孫慧園 陳浩 梅朝葉 鄭林 鞏仔鵬 李月婷 李勇軍 黃勇

摘 要 目的：考察白及醇提物中主要活性成分4-（葡萄糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基芐酯（A1）、2-異丁基蘋(píng)果酸（A2）、1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋(píng)果酸酯（A3）、二氫菲1（A4）、1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋(píng)果酸酯-2-（4-O-肉桂酰基-6-O-乙?；┢咸烟擒眨ˋ5）在大鼠腸道中的吸收動(dòng)力學(xué)特征。方法：以葛根素為內(nèi)標(biāo)，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）檢測(cè)腸循環(huán)液中A1～A5的質(zhì)量濃度。色譜柱為Acquity UPLC BEH C18，流動(dòng)相為乙腈（含0.1%甲酸）-水（含0.1%甲酸）（梯度洗脫），流速為0.35 mL/min，柱溫為45 ℃，進(jìn)樣量為3 μL；采用電噴霧離子源，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行正、負(fù)離子掃描，用于定量分析的離子對(duì)分別為m/z 593.2→431.1（A1）、m/z 189.0→129.0（A2）、m/z 725.3→457.2（A3）、m/z 347.1→332.1（A4）、m/z 1 059.3→793.1（A5）、m/z 417.0→267.0（內(nèi)標(biāo)）。采用大鼠在體腸循環(huán)灌流模型，以累計(jì)吸收轉(zhuǎn)化率（A）和吸收轉(zhuǎn)化速率常數(shù)（Ka）為指標(biāo)，考察不同劑量白及醇提物（低、中、高劑量分別為166、333、667 μg/mL）、膽汁、P-糖蛋白（P-gp）抑制劑（維拉帕米）、不同腸段對(duì)上述5種成分腸吸收的影響。結(jié)果：A1、A2、A3、A4、A5檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.22～14.00、0.34～21.75、1.99～127.16、0.15～9.75、0.16～10.00 μg/mL（r>0.99），定量下限分別為0.22、0.34、1.99、0.15、0.16 μg/mL，最低檢測(cè)限分別為0.028、0.085、0.251、0.035、0.010 μg/mL，日內(nèi)、日間RSD均小于10%，方法回收率為83.60%～106.91%，基質(zhì)效應(yīng)不影響待測(cè)物的測(cè)定。白及醇提物低、中劑量組A1的A、Ka值均顯著高于高劑量組，低劑量組A3的A值顯著高于中、高劑量組（P<0.05或P<0.01）。不結(jié)扎組A1、A3的A、Ka值均顯著低于對(duì)照組，而A4的A、Ka值均顯著高于對(duì)照組（P<0.05或P<0.01）；P-gp抑制劑組A1、A3的A、Ka值均顯著低于對(duì)照組（P<0.05或P<0.01）?？漳c組、回腸組、結(jié)腸組A1的A值以及結(jié)腸組A1的Ka值，結(jié)腸組A2的A、Ka值，回腸組A3的A值，回腸組、結(jié)腸組A4的A、Ka值，空腸組、回腸組A5的A值以及空腸組A5的Ka值均顯著低于十二指腸組；而空腸組、回腸組、結(jié)腸組A3的Ka值均顯著高于十二指腸組（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：本研究建立的UPLC-MS/MS法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便，可用于A1～A5的定量分析及藥動(dòng)學(xué)研究。白及醇提物中5種活性成分均為全腸道吸收，且吸收腸段各有不同；A1、A3在腸道中的吸收較多，可能已達(dá)飽和；膽汁可抑制A1、A2的腸吸收，但可促進(jìn)A4的腸吸收；A1～A5可能均不是P-gp的底物。

關(guān)鍵詞 白及醇提物；活性化合物；在體腸循環(huán)灌流模型；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；腸吸收特征

Study on Intestinal Absorption Characteristics of 5 Active Components in Ethanol Extract from Bletilla striata

SUN Huiyuan1，2，CHEN Hao2，MEI Chaoye2，ZHENG Lin1，GONG Zipeng1，LI Yueting1， LI Yongjun3，HUANG Yong1 [1. Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics/State Key Laboratory of Functions and Applications of Medicinal Plants， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China； 2. School of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China； 3. Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM （Ministry of Education）， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China]

