韓翠艷 周建文 劉暢 馬曉星 袁橙 董巖 金珊珊

摘 要 目的：制備序列為丙氨酸-谷氨酸-酪氨酸-亮氨酸-精氨酸（簡(jiǎn)稱為“AEYLR”）的小肽修飾的紫杉醇（PTX）納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（A-P-NLC），并對(duì)其體內(nèi)外抗腫瘤效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法：采用熔融乳化-低溫固化法制備納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（NLC）、PTX納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（P-NLC）和A-P-NLC，表征其外觀形態(tài)、粒徑、多分散指數(shù)（PDI）、Zeta電位，并檢測(cè)其包封率、載藥量及體外釋放度；以NCI-H1299細(xì)胞和S180細(xì)胞為對(duì)象，采用CCK-8法對(duì)游離PTX、P-NLC、A-P-NLC（0.44～44.00 μg/mL，以PTX計(jì)）的細(xì)胞抑制作用進(jìn)行考察，并計(jì)算其半數(shù)抑制濃度（IC50）；以S180荷瘤小鼠為模型動(dòng)物，對(duì)游離PTX、P-NLC、A-P-NLC（5 mg/kg，以PTX計(jì)）的抑瘤效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果：P-NLC和A-P-NLC外觀均呈類圓形、分布均勻；A-P-NLC的粒徑、PDI、Zeta電位分別為（43.92±0.76）nm、0.203±0.034、（-19.77±1.16）mV，較P-NLC有所增加；A-P-NLC的包封率、載藥量分別為（95.71±0.68）%、（1.97±0.25）%，較P-NLC有所降低；A-P-NLC在48 h內(nèi)累積釋放百分率達(dá)（35.17±2.08）%，較游離PTX表現(xiàn)出明顯的緩釋作用，且比P-NLC的釋放更緩慢。與游離PTX和P-NLC比較，相同質(zhì)量濃度的A-P-NLC對(duì)NCI-H1299細(xì)胞和S180細(xì)胞的抑制率大部分均顯著升高，IC50值均顯著降低；A-P-NLC給藥處理的S180荷瘤小鼠無(wú)死亡現(xiàn)象，一般狀態(tài)良好，且瘤體積顯著縮小、瘤質(zhì)量顯著降低、瘤質(zhì)量抑制率顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：A-P-NLC具有明顯的緩釋作用，其對(duì)NCI-H1299細(xì)胞和S180細(xì)胞的體外抑制作用以及對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤的抑制作用均優(yōu)于游離PTX和P-NLC，且毒性有所降低。

關(guān)鍵詞 AEYLR；小肽；紫杉醇；納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體；抗腫瘤；小鼠

Preparation of Small Peptide AEYLR Modified Paclitaxel Nanostructured Lipid Carriers and Evaluation of Its Anti-tumor Effects

HAN Cuiyan1，ZHOU Jianwen2，LIU Chang1，MA Xiaoxing1，YUAN Cheng1，DONG Yan1，JIN Shanshan3（1. School of Pharmacy， Qiqihar Medical College， Heilongjiang Qiqihar 161006， China； 2. School of Pharmacy， Jiamusi University， Heilongjiang Jiamusi 154007， China； 3. Dept. of Preparation， Beijing Wanquan Dezhong Pharmaceutical Technology Co.， Ltd.， Beijing 102299， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare Paclitaxel（PTX）nanostructured lipid carriers （NLC） modified by small peptide alanine-glutamic acid-tyrosine-leucine-arginine （AEYLR）， and to evaluate its anti-tumor effect in vitro and in vivo. METHODS： NLC， PTX-NLC （P-NLC） and AEYLR modified P-NLC （A-P-NLC） were prepared by emulsion evaporation-low temperature solidification curing method. Its appearance， particle size， multi-dispersion index（PDI） and Zeta potential were characterized，encapsulation rate，drug loading and in vitro drug release were detected respectively. Using NCI-H1299 and S180 cells as objects， CCK-8 method was adopted to investigate inhibitory effects of free PTX， P-NLC and A-P-NLC （0.44-44.00 μg/mL， by PTX） to those cells. The half inhibition concentration （IC50） was calculated. Using S180 tumor-bearing mice as model animal， anti-tumor effects of free PTX， P-NLC and A-P-NLC （5 mg/kg， by PTX） were evaluated. RESULTS： P-NLC and A-P-NLC were round-like and dispersed evenly. The particle size， PDI and Zeta potential of A-P-NLC were （43.92±0.76） nm，

