申建梅　汪超　鐘宏新　胡黎明

摘要：【目的】分析斜紋夜蛾蛋白二硫鍵異構(gòu)酶基因（SlitPDI）的序列特征和發(fā)育表達模式，為解析SlitPDI蛋白在斜紋夜蛾生長發(fā)育過程中的生理功能提供依據(jù)?！痉椒ā坎捎肈NASTAR對SlitPDI基因序列特征和進化關(guān)系進行分析，并以實時熒光定量PCR研究SlitPDI基因在斜紋夜蛾2齡、4齡、6齡幼蟲及蛹和新羽化雌、雄成蟲共6個不同發(fā)育時期的相對表達量?！窘Y(jié)果】SlitPDI基因編碼494個氨基酸，預測該蛋白分子量約55.3 kD，理論等電點（pI）為4.52。氨基酸序列分析結(jié)果表明，SlitPDI蛋白序列具有PDI家族的典型特征：在序列的N端及C端均具有二硫鍵/巰基氧化還原位點-CGHC-。系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結(jié)果表明，SlitPDI蛋白與意大利蜜蜂（Apis mellifera）的PDI蛋白序列一致性最低，為50.2%;與家蠶（Bombyx mori）的PDI蛋白序列一致性最高，為83.4%。斜紋夜蛾不同發(fā)育時期的實時熒光定量PCR分析結(jié)果表明，SlitPDI基因在4齡幼蟲中的表達量最高，其表達量是基準含量2齡幼蟲的1.27倍;在剛羽化雌、雄成蟲的表達量也較高，分別為基準含量2齡幼蟲的1.03和1.12倍?！窘Y(jié)論】SlitPDI蛋白屬于I類PDI家族蛋白，SlitPDI基因在斜紋夜蛾4齡幼蟲和新羽化成蟲中的表達量相對較高。

關(guān)鍵詞： 斜紋夜蛾;二硫鍵異構(gòu)酶;實時熒光定量PCR;表達模式

圖文分類號： S433.4;Q966 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）05-0996-05

Abstract：【Objective】The sequence characteristics and developmental expression patterns of Spodoptera litura protein disulfide isomerase（SlitPDI） were analyzed to provide reference for the study of the physiological function of SlitPDI protein during S. litura growth. 【Method】The sequence characteristics and evolutionary relationship of SlitPDI gene was analyzed by DNAstar software. The relative expression levels of SlitPDI gene in the stages of the 2nd， 4th， 6th instar larvae， pupa， newly emerged male and female adults were investigated by real-time fluorescence quantitative PCR method. 【Result】The SlitPDI gene encoded 494 amino acids with an estimated molecular mass of 55.3 kD， and the theoretical isoelectric point（pI） was 4.52. Amino acid sequence analysis showed that the SlitPDI protein sequence had the typical characteristics of the PDI protein family： it had disulfide bond/sulfhydryl reduction-oxidation site CGHC at the N-terminus and C-terminus of the sequence. Phylogenetic analysis indicated that SlitPDI protein had the lowest sequence identity（50.2%） with the PDI protein sequence of Apis mellifera， and it had the highest sequence identity（83.4%） with the PDI protein sequence of Bombyx mori. Real-time fluorescence quantitative PCR analysis showed that the expression level of SlitPDI in the 4th instar larva reached the highest peak， and the amount was as 1.27 times as that in the 2nd instar larva. The expressions of the newly emerged male and female larvae were also high， which were as 1.03 and 1.12 times as that in the 2nd instar larva respectively. 【Conclusion】The SlitPDI protein belongs to the class I PDI family protein， and the SlitPDI gene is expressed relatively high in the 4th instar larvae and newly emerged adults of S. litura.

Key words： Spodoptera litura; disulfide isomerase; real-time fluorescence quantitative PCR; expression pattern