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate absorption kinetic characteristics of main active components as 4-（glucoseoxy）- glucoseoxybenzyl cinnamate （A1）， 2-isobutyl malic acid （A2）， 1，4-bis [4-（glucoxy） benzyl]-2-isobutyl malic acid ester （A3）， dihydrophenanthrenes 1 （A4） and 1，4-bis [4-（glucosoxy） benzyl]-2-isobutyl malic acid ester-2-（4-O-cinnamoyl-6-O-acetyl） glucoside （A5） from ethanol extract of Bletilla striata in the intestines of rats. METHODS： Using puerarin as internal standard， UPLC-MS/MS was used to determined the concentration of A1-A5 in intestinal circulation fluid. The determination was performed on Acquity UPLC BEH C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile （containing 0.1% formic acid）-water （containing 0.1% formic acid） （gradient elution） at the flow rate of 0.35 mL/min. The column temperature was 45 ℃， and sample size was 3 μL. The positive ion and negative ion scanning were carried out in the multiple reaction monitoring mode by electrospray ion source. The ion pairs for quantitative analysis were m/z 593.2→431.1 （A1）， m/z 189.0→129.0 （A2）， m/z 725.3→457.2 （A3）， m/z 347.1→332.1 （A4）， m/z 1 059.3→793.1 （A5）， m/z 417.0→267.0 （internal standard）. In the in vivo intestinal circulation perfusion model， using accumulative absorption transfer rate （A） and absorption and transformation rate constant （Ka） as indexes， the effects of different doses of ethanol extract from B. striata （low-， medium-， high-dose were 166， 333，667 μg/mL，respectively）， bile， P-glycoprotein （P-gp） inhibitors （verapamil） and different intestinal segments on the absorption of above 5 components were investigated. RESULTS： The linear range of A1， A2， A3， A4 and A5 were 0.22-14.00， 0.34-21.75， 1.99-127.16， 0.15-9.75， 0.16-10.00 μg/mL（r>0.99）. The limits of quantitation were 0.22， 0.34， 1.99， 0.15， 0.16 μg/mL， respectively. The lowest detection limits were 0.028， 0.085， 0.251， 0.035 and 0.010 μg/mL. RSDs of inter-day and intra-day were all lower than 10%. The recoveries ranged 83.60%-106.91%. Matrix effect did not affect the determination of the substance to be measured. A and Ka values of A1 in B. striata ethanol extract low-dose and medium-dose groups were significantly higher than high-dose group； A value of A3 in low-dose group was significantly higher than medium-dose and high-dose groups （P<0.05 or P<0.01）. A and Ka values of A1 and A3 in non-ligation group were significantly lower than control group， while A and Ka values of A4 were significantly higher than control group （P<0.05 or P<0.01）. A and Ka values of A1 and A3 in P-gp inhibitor group were significantly lower than control group （P<0.05 or P<0.01）. A values of A1 in jejunum group， ileum group and colon group， Ka value of A1 in colon group， A and Ka values of A2 in colon group， A value of A3 in ileum group， A and Ka values of A4 in ileum group and colon group， A values of A5 in jejunum group and ileum group as well as Ka value of A5 in jejunum group were all significantly lower than duodenum group. Ka values of A3 in jejunum group， ileum group and colon group were significantly higher than duodenum group （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Established UPLC-MS/MS method is specific， sensitive and simple， and it can be used for quantitative analysis and pharmacokinetic study of A1-A5. The 5 active components in B. striata ethanol extract are absorbed by the whole intestine， and the intestinal segments are different. A1 and A3 are absorbed more in intestinal tract and may be saturated. Bile can inhibit intestinal absorption of A1 and A2， but promoted intestinal absorption of A4. A1-A5 may not be the substrate of P-gp.

KEYWORDS Bletilla striata ethanol extract； Active compound； in vivo intestinal circulation perfusion model； UPLC-MS/MS； Intestinal absorption characteristics