0.203±0.034 and （-19.77±1.16） mV， which were all increased to certain extent， compared with P-NLC. The encapsulation efficiency and drug loading of A-P-NLC were （95.71±0.68）% and（1.97±0.25）%， which were both decreased to certain extent， compared with P-NLC. The cumulative release rate of A-P-NLC was（35.17±2.08）% within 48 h， showing significant sustained-release effect compared with free PTX； the release of A-P-NLC was slower than P-NLC. Compared with free PTX and P-NLC， inhibitory rates of same concentration of A-P-NLC to NCI-H1299 cells and S180 cells were almost increased significantly， while IC50 values were all decreased significantly. There was no death in S180 tumor-bearing mice treated with A-P-NLC and the general condition was good； the volume of tumors was significantly reduced， the mass of tumors was significantly reduced， and the inhibition rate of tumors was significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： A-P-NLC has significantly sustained-release effects； its inhibitory rate to NCI-H1299 cells and S180 cells in vitro， and its inhibitory effects on S180 solid tumor in mice are all better than free PTX and P-NLC， while the toxicity is decreased to certain extent.

KEYWORDS AEYLR； Small peptide； Paclitaxel； Nano- structured lipid carriers； Anti-tumor； Mice

紫杉醇（Paclitaxel，PTX）是從紅豆杉中提取的一種四環(huán)二萜類化合物，在臨床上主要用于乳腺癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌等的一線/二線治療；其常規(guī)劑型為溶液型注射劑，但該類劑型含有的增溶劑聚氧乙烯蓖麻油會(huì)引起過敏反應(yīng)，故將其制備成各種納米制劑以降低其毒性已成為研究熱點(diǎn)[1-4]。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（Nanostructrued lipid carriers，NLC）是采用單甘油酯、雙甘油酯、其他類甘油酯、磷脂、鞘脂類等脂質(zhì)為載體，并添加一定比例的液態(tài)油，將藥物吸附或包裹于脂質(zhì)核中而形成的脂質(zhì)納米給藥系統(tǒng)[5-6]。NLC具有良好的生物相容性，適于靜脈注射、口服等多種途徑給藥[7-8]，具有極大的潛在應(yīng)用價(jià)值。序列為丙氨酸-谷氨酸-酪氨酸-亮氨酸-精氨酸（Ala-Glu-Tyr-Leu-Arg，簡(jiǎn)稱為“AEYLR”）的小肽來(lái)自于表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）自磷酸化位點(diǎn)Y1173，前期研究已證明其對(duì)EGFR高表達(dá)的腫瘤具有良好的體內(nèi)外靶向性[9-10]。為降低抗腫瘤藥物的毒性并提高其靶向性，本課題組將PTX制成AEYLR小肽修飾的NLC（簡(jiǎn)稱為“A-P-NLC”），對(duì)其進(jìn)行表征，并對(duì)其體內(nèi)外抗腫瘤效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，為PTX抗腫瘤制劑的進(jìn)一步開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

AL204型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；HT7700型透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）；Zetasizer Nano-ZS90型納米粒徑電位分析儀（英國(guó)Malvern公司）；ZHWY-200D型恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器有限公司）；2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；5804R型臺(tái)式高速大容量離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；3111型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；Tecan Safire 2型酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；ARZ型電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺（寧波市魯匠工具有限公司）；MD44MM透析袋（美國(guó)Viskase公司，截留分子量：8 000～14 000 Da）。