0 引言

【研究意義】斜紋夜蛾（Spodoptera litura）是一種食性雜、繁殖力強的鱗翅目夜蛾科害蟲，其可危害300多種植物，對農(nóng)作物的種植經(jīng)濟效益造成嚴重影響（張南等，2016;張麗麗等，2018）?；瘜W防治在斜紋夜蛾的防治中一直占據(jù)主導地位，勢必引起斜紋夜蛾對多種化學藥劑產(chǎn)生嚴重的抗藥性（聶南生等，2007;桑松等，2013;Armes et al.，2015），致使化學藥劑的防治效果明顯下降，導致農(nóng)戶過度濫用化學藥劑而影響作物的綠色生產(chǎn)。因此，尋找新的藥物作用靶標將成為防治斜紋夜蛾的新途徑。蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（Protein disulfide isomerase，PDI）是一個多功能蛋白，其不僅參與蛋白二硫鍵的形成、蛋白折疊及翻譯后修飾等過程（Wilkinson and Gilbert， 2004），還可作為分子伴侶抑制錯誤折疊蛋白的聚集，幫助蛋白重新正確折疊（Puig and Gilbert，1994）。因此，以PDI蛋白為藥物作用靶標可為斜紋夜蛾的防治提供新思路?！厩叭搜芯窟M展】PDI可促進蛋白二硫鍵的形成和催化配對錯誤二硫鍵的重排，進而穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，屬于蛋白二硫鍵/巰基氧化還原蛋白超家族（Hatahet and Ruddock，2009）。Goo等（2002）報道，PDI在家蠶（Bombyx mori）抵御細菌入侵過程中起到重要作用。Bourchookarn等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，受黃頭病毒（YHV）感染后，斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）體內(nèi)的PDI表達量明顯提高。李燕等（2013）利用實時熒光定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)在萊氏野村菌的誘導下，斜紋夜蛾P(guān)DI表達量顯著上調(diào)。可見，PDI是一種應(yīng)激蛋白，對病毒、細菌的侵染具有防御功能。此外，Hu等（2010）在桔小實蠅化學感受蛋白（Chemosensory proteins，CSPs）互作蛋白的篩選中發(fā)現(xiàn)PDI與CSP具有一定的親和性，推測其可能參與昆蟲化學感受蛋白中二硫鍵的形成，并在昆蟲生命活動中扮演著重要角色。【本研究切入點】PDI不僅可修飾重要的功能蛋白結(jié)構(gòu)，還可防御病毒、細菌等外來生物的侵染。因此，以斜紋夜蛾P(guān)DI蛋白為藥物作用靶標來設(shè)計藥物，可有效干擾斜紋夜蛾一些重要功能蛋白的正確折疊或降低其對外來生物的抵御能力，為斜紋夜蛾的防控提供新策略。但目前關(guān)于斜紋夜蛾P(guān)DI蛋白其他生理功能的報道相對較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以斜紋夜蛾為試驗材料，定量比較從幼蟲到新羽化成蟲等不同發(fā)育時期斜紋夜蛾蛋白二硫鍵異構(gòu)酶基因（SlitPDI）的mRNA表達量變化模式，以期解析SlitPDI蛋白在斜紋夜蛾發(fā)育過程中的生理功能，為斜紋夜蛾的行為調(diào)控提供重要的作用靶標。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試昆蟲 斜紋夜蛾采集自廣州從化十字花科蔬菜田，于仲愷農(nóng)業(yè)工程學院植物保護實驗室內(nèi)繼代飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度26～27 ℃，相對濕度75%～80%，光周期L∶D=16 h∶8 h。

1. 1. 2 主要試劑 RNA提取試劑盒（R6834）和DNaseΙ購自廣州飛揚生物工程有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Ex Taq DNA聚合酶和熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex Taq II購自廣州瑞真生物工程有限公司。

1. 2 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

參照RNA提取試劑盒的操作說明提取斜紋夜蛾2齡、4齡、6齡幼蟲及蛹和雌雄成蟲（新羽化）6個不同發(fā)育時期的樣品總RNA，RNA質(zhì)量檢查合格后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此作為實時熒光定量PCR的模板，并貯存于-20 ℃冰箱備用。

1. 3 序列生物信息學分析

利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）對選取的21種昆蟲PDI蛋白序列進行同源性比對分析;使用DNASTAR的MegAlign程序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，并與SlitPDI蛋白序列進行進化關(guān)系分析。

1. 4 SlitPPDI基因表達分析

根據(jù)已登錄的SlitPDI（GenBank登錄號JX18 3988）和actin（GenBank登錄號KP331524）的序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計熒光定量特異性引物PDIQF（5'-TCCATCAAGCTGGCTAAGGT-3'）和PDIQR（5'-ATCAATAGGGCTGCCGTTC-3'）;actF（5'- TTCCCGACGGACAAGTCAT-3'）和actR（5'-GCATA CGGTCAGCAATACCAG-3'）。引物均由廣州英駿生物技術(shù)有限公司合成。

實時熒光定量PCR反應(yīng)體系25.0 μL：cDNA模板2.0 μL，SYBR預混液12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，滅菌超純水8.5 μL。擴增程序：94 ℃預變性30 s;94 ℃ 5 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 10 s，共進行35個循環(huán)。每個樣品重復3次，分別檢測目的基因和內(nèi)參基因的Ct值。

1. 5 統(tǒng)計分析

試驗采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量，再用SPSS 17.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 SlitPDI生物信息學分析結(jié)果

