得到較好地保持。代玉立等（2016）以福建省建甌、沙縣和福州地區(qū)的3株玉米小斑病菌菌株為對(duì)象，研究溫度、濕度、pH、光照、營(yíng)養(yǎng)對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響，結(jié)果表明，菌絲生長(zhǎng)最適溫度和pH為30 ℃和pH 6、產(chǎn)孢最適溫度和pH為25 ℃和pH 6～7、孢子萌發(fā)最適溫度和pH為25～28 ℃和pH 6，光照能顯著抑制病菌產(chǎn)孢，在相對(duì)濕度為85%和95%條件下或在水瓊脂培養(yǎng)基表面上，孢子萌發(fā)率分別為50%、88%和90%;葡萄糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉適宜病菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，而尿素、硫酸銨、硝酸銨和氯化銨能顯著抑制菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā);菌絲體的致死溫度為65 ℃ 10 min或60 ℃ 30 min，分生孢子的致死溫度為60 ℃ 10 min或55 ℃ 30 min;3株菌株的產(chǎn)孢特性、菌絲致死溫度和致病力均存在明顯差異。以高粱粒為主料配制成的固體培養(yǎng)基是目前玉米小斑病菌繁殖常用的培養(yǎng)基（王曉鳴等，2010）。馮勝澤等（2017）用高粱粒外的其他固體培養(yǎng)基進(jìn)行病菌產(chǎn)孢試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)孢量最大的培養(yǎng)條件為玉米葉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，碳源為乳糖，培養(yǎng)溫度25 ℃、pH 8、光照強(qiáng)度6000 lx、光照條件光暗交替各12 h;此外，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加 KNO3可顯著提高產(chǎn)孢量。楊秀娟等（2018）發(fā)明“一種玉米小斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基及其制備方法和應(yīng)用”專利，該方法利用馬鈴薯、甘露醇、瓊脂粉和水為固體培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)孢試驗(yàn)，其病菌產(chǎn)孢量是等量PDA培養(yǎng)基產(chǎn)孢量的1.2～3.6倍?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人開展玉米小斑病接種鑒定時(shí)，接種體繁殖通常采用固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，操作過(guò)程繁瑣，不能直接用帶病菌的接種體進(jìn)行接種;同時(shí)，開展大面積抗病性鑒定時(shí)工作量大，操作過(guò)程制備的接種體通常存在污染率高、滋長(zhǎng)小昆蟲、制備慢且產(chǎn)孢效果不理想等缺點(diǎn)。目前，利用谷物粒培養(yǎng)基培養(yǎng)玉米小斑病菌及產(chǎn)孢因素的研究報(bào)道較少。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以高粱粒、小麥粒和玉米粒為主要材料，以玉米葉、甘露醇（C6H14O6）、碳酸鉀（K2CO2）、硫酸鎂（MgSO4）和磷酸鈉（Na3PO4）等為配料，單因素組配18種培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，同時(shí)對(duì)培養(yǎng)時(shí)間、溫度、光照、高低溫誘導(dǎo)等影響玉米小斑病菌產(chǎn)孢因素進(jìn)行探討，明確影響玉米小斑病菌產(chǎn)孢最佳谷物粒培養(yǎng)基配方及其培養(yǎng)方法，為玉米小斑病抗病性鑒定工作的簡(jiǎn)化性、時(shí)效性、準(zhǔn)確性提供保障。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 供試菌株 玉米小斑病菌野生型菌株HX5采集于廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院作物研究所玉米試驗(yàn)地感病病株并分離獲得，采用常規(guī)方法進(jìn)行病原菌分離與培養(yǎng)，用單細(xì)胞進(jìn)行純化，參照柯赫氏法則進(jìn)行病菌驗(yàn)證，最終獲得純化菌株（方中達(dá)，1998）。

1. 1. 2 供試培養(yǎng)基 以玉米粒、小麥粒和高粱粒為主料，以玉米葉、C6H14O6、K2CO2、MgSO4、Na3PO4等為配料，單因素組配18種培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基（表1）。制作方法步驟：（1）挑選大小一致、無(wú)病蟲的玉米粒、小麥粒和高粱粒。（2）玉米粒浸泡12～15 h，大火煮沸溫火熬制1 h，水洗瀝干備用;小麥粒浸泡20 min，大火煮沸再溫火煮15 min，水洗瀝干備用;高粱粒大火煮沸再溫火煮25 min，水洗瀝干備用;新鮮玉米葉切成約1 cm2大小備用。（3）按配方稱取原料并混勻，濕度以培養(yǎng)基濕潤(rùn)手握無(wú)滴水為度。（4）用300 mL三角瓶分裝配好的培養(yǎng)基，每瓶定量分裝100 g。（5）將制作好的培養(yǎng)瓶121 Pa高壓滅菌45 min。