1.2 藥品與試劑

PTX對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：17022701，純度：≥98%）；二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000-AEYLR（DSPE-PEG2000-AEYLR，廣州特立生物科技有限公司，批號(hào)：GT60304-0324-A，純度：≥90%）；CCK-8試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20332）；山崳酸甘油酯（ATO，法國(guó)Gattefossé公司）；單硬脂酸甘油酯（GMS，馬來(lái)西亞KLK公司）；中鏈三酰甘油（MCT，北京鳳禮精求商貿(mào)有限公司）；聚氧乙烯35蓖麻油（ELP）、聚乙二醇-15-羥基硬脂酸酯（HS15）（德國(guó)BASF 公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；聚山梨酯80（美國(guó)Sigma公司）；pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS，由北京酷來(lái)博科技有限公司的固體粉末產(chǎn)品用超純水配制）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為純化水或超純水。

1.3 細(xì)胞

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H1299、小鼠腹水瘤細(xì)胞S180均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.4 動(dòng)物

SPF級(jí)昆明小鼠50只（雌性30只、雄性20只），體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（黑）2013-001。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境溫度為18～22 ℃、濕度為50%～60%，飼喂清潔級(jí)真空包裝小鼠飼料。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同NLC樣品制備

采用熔融乳化-低溫固化法進(jìn)行制備。稱取ATO 40 mg、GMS 13 mg、MCT 27 mg、ELP 54 mg作為油相，另稱取/量取HS15 54 mg、水4 mL作為水相，將油相和水相分別置于80 ℃水浴中熔融或溶解；在恒溫磁力攪拌下，將油相緩慢滴入水相，待滴加完成，繼續(xù)乳化10 min；隨后將油水混合物迅速置于冰水浴中固化15 min，再分別經(jīng)0.45 μm、0.22 μm微孔濾膜濾過后，即得NLC溶液。另外，先單獨(dú)將5 mg/mL的PTX無(wú)水乙醇溶液200 μL（揮干乙醇）或與DSPE-PEG2000-AEYLR 8 mg同時(shí)加入上述油相中，再按同樣的操作方法分別制得PTX納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（P-NLC）溶液和修飾有AEYLR小肽的PTX納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（A-P-NLC）溶液。3種NLC樣品溶液均顯藍(lán)色乳光。

2.2 P-NLC和A-P-NLC的表征

2.2.1 外觀形態(tài) 取“2.1”項(xiàng)下制備的P-NLC、A-P-NLC樣品溶液適量，以水稀釋10倍后用磷鎢酸負(fù)染，在電鏡下觀察。結(jié)果，兩者外觀均呈類圓形、大小均一，詳見圖1。

2.2.2 粒徑、粒度及電位 取“2.1”項(xiàng)下制備的P-NLC、A-P-NLC樣品溶液適量，用水稀釋50倍，采用納米粒徑電位分析儀測(cè)定其粒徑、粒度分布及Zeta電位。試驗(yàn)均重復(fù)3次。結(jié)果，P-NLC的粒徑為（39.56±1.22）nm，多分散指數(shù)（PDI）為0.161±0.026，Zeta電位為（-16.34±0.85）mV；A-P-NLC的上述指標(biāo)或其絕對(duì)值均有增加，分別為（43.92±0.76）nm、0.203±0.034、（-19.77±1.16）mV。P-NLC和A-P-NLC的粒徑與Zeta電位分布見圖2。

2.3 包封率和載藥量

采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定PTX含量。色譜條件：色譜柱為Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（55 ∶ 45，V/V）；流速為1 mL/min；柱溫為 25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nm；進(jìn)樣量為20 μL[11]。精密稱取PTX對(duì)照品適量，以流動(dòng)相制成質(zhì)量濃度分別為5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述色譜條件測(cè)定；以PTX的峰面積（A）對(duì)質(zhì)量濃度（c， μg/mL）進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.558 5c+0.910 7（r=0.999 8）。結(jié)果表明，PTX的質(zhì)量濃度在5.0～100.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