白及為蘭科植物白及[Bletilla striata（Thunb.）Reichb. f. ]的干燥塊莖，是《中國(guó)藥典》（一部）收載的常用藥材，其味苦、甘、澀，性微寒，歸肺、肝、胃經(jīng)，具有收斂止血、消腫生肌等作用，常用于咯血、外傷出血等病癥的治療[1-2]。白及的化學(xué)成分主要包括聯(lián)芐類、二氫菲類、聯(lián)芐葡萄糖苷類、聯(lián)菲類、菲類等非多糖類物質(zhì)[3-4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，白及藥用功能廣泛、藥用價(jià)值高，具有止血、抗菌、抗腫瘤及促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)等多種藥理活性[3，5]，且有研究指出白及已逐漸成為我國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥工業(yè)的重要原材料[6]。但目前有關(guān)白及的文獻(xiàn)仍集中在化學(xué)成分的分離、鑒定以及對(duì)各種粗提物療效物質(zhì)的初步探索階段[7-11]，尚未見(jiàn)白及體內(nèi)吸收及其影響因素分析的相關(guān)報(bào)道。本課題組前期對(duì)白及進(jìn)行了大量研究，確定了其醇提物中含量較高且具凝血活性的5種成分{4-（葡萄糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基芐酯（A1）、2-異丁基蘋(píng)果酸（A2）、1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋(píng)果酸酯（A3）、二氫菲1（A4）、1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋(píng)果酸酯-2-（4-O-肉桂?；?6-O-乙酰基）葡萄糖苷（A5）}。在此基礎(chǔ)上，本研究采用大鼠在體腸循環(huán)灌流模型，在保證其內(nèi)分泌輸入以及腸道神經(jīng)完整的前提下，借助超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-MS/MS），從在體角度分析白及醇提物中上述5種主要活性成分的腸吸收行為，并考察不同因素[醇提物劑量、膽汁、P-糖蛋白（P-gp）抑制劑和不同腸段[12-13]]對(duì)其腸吸收的影響，初步探討白及醇提物在大鼠腸道中的吸收動(dòng)力學(xué)特征，以期為后續(xù)白及醇提物口服給藥研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Acquity UPLC型超高壓液相-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配備AcquityTM UPLC-TQD系統(tǒng)（自動(dòng)進(jìn)樣器、二元梯高壓梯度泵、柱溫箱、真空脫氣機(jī)等）、Masslynx 4.1質(zhì)譜工作站（美國(guó)Waters公司）；HL-2S型蠕動(dòng)泵（上海青浦滬西儀器廠）；ZH-2型渦旋混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；DK-98-ⅡA型恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）；Allegra 64R型低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司）；CQ 250A-TS型超聲波清洗機(jī)（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）；EL204型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；MTN-2800D型氮吹儀（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑

白及藥材（批號(hào)：20160510）采摘自貴州省正安縣，由貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)與藥用植物學(xué)教研室龍慶德副教授鑒定為蘭科植物白及[B. striata（Thunb.）Reichb. f.]的干燥塊莖。

A1、A2、A3、A4、A5對(duì)照品均為本實(shí)驗(yàn)室自制（純度：≥95%）；鹽酸維拉帕米對(duì)照品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：29940，純度：99%）；葛根素對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110752-201512，純度：≥98%）；D101大孔吸附樹(shù)脂（30～60目，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：H13J8L39806）；烏來(lái)糖（上海伊卡生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20130609，純度：≥99%）；葡萄糖（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20100110，純度：雜質(zhì)含量≤0.005%）；甲酸、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)健康SD大鼠，雌雄各半，2～3月齡，體質(zhì)量（250±20）g，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（渝）2017-0002]。

2 方法與結(jié)果

2.1 白及醇提物的制備

參照文獻(xiàn)[14]方法，稱取白及藥材10 kg，用4倍量（kg/L）95%乙醇回流提取3次，每次2 h，濾過(guò)，合并濾液，濃縮至浸膏，浸膏用水溶解，經(jīng)D101大孔吸附樹(shù)脂柱色譜，分別以水、80%乙醇洗脫，收集80%乙醇洗脫液，減壓濃縮并真空干燥，得白及醇提物680 g，提取率為6.8%（每1 g醇提物相當(dāng)于14.7 g白及藥材）。經(jīng)UPLC-MS/MS法測(cè)定，醇提物中A1、A2、A3、A4、A5的含量分別為2.64%、2.36%、26.37%、0.86%、2.09%。

2.2 溶液的配制

2.2.1 Krebs-Ringer’s（K-R）營(yíng)養(yǎng)液[12] 精密稱取葡萄糖1.4 g、氯化鈣0.37 g、氯化鎂0.02 g、氯化鈉7.8 g、氯化鉀0.35 g、碳酸氫鈉1.37 g、磷酸二氫鈉0.32 g，用水溶解并定容至1 L，即得。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密稱取A1、A2、A3、A4、A5對(duì)照品各適量，分別用甲醇溶解，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為1.4、2.9、1.5、1.3、2.0 mg/mL的單一成分貯備液；取上述貯備液各適量，混合，于37 ℃下以氮?dú)饬鞔蹈?，用?.2.1”項(xiàng)下K-R營(yíng)養(yǎng)液溶解并逐級(jí)稀釋至所需質(zhì)量濃度，即得系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，置-20 ℃冰箱中保存，備用。

2.2.3 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取內(nèi)標(biāo)對(duì)照品10.12 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL，得質(zhì)量濃度為0.405 mg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液；取上述內(nèi)標(biāo)貯備液適量，用甲醇稀釋，得質(zhì)量濃度為20 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，置-20 ℃冰箱中保存，備用。

2.2.4 空白腸循環(huán)液 取37 ℃ K-R營(yíng)養(yǎng)液60 mL，置于量筒中，進(jìn)行在體腸灌流實(shí)驗(yàn)，循環(huán)3 h，即得。