1. 2 不同培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)孢量的影響

1. 2. 1 培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)孢量的影響 供試培養(yǎng)基為單因素組配的18種培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基配方為一個(gè)處理，3次重復(fù)。供試菌種在培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上繁殖，待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后，用鑷子把帶菌絲的培養(yǎng)基割成小粒，每皿菌種平均分別接種到2份供試培養(yǎng)基上（下同）。接種并搖均后的培養(yǎng)瓶置于全黑暗、24 ℃恒溫人工氣候箱中培養(yǎng)11 d，測(cè)定產(chǎn)孢量。

1. 2. 2 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)孢量的影響 供試培養(yǎng)基為7號(hào)培養(yǎng)基（高粱粒100 g+玉米葉15 g+MgSO4 0.2 g+Na3PO4 0.2 g），設(shè)9個(gè)溫度梯度（12、16、20、24、26、28、32、36和40 ℃），黑暗培養(yǎng)11 d（劉靜等，2014），3次重復(fù)。設(shè)A、B兩個(gè)因素：A因素為接種后帶培養(yǎng)基瓶直接分別放入各溫度培養(yǎng)11 d后測(cè)定產(chǎn)孢量;B因素為接種后帶培養(yǎng)基瓶放入26 ℃全黑暗下培養(yǎng)5 d，菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)入各溫度中繼續(xù)培養(yǎng)，6 d后測(cè)定產(chǎn)孢量。

1. 2. 3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)孢量的影響 供試培養(yǎng)基為7號(hào)培養(yǎng)基，接種處理后的培養(yǎng)瓶分別置于20和24 ℃黑暗條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，依次于第5、7、9、11、15、20、25、30和35 d 9個(gè)培養(yǎng)時(shí)間段測(cè)定產(chǎn)孢量，3次重復(fù)。

1. 2. 4 高、低溫誘導(dǎo)對(duì)產(chǎn)孢量的影響 供試培養(yǎng)基為7號(hào)培養(yǎng)基，把接種后的培養(yǎng)基瓶放入26 ℃全黑暗下培養(yǎng)5 d，菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)入各高、低溫進(jìn)行誘導(dǎo)處理，處理結(jié)束后置于24 ℃黑暗條件，誘導(dǎo)時(shí)間加繼續(xù)培養(yǎng)共11 d，測(cè)定產(chǎn)孢量。設(shè)7個(gè)處理：4 ℃ 12 h、4 ℃ 24 h、4 ℃ 48 h、35 ℃ 12 h、35 ℃ 24 h、35 ℃ 48 h和對(duì)照（26 ℃全黑暗下培養(yǎng)5 d后直接轉(zhuǎn)入24 ℃黑暗培養(yǎng)6 d）（張立杰等，2015），3次重復(fù)。

1. 2. 5 光照對(duì)產(chǎn)孢量的影響 供試培養(yǎng)基為7號(hào)培養(yǎng)基，設(shè)5種不同光照處理，分別為：24 h光照（光照強(qiáng)度3000 lx）、12 h光照（3種不同光照強(qiáng)度梯度1500、2000和3000 lx ）12 h黑暗和24 h黑暗，病菌在不同光照處理下24 ℃恒溫培養(yǎng)11 d（馮勝澤等，2017）。

1. 3 產(chǎn)孢量測(cè)定方法

各處理隨機(jī)取帶病菌接種體2 g，置于50 mL的燒杯中，加無(wú)菌水10 mL，為確保帶病菌接種體所產(chǎn)生的分生孢子脫落水里，用堅(jiān)固勺子連續(xù)攪拌約100次，紗布過(guò)濾即得到玉米小斑病菌孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)法測(cè)定孢子懸浮液濃度，計(jì)算產(chǎn)孢量，每個(gè)培養(yǎng)瓶取樣3次，每個(gè)樣本讀數(shù)3次，取平均值進(jìn)行比較。

1. 4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2007和DPS 7.55進(jìn)行整理與分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 培養(yǎng)基對(duì)玉米小斑病菌產(chǎn)孢量的影響

由圖1可知，除17、16和5號(hào)培養(yǎng)基產(chǎn)胞量低于1號(hào)培養(yǎng)基（CK）外，其余培養(yǎng)基的產(chǎn)胞量均顯著高于CK（P<0.05，下同），其中，7號(hào)培養(yǎng)基（高粱粒100 g+玉米葉15 g+MgSO4 0.2 g+Na3PO4 0.2 g）的產(chǎn)孢量最多，為16.8×104個(gè)/g;9號(hào)培養(yǎng)基（玉米粒100 g+玉米葉15 g+MgSO4 0.2 g+ Na3PO4 0.2 g）次之，產(chǎn)孢量為10.8×104個(gè)/g;其后依次為13、11、14、2、6、3、4、8、15、18、12和10號(hào)培養(yǎng)基;常用高粱粒培養(yǎng)基（CK）的產(chǎn)孢量為6.8×103個(gè)/g，17號(hào)培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量與CK相當(dāng)，差異不顯著（P>0.05，下同），而16和5號(hào)培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量顯著少于CK，分別為2.2×103和5.4×102個(gè)/g。可見(jiàn)，玉米小斑病菌在7號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)孢量最多。