采用超濾離心法[12]測(cè)定樣品的載藥量和包封率。取“2.1”項(xiàng)下制備的P-NLC樣品溶液適量，置于超濾離心管（截留分子量：10 kDa，下同）中，10 000 r/min離心40 min，收集下清液，經(jīng)甲醇適當(dāng)稀釋后，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得游離藥物含量（W游離）；另取P-NLC樣品溶液適量，置于離心管中，經(jīng)乙腈破乳后，3 000 r/min 離心20 min，取上清液，按上述HPLC色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得總藥物含量（W總）。按照公式計(jì)算P-NLC的載藥量（DL）和包封率（EE）：DL（%）=（W總-W游離）/W脂質(zhì)×100%，EE（%）=（W總-W游離）/W總×100%；式中，W脂質(zhì)為處方中液態(tài)脂質(zhì)和固態(tài)脂質(zhì)的總量[13]。另取“2.1”項(xiàng)下制備的A-P-NLC樣品溶液適量，同法測(cè)定。試驗(yàn)均重復(fù)3次。結(jié)果，P-NLC和A-P-NLC的載藥量分別為（99.13±0.86）%、（95.71±0.68）%，包封率分別為（2.33±0.15）%、（1.97±0.25）%，A-P-NLC的載藥量和包封率較P-NLC均有所降低。

2.4 體外釋放度

取游離PTX和“2.1”項(xiàng)下制備的P-NLC和A-P-NLC樣品溶液適量，采用透析法[13]模擬藥物釋放過程，設(shè)置截留分子量為10 kDa、釋放介質(zhì)為含0.2%聚山梨酯80的PBS，于0、2、4、6、8、10、12、24、48 h時(shí)取樣，按“2.3”項(xiàng)下HPLC法測(cè)定PTX質(zhì)量濃度，考察其體外釋放度，并按公式計(jì)算累積釋放百分率：累積釋放百分率（%）=[V0×Ct+V（C1+C2+C3+……+Ct-1）]/m×100%，其中，m是加入制劑含藥總量，V是每次取樣體積，V0是釋放介質(zhì)的總體積，C1、C2、C3……Ct分別是第1、2、3……t取樣時(shí)間點(diǎn)的濃度。試驗(yàn)均重復(fù)3次。結(jié)果顯示，游離PTX在12 h時(shí)的累積釋放率已達(dá)到（90.00±2.33）%，而P-NLC、A-P-NLC在48 h時(shí)的累積釋放百分率分別為（43.05±3.74）%、（35.17±2.08）%；與游離PTX比較，P-NLC和A-P-NLC均表現(xiàn)出明顯的緩釋作用，且A-P-NLC較P-NLC的釋放更緩慢，詳見圖3。

2.5 不同樣品對(duì)NCI-H1299細(xì)胞和S180細(xì)胞的抑制作用考察

2.5.1 NLC的細(xì)胞抑制作用 采用CCK-8法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H1299細(xì)胞進(jìn)行消化計(jì)數(shù)后接種于96孔板中（1×104個(gè)/孔），在37 ℃、5%CO2（以下培養(yǎng)條件同）的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去孔中培養(yǎng)基（即含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，以下同），分為對(duì)照組（細(xì)胞+培養(yǎng)基）和不同質(zhì)量濃度的NLC試驗(yàn)組（細(xì)胞+終質(zhì)量濃度分別為22、220、2 200、22 000 μg/mL的NLC，分別相當(dāng)于0.11、1.10、11.00、110.00 μg/mL PTX的載體量），分別加入不含藥/含藥培養(yǎng)基100 μL，每組設(shè)置6個(gè)孔。劑量均根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。采用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度（OD）。按照公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=ODNLC試驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100%。另取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的S180細(xì)胞，同法測(cè)定NLC作用后的細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，經(jīng)不同質(zhì)量濃度的NLC作用后，NCI-H1299細(xì)胞和S180細(xì)胞的存活率均在83%以上，未表現(xiàn)出明顯細(xì)胞抑制作用，表明NLC對(duì)上述兩種細(xì)胞的毒性均較小，詳見圖4。