2.2.5 白及醇提取物供試液 精密稱定“2.1”項(xiàng)下白及醇提物0.25、0.5、1 g，分別用無(wú)水乙醇15 mL溶解，取上述溶液各1 mL逐滴加入到10%聚山梨酯80溶液5 mL中，混勻，用K-R營(yíng)養(yǎng)液稀釋并定容至100 mL，超聲（功率：240 W，頻率：40 kHz）10 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液，得質(zhì)量濃度分別為167、333、667 μg/mL（按醇提物質(zhì)量計(jì)，下同）的白及醇提物供試液。

2.3 色譜與質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈（含0.1甲酸，A）-水（含0.1%甲酸，B），梯度洗脫（0～1.0 min，10%A→30%A；1.1～2.0 min，30%A→35%A；2.1～3.0 min，35%A→38%A；3.1～4.0 min，38%A→90%A；4.1～5.0 min，90%A→10%A）；流速：0.35 mL/min；柱溫：45 ℃；進(jìn)樣量：3 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行正、負(fù)離子同時(shí)掃描。離子源溫度：120 ℃；毛細(xì)管電壓：3 kV；去溶劑氣溫度：350 ℃；去溶劑氣（氮?dú)猓┝魉伲?50 L/h；碰撞氣（氬氣）流速：0.18 mL/min；用于定量分析的離子對(duì)分別為m/z 593.2→431.1（A1）、m/z 189.0→129.0（A2）、m/z 725.3→457.2（A3）、m/z 347.1→332.1（A4）、m/z 1 059.3→793.1（A5）、m/z 417.0→267.0（內(nèi)標(biāo)）；碰撞能量分別為15、15、20、25、25、30 eV；錐孔電壓分別為35、30、40、50、45、40 V。

2.4 樣品處理方法

取待測(cè)樣品100 μL，置于1.5 mL離心管中，加入1%甲酸溶液100 μL，混勻后，用正丁醇萃取3次，每次200 μL，合并正丁醇萃取液，于37 ℃下以氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)尤?0 μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液40 μL后，用50%甲醇260 μL溶解并稀釋，渦旋振蕩1 min，15 000 r/min離心5 min，取上清液，進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性 取空白腸循環(huán)液、空白腸循環(huán)液+待測(cè)物以及大鼠灌流白及醇提物供試液（質(zhì)量濃度為333 μg/mL）后60 min時(shí)的回腸灌流液樣品各適量，按“2.4”項(xiàng)下方法處理（空白腸循環(huán)液不加內(nèi)標(biāo)）后，再按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，詳見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，內(nèi)標(biāo)及A1等6種待測(cè)物的保留時(shí)間（RT）分別為1.30、1.49、1.56、1.81、2.98、3.11 min，各待測(cè)成分的分離度良好，且空白腸循環(huán)液中的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)各成分無(wú)干擾，表明本方法的專屬性強(qiáng)。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與定量下限（LLOQ）、最低檢測(cè)限（LLOD）的考察 取“2.2.2”項(xiàng)下系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（A1質(zhì)量濃度分別為0.22、0.88、1.75、3.50、7.00、14.00 μg/mL，A2質(zhì)量濃度分別為0.34、1.36、2.72、5.44、10.88、21.75 μg/mL，A3質(zhì)量濃度分別為1.99、7.95、15.89、31.79、63.58、127.16 μg/mL，A4質(zhì)量濃度分別為0.15、0.61、1.22、2.44、4.88、9.75 μg/mL，A5質(zhì)量濃度分別為0.16、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL）各適量，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（y）為縱坐標(biāo)、各待測(cè)物質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，并考察LLOQ（信噪比為10 ∶ 1）和LLOD（信噪比為 3 ∶ 1），結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，5種待測(cè)物的質(zhì)量濃度在其線性范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好（r均大于0.99），LLOQ分別為0.22、0.34、1.99、0.15、0.16 μg/mL，LLOD分別為0.028、0.085、0.251、0.035、0.010 μg/mL。

2.5.3 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn) 按“2.5.2”項(xiàng)下方法配制各待測(cè)物低、中、高質(zhì)量濃度（A1：0.44、1.75、7.00 μg/mL；A2：0.68、2.72、10.88 μg/mL；A3：3.98、15.89、63.58 μg/mL；A4：0.30、1.22、4.88 μg/mL；A5：0.32、1.25、5.00 μg/mL，下同）的混合質(zhì)控（QC）樣品，每質(zhì)量濃度平行配制5份，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定5 d，考察日間精密度。將實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，以方法回收率考察準(zhǔn)確度，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，各QC樣品的日內(nèi)、日間RSD均小于10%，方法回收率為83.60%～106.91%（RSD<7%，n=5），符合生物樣品定量分析的相關(guān)要求[15]。