2. 2 培養(yǎng)溫度對(duì)玉米小斑病菌產(chǎn)孢量的影響

由圖2可知，不同培養(yǎng)溫度對(duì)玉米小斑病菌產(chǎn)孢量具有明顯影響，過(guò)高或過(guò)低均不利于玉米小斑病菌分生孢子的產(chǎn)生，其中，A因素多集中于20～26 ℃產(chǎn)孢，24 ℃時(shí)產(chǎn)孢量最多，且顯著多于其他溫度處理，≤12 ℃或≥32 ℃均不產(chǎn)孢;B因素在溫度為12～40 ℃下均可產(chǎn)生分生孢子，26 ℃時(shí)產(chǎn)孢量顯著高于其他溫度處理，24 ℃時(shí)的產(chǎn)孢量次之。可見(jiàn)，玉米小斑病菌分生孢子產(chǎn)生的最適宜溫度為24 ℃，最佳方法是將接種后的培養(yǎng)瓶直接置于24 ℃下培養(yǎng)。

2. 3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)玉米小斑病菌產(chǎn)孢量的影響

從圖3可看出，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)玉米小斑病菌產(chǎn)孢具有明顯影響。玉米小斑病菌在20 ℃黑暗條件下培養(yǎng)11 d開始產(chǎn)孢，在11～35 d內(nèi)，產(chǎn)孢量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加;在24 ℃黑暗條件培養(yǎng)9 d開始產(chǎn)孢，在9～35 d內(nèi)，產(chǎn)孢量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加?？梢?jiàn)，在20和24 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間與產(chǎn)孢量成正比，該病菌連續(xù)培養(yǎng)35 d產(chǎn)孢量最多。

2. 4 高、低溫誘導(dǎo)對(duì)玉米小斑病菌產(chǎn)孢量的影響

由圖4可知，4 ℃冷凍24 h處理的產(chǎn)孢量顯著高于其他處理，為4.2×105個(gè)/g;35 ℃熱激24 h處理的效果次之，產(chǎn)孢量為3.5×105個(gè)/g;35 ℃熱激48 h和4 ℃冷凍12 h處理的產(chǎn)孢量與35 ℃熱激24 h處理的產(chǎn)孢量相當(dāng)，差異不顯著;4 ℃冷凍48 h和35 ℃熱激12 h處理的產(chǎn)孢量與對(duì)照差異不顯著。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高、低溫誘導(dǎo)后產(chǎn)生的部分分生孢子一端有連接1節(jié)分生孢子?，F(xiàn)象。

2. 5 光照對(duì)玉米小斑病菌產(chǎn)孢量的影響

從圖5可看出，適量光照對(duì)玉米小斑病菌產(chǎn)孢具有促進(jìn)作用，過(guò)暗或過(guò)亮均不利于該病菌產(chǎn)孢。其中，高強(qiáng)度光照即連續(xù)24 h光照最不利于產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量?jī)H為1.4×105個(gè)/g;連續(xù)24 h黑暗亦不利于產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量為1.9×105個(gè)/g;12 h光照（光照強(qiáng)度2000 lx）12 h黑暗條件下的產(chǎn)孢量最多，為4.6×105個(gè)/g;12 h光照（光照強(qiáng)度1500 lx）12 h黑暗條件下的產(chǎn)孢量次之，為3.3×105個(gè)/g;12 h光照（光照強(qiáng)度3000 lx）12 h黑暗條件會(huì)抑制病菌分生孢子產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量為2.5×105個(gè)/g。