2.5.2 不同PTX樣品的細(xì)胞抑制作用 按“2.5.1”項(xiàng)下方法取細(xì)胞接種并培養(yǎng)，分為對(duì)照組（細(xì)胞+培養(yǎng)基）和各藥物組（細(xì)胞+游離PTX或P-NLC或A-P-NLC的含藥培養(yǎng)基，所含PTX的終質(zhì)量濃度均分別為0.44、1.10、4.40、11.00、44.00 μg/mL）；另設(shè)不含細(xì)胞的空白組（培養(yǎng)基），每組設(shè)置6個(gè)孔。劑量均根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置。按照“2.5.1”項(xiàng)下方法培養(yǎng)并測(cè)定各孔OD值，并按公式計(jì)算細(xì)胞抑制率：細(xì)胞抑制率（%）=（OD藥物組-OD空白組）/（OD對(duì)照組-OD空白組）×100%。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)（P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）；同時(shí)，計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

結(jié)果顯示，當(dāng)PTX質(zhì)量濃度為0.44～44.00 μg/mL時(shí)，各樣品對(duì)兩種細(xì)胞的抑制率隨著PTX濃度增加而呈升高趨勢(shì)，表明不同PTX樣品對(duì)兩種細(xì)胞的抑制作用均具有劑量依賴趨勢(shì)；與游離PTX比較，在相同質(zhì)量濃度的P-NLC和A-P-NLC作用下，兩種細(xì)胞的抑制率均顯著升高，IC50值均顯著降低；與P-NLC比較，在相同質(zhì)量濃度的A-P-NLC作用下（除1.10 μg/mL外），兩種細(xì)胞的抑制率均顯著升高，IC50值均顯著降低。以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見圖5、表1。

2.6 A-P-NLC的體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

2.6.1 S180荷瘤小鼠模型建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的S180細(xì)胞，以4 ℃生理鹽水漂洗并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/mL，按200 μL/只接種于小鼠（雌性10只）的腹腔[14]。4～5 d后可見小鼠腹部凸起、明顯增大，此時(shí)取其S180腹水瘤細(xì)胞用于傳代[13]。傳至第3代后，抽取腹水瘤模型小鼠的腹水，以4 ℃生理鹽水漂洗并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×108個(gè)/mL，另取小鼠（雌雄各20只），按200 μL/只注射至其腋窩皮下，并觀察其腋窩處實(shí)體瘤形成情況。當(dāng)小鼠腋窩處出現(xiàn)小的突起且觸摸有硬結(jié)感時(shí)，即為荷瘤造模成功。

2.6.2 A-P-NLC的體內(nèi)抗腫瘤作用考察 取“2.6.1”項(xiàng)下造模成功的荷瘤小鼠32只，隨機(jī)分為對(duì)照組、游離PTX組、P-NLC組、A-P-NLC組，每組8只。各組小鼠均尾靜脈給藥100 μL/次，隔天1次，連續(xù)8次。除對(duì)照組給予生理鹽水外，各給藥組的給藥劑量均以5 mg/kg PTX計(jì)算，劑量根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置。每天觀察小鼠一般狀態(tài)，并測(cè)量其體質(zhì)量；以游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤垂直方向上的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），計(jì)算腫瘤體積（V=ab2/2）[15]；末次給藥24 h后處死小鼠，剖取腫瘤，稱定瘤質(zhì)量，并按公式計(jì)算瘤質(zhì)量抑制率：瘤質(zhì)量抑制率（%）=（1-給藥組瘤質(zhì)量/對(duì)照組瘤質(zhì)量）×100%[16]。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法同“2.5.2”項(xiàng)。

結(jié)果顯示，給藥期間，對(duì)照組小鼠腫瘤增長(zhǎng)速度快，前期進(jìn)食和飲水量正常、毛發(fā)光亮，后期隨著腫瘤變大，其活動(dòng)變遲緩、毛發(fā)變得不光亮，有1只小鼠死亡；游離PTX組小鼠出現(xiàn)躁動(dòng)、尖叫等現(xiàn)象，精神狀態(tài)不佳，毛發(fā)不光亮，食欲減退，活動(dòng)量減少，有3只小鼠死亡；P-NLC組、A-P-NLC組小鼠狀態(tài)較好，毛發(fā)光亮，進(jìn)食和飲水量正常，其中P-NLC組有1只小鼠死亡。對(duì)照組和游離PTX組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)較慢，而P-NLC組和A-P-NLC組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯，詳見圖6。