2.5.4 基質(zhì)效應(yīng) 取“2.2.4”項(xiàng)下空白腸循環(huán)液100 μL，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，加入按“2.2.2”項(xiàng)下方法配制的混合對(duì)照品溶液適量，配制成相應(yīng)低、中、高質(zhì)量濃度的樣品，按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積（B1）；另取對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液適量，于37 ℃下以氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)?0%甲醇溶解，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積（B2）。基質(zhì)效應(yīng)=B1/B2×100%，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，各待測(cè)物的基質(zhì)效應(yīng)為81.78%～105.68%（RSD<7%，n=6），內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)為84.62%～106.50%（RSD<8%，n=5），表明基質(zhì)效應(yīng)不影響待測(cè)物的測(cè)定[15]。

2.5.5 穩(wěn)定性 按“2.5.2”項(xiàng)下方法配制各待測(cè)物低、中、高質(zhì)量濃度混合QC樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，分別于處理后的0、2、4、6、8、12 h（室溫）取樣，按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果，各待測(cè)物峰面積的RSD均小于10%（n=6），提示各樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 醇提物中活性成分的在體腸吸收特征研究

2.6.1 大鼠在體循環(huán)灌流實(shí)驗(yàn) 采用在體腸循環(huán)灌流法，具體步驟參照文獻(xiàn)[16]。所有均大鼠禁食、不禁水12 h，腹腔注射30%烏來(lái)糖（1.4 g/kg）進(jìn)行麻醉后，固定于37 ℃恒溫手術(shù)臺(tái)上，剃去其腹部的毛發(fā)，沿腹部中線打開(kāi)腹腔（切口約3～4 cm），結(jié)扎總膽管；在十二指腸前端剪一個(gè)小口并插入硅膠管，扎緊；然后通過(guò)盲腸找到回腸底端，在回腸底端同樣剪一個(gè)小口并插入硅膠管，扎緊；使兩者與蠕動(dòng)泵形成一個(gè)回路。在灌流前，用37 ℃生理鹽水以1.0 mL/min的流速?zèng)_洗腸道，排空水分。隨后取“2.2.5”項(xiàng)下37 ℃、不同質(zhì)量濃度的白及醇提物供試液各60 mL，以5.0 mL/min的流速循環(huán)平衡15 min后，將蠕動(dòng)泵的流速調(diào)至2.5 mL/min，立刻讀出循環(huán)液的體積。在裝有循環(huán)液的量筒中取樣1 mL（作為白及醇提物灌流0 h時(shí)的樣品），隨后補(bǔ)充K-R營(yíng)養(yǎng)液1 mL；于不同時(shí)間點(diǎn)（0.5、1、1.5、2、2.5、3 h）取樣，并同法補(bǔ)充K-R營(yíng)養(yǎng)液。將上述各時(shí)間點(diǎn)的樣品按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算樣品中各待測(cè)物的質(zhì)量濃度。蠕動(dòng)泵循環(huán)3 h后中止，待循環(huán)結(jié)束之后，用空氣排凈腸道內(nèi)和管路內(nèi)的液體，并量取其體積，即得腸道和管路的死體積。死體積加上各時(shí)間點(diǎn)的量筒讀數(shù)即為該時(shí)間點(diǎn)循環(huán)液體積，以此方法進(jìn)行腸循環(huán)的體積校正，進(jìn)而計(jì)算出各時(shí)間點(diǎn)的藥物量，即剩余藥量（Ptn，見(jiàn)公式①）；以剩余藥量計(jì)算出3 h時(shí)的累計(jì)吸收轉(zhuǎn)化率（A，見(jiàn)公式②）。采用GraphPad Prism 5.01軟件以剩余藥量的自然對(duì)數(shù)和取樣時(shí)間作圖，求出吸收轉(zhuǎn)化速率常數(shù)（Ka，即上述曲線的斜率）。采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Ptn=ctn×Vtn+1.0×[i=1][n-1][∑]cti…①

式中，tn為循環(huán)液灌注時(shí)間，ct1（i=1）為循環(huán)液中藥物（即待測(cè)物）的初始質(zhì)量濃度，ctn（i=n）為tn時(shí)刻循環(huán)液中藥物的質(zhì)量濃度，Vtn為tn時(shí)刻循環(huán)液體積，Ptn為tn時(shí)刻循環(huán)液中的剩余藥量。