3 討論

方中達(dá)（1998）認(rèn)為培養(yǎng)基是影響病菌產(chǎn)孢的最重要因素，促進(jìn)分生孢子產(chǎn)生的最主要途徑是采用不同培養(yǎng)基或改變培養(yǎng)基成分;劉麗麗等（2014）認(rèn)為培養(yǎng)基不同會(huì)明顯影響多數(shù)茄鏈格孢產(chǎn)孢量。為此，前人開展了大量有關(guān)培養(yǎng)基促進(jìn)產(chǎn)孢量的研究工作。莊義慶等（2008）研究表明，促進(jìn)蕉斑鐮刀菌液體搖瓶產(chǎn)孢的最佳培養(yǎng)液為綠豆湯培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液在適宜條件下的產(chǎn)孢量達(dá)1×106個(gè)/mL;趙紅等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，蘋果腐爛病菌在加蜂蜜水和蛋白胨的帶殼大麥上能大量產(chǎn)孢;蘭成忠等（2013）認(rèn)為胡蘿卜培養(yǎng)基是促進(jìn)辣椒疫霉菌產(chǎn)生孢子囊數(shù)量最多的培養(yǎng)基。本研究通過(guò)18種不同配方的谷物粒培養(yǎng)基對(duì)玉米小斑病菌進(jìn)行產(chǎn)孢誘導(dǎo)篩選，結(jié)果表明，產(chǎn)孢量最多的培養(yǎng)基是配方為高粱粒100 g+玉米葉15 g+MgSO4 0.2 g+Na3PO4 0.2 g的7號(hào)培養(yǎng)基，產(chǎn)孢量為16.8×104個(gè)/g，其次是配方為玉米粒100 g+玉米葉15 g+MgSO4 0.2 g+Na3PO4 0.2 g的9號(hào)培養(yǎng)基，產(chǎn)孢量為10.8×104 個(gè)/g，說(shuō)明7和9號(hào)培養(yǎng)基配方適宜玉米小斑病菌產(chǎn)孢。王曉梅等（2007）研究表明，玉米小斑病菌產(chǎn)孢適宜溫度為20～30 ℃，最適溫度為26 ℃，5 ℃以下或35 ℃以上均不能產(chǎn)孢;代玉立等（2016）研究表明，玉米小斑病菌產(chǎn)孢最適溫度為25 ℃。本研究發(fā)現(xiàn)，在12 ℃以下或32 ℃以上時(shí)玉米小斑病病原菌菌絲體生長(zhǎng)緩慢，不能產(chǎn)孢;16～28 ℃時(shí)病原菌菌絲生長(zhǎng)速度快，能產(chǎn)孢;20～26 ℃時(shí)病原菌產(chǎn)孢量迅速增加，24 ℃下產(chǎn)孢量最多;長(zhǎng)菌絲后的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入各溫度中進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)均可產(chǎn)孢，26 ℃產(chǎn)孢量最高，24 ℃次之。說(shuō)明玉米小斑病菌的菌絲生長(zhǎng)溫度條件高于分生孢子產(chǎn)生的條件，菌絲一但生成，在較高和較低溫度條件下均能產(chǎn)生分生孢子，可能是玉米小斑病菌能在全世界玉米產(chǎn)區(qū)發(fā)生的重要原因。

本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)玉米小斑病菌產(chǎn)孢量具有明顯影響，在7號(hào)培養(yǎng)基上，病菌在20和24 ℃黑暗條件下的產(chǎn)孢量與培養(yǎng)時(shí)間成正比，該病菌連續(xù)培養(yǎng)35 d時(shí)產(chǎn)孢量最多。玉米小斑病菌在其余配方的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間與產(chǎn)孢量是否也成正比尚有待進(jìn)一步研究。此外，本研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)35 d后容易滋生雜菌，因此未繼續(xù)培養(yǎng)。這是否與培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或生長(zhǎng)環(huán)境等因素有關(guān)，尚有待進(jìn)一步探究。

本研究發(fā)現(xiàn)35 ℃高溫和4 ℃低溫誘導(dǎo)對(duì)玉米小斑病菌產(chǎn)孢量均有一定的促進(jìn)作用，但經(jīng)過(guò)高、低溫誘導(dǎo)后產(chǎn)生的部分分生孢子一端連接1節(jié)分生孢子梗，對(duì)分生孢子的活性是否產(chǎn)生影響也有待進(jìn)一步探究。此外，適量光照對(duì)玉米小斑病菌產(chǎn)孢具有促進(jìn)作用，過(guò)暗或過(guò)亮均不利于該病菌產(chǎn)孢。7號(hào)培養(yǎng)基在12 h光照12 h黑暗交替且光照強(qiáng)度為2000 lx時(shí)的產(chǎn)孢量最多，與前人研究認(rèn)為光照能顯著抑制病菌產(chǎn)孢的結(jié)果（陳利峰，2002）存在差異，需進(jìn)一步通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

玉米小斑病菌產(chǎn)孢的最佳組織培養(yǎng)基配方為高粱粒100 g+玉米葉15 g+MgSO4 0.2 g+Na3PO4 0.2 g，該培養(yǎng)基可顯著促進(jìn)病菌產(chǎn)生分生孢子;該培養(yǎng)基在24 ℃、光照強(qiáng)度2000 lx光暗交替各12 h時(shí)產(chǎn)孢量最多;在35 d內(nèi)培養(yǎng)病菌，培養(yǎng)時(shí)間與產(chǎn)孢量成正比;35 ℃高溫、4 ℃低溫誘導(dǎo)對(duì)病菌產(chǎn)孢量均有一定的促進(jìn)作用，但誘導(dǎo)后產(chǎn)生的部分分生孢子形態(tài)發(fā)生改變。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）