分析結(jié)果顯示，SlitPDI基因編碼494個氨基酸，預測該蛋白分子量約55.3 kD，理論等電點（pI）為4.52。將選取的昆蟲PDI蛋白與SlitPDI蛋白進行氨基酸序列一致性分析，結(jié)果（圖1）表明，4條不同目的昆蟲PDI蛋白具有較高的序列一致性，且序列中均包含2個-Cys-X-Y-Cys-（-CGHC-）位點，該位點是PDI蛋白序列的典型特征。

將SlitPDI基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與所選的21種昆蟲PDI蛋白序列進行同源性比對分析，并采用MegAlin中的ClustalW方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，分析其進化關(guān)系。結(jié)果（圖2）表明，SlitPDI與意大利蜜蜂（Apis mellifera）PDI序列的一致性最低，為50.2%。在昆蟲綱中SlitPDI蛋白與家蠶PDI序列的一致性最高，為83.4%。由圖2可知，21條PDI序列分別聚為四大支，第一支對應(yīng)雙翅目昆蟲的PDI序列;第二支對應(yīng)膜翅目昆蟲的PDI序列;第三支對應(yīng)鱗翅目昆蟲的PDI序列;第四支對應(yīng)鞘翅目昆蟲的PDI序列。Slit-PDI蛋白序列與鱗翅目中的家蠶和君主斑蝶（Danaus plexippus）的親緣關(guān)系較近，聚為一支。

2. 2 不同發(fā)育期SlitPDI基因的mRNA表達分析結(jié)果

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果（圖3）顯示，SlitPDI基因在斜紋夜蛾的各發(fā)育時期均有表達，2齡和4齡幼蟲中SlitPDI mRNA表達量呈逐漸上升趨勢，4齡幼蟲中表達量達最高峰。以2齡幼蟲SlitPDI基因mRNA含量為基準含量，4齡幼蟲的表達量是基準含量的127%;但在6齡幼蟲和蛹中其表達量又突然下降，分別為基準含量的59%和55%;隨后其在新羽化雌、雄成蟲中的表達量又呈增加趨勢，分別為基準含量的103%和112%。

3 討論

PDI蛋白屬于硫氧還蛋白超家族，一般由a、a'、b和b'共4個活性結(jié)構(gòu)域組成，其中a和a'區(qū)域具有催化活性域的典型序列特征-CGHC-;而b和b'不具催化活性（Kemmink et al.，1997;Benham et al.，2000）。不同物種的催化活性域-CGHC-的個數(shù)不同，含有2個活性域的為Ⅰ類PDI家族蛋白，含有3個活性域的為Ⅱ類PDI家族蛋白（Frand and Kaiser，2000;Ren et al.，2011;李燕等，2013）。本研究對來自家蠶、赤擬谷盜、黑腹果蠅及斜紋夜蛾等4種不同目的昆蟲PDI蛋白進行氨基酸序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這4種蛋白的N端和C端各具有一個高度保守的氧化還原活性域-CGHC-，因此，SlitPDI蛋白屬于Ⅰ類PDI家族蛋白。本研究的氯基酸序列聚類分析結(jié)果表明同一目的昆蟲PDI序列均聚在一起，序列的聚類關(guān)系與各物種的分類地位一致。

PDI是一種重要的折疊酶，可催化新生肽鏈中二硫鍵的形成和異構(gòu)化，在維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和生物活性方面發(fā)揮重要作用（Benham et al.，2000;王志強等，2009）。胡黎明等（2012）研究表明桔小實蠅PDI基因在其1 d蛹中的mRNA表達量最高，并發(fā)現(xiàn)從3齡幼蟲到蛹的發(fā)育過程中其表達量呈上升趨勢，推測PDI可能在桔小實蠅化蛹過程中發(fā)揮重要作用。李燕等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，SlitPDI在脂肪體、頭部、中腸、馬氏管、體壁和血液等組織中均有表達，但在血液中表達量最高，脂肪體次之，頭部最低。本研究利用實時熒光定量PCR檢測了SlitPDI基因在斜紋夜蛾不同發(fā)育時期的mRNA表達量變化情況，旨在分析SlitPDI在其生長發(fā)育過程中的生理功能，結(jié)果表明，SlitPDI基因在斜紋夜蛾4齡幼蟲中的表達量最高，在其新羽化成蟲中的表達量次之。因此，推測SlitPDI在斜紋夜蛾4齡幼蟲和剛羽化成蟲等發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，但具體功能還有待后續(xù)進一步驗證。

4 結(jié)論

本研究分析了SlitPDI蛋白的生物信息學特征，發(fā)現(xiàn)SlitPDI蛋白的氨基酸序列具有2個高度保守的氧化還原活性域-CGHC-，屬于Ⅰ類PDI家族蛋白。SlitPDI基因在斜紋夜蛾4齡幼蟲和新羽化成蟲中的表達量相對較高。

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（責任編輯 麻小燕）