A=[Pt0-Pt3

Pt0] ×100%…②

式中，Pt0為0 h時(shí)的剩余藥量，Pt3為3 h時(shí)的剩余藥量。

2.6.2 白及醇提物在37 ℃ K-R營(yíng)養(yǎng)液中的穩(wěn)定性考察 按“2.2.5”項(xiàng)下方法配制質(zhì)量濃度為333 μg/mL白及醇提物供試液60 mL，置于37 ℃恒溫水浴中，分別于0、3 h取樣，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，分別記錄0、3 h時(shí)各待測(cè)物的峰面積（分別為C1、C2）。以C1與C2的比值來(lái)考察白及醇提物在K-R營(yíng)養(yǎng)液中的穩(wěn)定性。上述試驗(yàn)重復(fù)操作4次。結(jié)果，兩者比值為94.90%～109.34%，表明A1等5種待測(cè)物在37 ℃ K-R營(yíng)養(yǎng)液中放置3 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，詳見(jiàn)表3。

2.6.3 白及醇提物在蠕動(dòng)泵管路中的物理吸附作用考察 按“2.2.5”項(xiàng)下方法配制質(zhì)量濃度為333 μg/mL白及醇提物供試液60 mL，置于37 ℃恒溫水浴中，按“2.6.1”項(xiàng)下方法操作，于體外空循環(huán)（即不連接大鼠腸道）3 h，分別于0、3 h取樣，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，分別記錄0、3 h時(shí)各待測(cè)物的峰面積（分別為C3、C4）。以C3與C4的比值來(lái)考察白及醇提物在管路中的吸附情況。上述試驗(yàn)重復(fù)操作4次。結(jié)果，兩者比值為90.08%～108.90%，表明A1等5種待測(cè)物在蠕動(dòng)泵管路中無(wú)明顯的物理吸附作用，詳見(jiàn)表3。

2.6.4 白及醇提物在空白腸循環(huán)液中的穩(wěn)定性考察 以空白腸循環(huán)液為基質(zhì)，配制白及醇提物溶液（質(zhì)量濃度為333 μg/mL）適量，置于37 ℃恒溫水浴中，分別于0、3 h取樣，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，分別記錄0、3 h時(shí)各待測(cè)物的峰面積（分別為C5、C6）。以C5、C6的比值來(lái)考察白及醇提物在空白腸循環(huán)液中的穩(wěn)定性。上述試驗(yàn)重復(fù)操作4次。結(jié)果，兩者比值為96.15%～104.77%，表明A1等5種待測(cè)物在空白腸循環(huán)液中放置3 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好，腸道中的酶對(duì)各待測(cè)物的穩(wěn)定性影響較小或無(wú)影響，詳見(jiàn)表3。

2.6.5 白及醇提物劑量對(duì)活性成分腸吸收的影響 取禁食不禁水的SD大鼠12只，隨機(jī)分為3組，即白及醇提物低、中、高劑量組，每組4只。按“2.2.5”項(xiàng)下方法配制質(zhì)量濃度分別為167、333、667 μg/mL白及醇提物供試液，各取60 mL置于37 ℃恒溫水浴中，按“2.6.1”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)行體外循環(huán)，并于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h時(shí)取樣，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算樣品中各待測(cè)物的質(zhì)量濃度，并計(jì)算A和Ka值，考察白及醇提物劑量對(duì)活性成分腸吸收的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可見(jiàn)，白及醇提物低、中劑量組活性成分A1的A、Ka值顯著高于高劑量組，白及醇提物低劑量組A3的A值顯著高于中、高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。

2.6.6 膽汁和P-gp抑制劑對(duì)活性成分腸吸收的影響 取禁食不禁水的SD大鼠12只，隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組（結(jié)扎總膽管，不加P-gp抑制劑）、不結(jié)扎組（不結(jié)扎總膽管，不加P-gp抑制劑）；P-gp抑制劑組（結(jié)扎總膽管，加P-gp抑制劑鹽酸維拉帕米108 μg/L），每組4只。以白及醇提物溶液（質(zhì)量濃度為333 μg/mL）60 mL作為腸循環(huán)液，其余按“2.6.1”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)行在體循環(huán)，并于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h時(shí)取樣，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算樣品中各待測(cè)物的質(zhì)量濃度，并計(jì)算A和Ka值，考察膽汁和P-gp抑制劑對(duì)活性成分腸吸收的影響，結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，不結(jié)扎組活性成分A1及A3的A、Ka值均顯著降低，A4的A、Ka值均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。與對(duì)照組比較，P-gp抑制劑組活性成分A1及A3的A、Ka值均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）?；钚猿煞諥2、A5的A、Ka值組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.6.7 白及醇提物在不同腸段的吸收特征 取禁食不禁水的SD大鼠16只，隨機(jī)分為4組，即十二指腸組、空腸組、回腸組、結(jié)腸組，每組4只。分別對(duì)大鼠十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸進(jìn)行結(jié)扎后，以白及醇提物溶液（質(zhì)量濃度為333 μg/mL）60 mL作為腸循環(huán)液，其余按“2.6.1”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)行在體循環(huán)，并于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h時(shí)取樣，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算樣品中各待測(cè)物的質(zhì)量濃度，并計(jì)算A和Ka值，考察白及醇提物活性成分在不同腸段的吸收特征，結(jié)果見(jiàn)表6。

由表6可見(jiàn)，空腸組、回腸組、結(jié)腸組活性成分A1的A值以及結(jié)腸組A1的Ka值，結(jié)腸組A2的A、Ka值，回腸組A3的A值，回腸組、結(jié)腸組A4的A、Ka值，空腸組、回腸組A5的A值以及空腸組A5的Ka值均顯著低于十二指腸組；而空腸組、回腸組、結(jié)腸組A3的Ka值均顯著高于十二指腸組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。

3 討論

中藥化學(xué)成分復(fù)雜，口服是最常見(jiàn)的給藥方式，腸道是口服藥物的主要吸收?qǐng)鏊Ｒ虼?，研究藥物在腸道中的吸收情況、考察藥物腸吸收的影響因素可有助于藥物劑型的開(kāi)發(fā)，改善其在生物體內(nèi)的吸收，提高其生物利用度。目前關(guān)于藥物腸吸收研究的模型較多，如單向腸灌流法、外翻腸囊法、腸循環(huán)灌流法等。在體腸循環(huán)灌流法不切斷血管及神經(jīng)，對(duì)動(dòng)物的傷害較小，可保持胃腸道神經(jīng)和內(nèi)分泌輸入的完整性以及胃腸道內(nèi)容物中酶的活性，也保證了血液及淋巴液的穩(wěn)定供應(yīng)，實(shí)驗(yàn)條件接近動(dòng)物體內(nèi)的真實(shí)情況，能較為真實(shí)地反映藥物在腸道中的吸收情況[17-18]。因此，本研究采用在體腸循環(huán)灌流模型初步探討了白及醇提物主要活性成分（A1～A5）在腸道內(nèi)的吸收行為與吸收動(dòng)力學(xué)特征。

由于生物樣品中存在大量的蛋白質(zhì)等內(nèi)源性物質(zhì)，會(huì)對(duì)其定量分析造成一定程度的干擾，因此需要通過(guò)高效、靈敏的檢測(cè)手段來(lái)保證樣品檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。本研究建立了同時(shí)測(cè)定白及醇提物中5個(gè)活性成分的UPLC-MS/MS法。方法學(xué)考察結(jié)果表明，該方法具有專屬性強(qiáng)、靈敏度高、分析效率高、操作簡(jiǎn)便快速等特點(diǎn)，可用于大量樣本的檢測(cè)分析。

白及臨床上的用量為每次6～15 g[1]，根據(jù)醇提物的提取率（6.8%）換算得成人（60 kg）單次使用醇提物的劑量為0.4～1.0 g，換算得大鼠等效劑量[19]為41.1～102.8 mg/kg（按醇提物質(zhì)量計(jì)）。本研究選擇所選大鼠體質(zhì)量為（250±20）g，若每只大鼠灌流體積為60 mL，其用藥劑量范圍應(yīng)為171.3～428.3 μg/mL。結(jié)合前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，本研究最終選擇333 μg/mL為中劑量，并將低劑量設(shè)為其1/2，高劑量設(shè)為其2倍；同時(shí)，以333 μg/mL白及醇提物供試液作對(duì)象，進(jìn)行相關(guān)穩(wěn)定性和物理吸附性考察，并探討醇提物劑量、膽汁、P-gp抑制劑對(duì)活性成分吸收的影響以及活性成分的腸吸收特征。

在進(jìn)行在體腸循環(huán)灌流實(shí)驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)小腸在吸收藥物的同時(shí)也吸收水分，導(dǎo)致循環(huán)液總體積減少，因此需要對(duì)循環(huán)體積進(jìn)行校正，以減少藥物濃度檢測(cè)的誤差。筆者通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前主要的體積校正方法包括14C標(biāo)記法、酚紅標(biāo)記法和重量法[20]。其中，由于14C的放射性，14C標(biāo)記法可能存在一定的安全性問(wèn)題；酚紅會(huì)被腸道吸收，且容易對(duì)一些藥物的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生干擾；重量法較前兩種方法簡(jiǎn)單，但不能稱量腸段內(nèi)液體的重量，可能會(huì)造成一定的檢測(cè)誤差。鑒于此，本研究采用了更為簡(jiǎn)便的量筒法來(lái)校正循環(huán)體積，該法在灌流實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用廣泛，具有操作簡(jiǎn)單、可行性高的優(yōu)點(diǎn)[12-13，16，21]。采用量筒法校正循環(huán)體積的關(guān)鍵是保證死體積維持不變。筆者經(jīng)研究對(duì)比發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大鼠的體位始終高于量筒時(shí)，其死體積基本無(wú)變化；此外，在實(shí)驗(yàn)前將大鼠腸道內(nèi)的內(nèi)容物充分沖洗干凈，避免腸道堵塞，也是保持死體積不變的方法之一。在上述條件下，本研究通過(guò)將各時(shí)間點(diǎn)量筒讀數(shù)與死體積相加來(lái)校正腸循環(huán)液體積。

為明確白及醇提物的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和主要吸收部位，本研究首先考察了白及醇提物劑量對(duì)活性成分腸吸收的影響。結(jié)果顯示，白及醇提物低、中劑量組活性成分A1的A、Ka值顯著高于高劑量組，白及醇提物低劑量組A3的A值顯著高于中、高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明當(dāng)給予大鼠中、高劑量的白及醇提物后，活性成分A1、A3的腸吸收明顯降低，其吸收可能已達(dá)飽和狀態(tài)，提示兩者在生物體內(nèi)的吸收機(jī)制不僅是單純的被動(dòng)吸收過(guò)程，可能還存在主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)[13]。由于膽汁可能會(huì)影響藥物的吸收[12，16，22]，故本研究考察了膽汁對(duì)白及醇提物活性成分吸收的影響。結(jié)果顯示，不結(jié)扎組活性成分A1及A3的A、Ka值均較對(duì)照組顯著降低，A4的A、Ka值均較對(duì)照組顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示膽汁會(huì)影響白及醇提物的吸收，可抑制活性成分A1、A3的腸吸收，促進(jìn)A4的腸吸收。P-gp介導(dǎo)的外排作用可影響諸多藥物的吸收和生物利用度[23]，因此本研究考察了P-gp抑制劑對(duì)白及醇提物活性成分吸收的影響。結(jié)果顯示，P-gp抑制劑組活性成分A1及A3的A、Ka值均較對(duì)照組顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而其余成分A、Ka值與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P-gp是一種能量依耐性的藥物外排泵，可與多種親脂性或兩性化合物結(jié)合，并促進(jìn)其外排，降低其藥物濃度。P-gp抑制劑可抑制P-gp的外排功能，從而促進(jìn)藥物的吸收[24-25]。而本研究結(jié)果顯示，加入P-gp抑制劑維拉帕米后，白及醇提物活性成分A1、A3的吸收并未增強(qiáng)，而其他成分的吸收亦無(wú)明顯改變，提示各活性成分可能均不是P-gp的底物，其吸收可能存在其他非特異性現(xiàn)象，有待后續(xù)研究予以驗(yàn)證。白及醇提物在不同腸段的吸收研究特征表明，A1、A5的主要吸收部位為十二指腸，A2的主要吸收部位為十二指腸、回腸，A3的主要吸收部位為空腸、結(jié)腸，A4的主要吸收部位為十二指腸、空腸。這提示白及醇提物中5種活性成分在十二指腸、空腸、回腸及結(jié)腸中均有吸收，為全腸道吸收，且吸收趨勢(shì)均為小腸大于結(jié)腸（A1～A5在十二指腸、空腸、回腸的A值之和高于結(jié)腸）。

綜上所述，白及醇提物中5種成分為全腸道吸收，吸收趨勢(shì)均為小腸大于結(jié)腸；A1、A3在腸道中的吸收可能已達(dá)飽和狀態(tài)，為主動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)；膽汁可影響各成分的吸收（抑制A1、A3的腸吸收，促進(jìn)A4的腸吸收）；5種成分均不是P-gp的底物。本研究初步闡明了白及醇提物中5種活性成分在腸道的吸收特征，可為白及的臨床應(yīng)用及其新劑型的研發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)參考。但本研究也具有一定的局限性：（1）在體腸循環(huán)灌流模型雖然操作較簡(jiǎn)單，但其灌流時(shí)間較長(zhǎng)，可能對(duì)腸黏膜造成損傷，從而導(dǎo)致腸吸收值與實(shí)際偏離；（2）在探討白及醇提物在各腸段吸收特征的過(guò)程中，分別結(jié)扎各腸段形成灌流通路，以等濃度的藥物灌流液進(jìn)行灌流實(shí)驗(yàn)。但在實(shí)際情況中，藥物經(jīng)口服后，依次經(jīng)過(guò)十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸，經(jīng)過(guò)各腸段的藥物濃度可能是不相等的，因此可能會(huì)使研究結(jié)果發(fā)生偏倚。因此，本課題組后續(xù)將會(huì)運(yùn)用其他研究方法和模型（如離體外翻腸囊法、Caco-2細(xì)胞等）對(duì)本研究結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步探討白及醇提物在腸道中的吸收特征。

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（收稿日期：2018-07-07 修回日期：2019-01-15）

（編輯：張?jiān)拢?/p>