各組小鼠瘤體積均隨時(shí)間延長(zhǎng)而呈增加趨勢(shì)；與對(duì)照組比較，各給藥組小鼠自給藥3 d時(shí)起瘤體積均顯著縮小，P-NLC組和A-P-NLC組小鼠在末次給藥后24 h時(shí)瘤質(zhì)量均顯著降低；與游離PTX組比較，P-NLC組和A-P-NLC組小鼠分別自給藥7、5 d時(shí)起瘤體積顯著縮小，在末次給藥后24 h時(shí)瘤質(zhì)量顯著降低、瘤質(zhì)量抑制率顯著升高；與P-NLC組比較，A-P-NLC組小鼠自給藥7 d時(shí)起瘤體積顯著縮小，在末次給藥后24 h時(shí)瘤質(zhì)量顯著降低、瘤質(zhì)量抑制率顯著升高。以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）

3 討論

經(jīng)PEG修飾的NLC可通過“高滲透、長(zhǎng)滯留”效應(yīng)被動(dòng)靶向進(jìn)入腫瘤組織，即通過腫瘤微血管的空隙滲漏進(jìn)入腫瘤組織，但進(jìn)入腫瘤組織的NLC因其表面修飾有PEG故親水性增強(qiáng)，會(huì)使其跨膜進(jìn)入細(xì)胞受到影響；AEYLR小肽對(duì)EGFR具有特異的靶向性，可使連接有AEYLR的NLC對(duì)EGFR高表達(dá)的細(xì)胞及腫瘤組織具有主動(dòng)靶向作用，同時(shí)還可通過EGFR受體介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)NLC的內(nèi)吞，提高NLC的入胞量[9-10]。

DSPE-PEG2000-AEYLR是AEYLR通過PEG末端活化技術(shù)連接在DSPE-PEG2000末端的產(chǎn)物。本研究采用熔融乳化-低溫固化法制備A-P-NLC，在乳化過程中DSPE-PEG2000-AEYLR結(jié)構(gòu)中的親水部分PEG2000- AEYLR存在于乳滴表面，而在低溫固化后AEYLR部分即被修飾到了P-NLC的表面。與P-NLC比較，A-P-NLC在制備過程中加入了DSPE-PEG2000-AEYLR，增加了NLC表面PEG的量，導(dǎo)致粒徑、粒度分布及Zeta電位絕對(duì)值均有所增長(zhǎng)，同時(shí)空間位阻的增加使其包封率和載藥量略有降低；二者的體外釋放行為相似，均有緩釋效果，但A-P-NLC的緩釋效果更為明顯，可能是由于DSPE-PEG2000-AEYLR的加入使P-NLC的結(jié)構(gòu)變得更加穩(wěn)定，從而使藥物釋放更緩慢。

本研究選擇EGFR高表達(dá)的人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H1299和鼠源S180細(xì)胞系[17-18]作為模型細(xì)胞，主要考察了A-P-NLC對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞的體外抑制效果。結(jié)果顯示，與游離PTX和P-NLC比較，加入了具有主動(dòng)靶向作用的AEYLR后，A-P-NLC顯示出更強(qiáng)的體外腫瘤細(xì)胞抑制效果。而進(jìn)一步采用S180細(xì)胞建立小鼠荷瘤模型并進(jìn)行體內(nèi)抑瘤作用考察的結(jié)果顯示，與游離PTX組和P-NLC組比較，A-P-NLC組小鼠的瘤體積、瘤質(zhì)量均顯著縮小或降低，瘤質(zhì)量抑制率均顯著升高；另外，游離PTX組有3只小鼠由于PTX的長(zhǎng)期毒性而死亡，而P-NLC組與A-P-NLC組小鼠死亡情況減少，且體質(zhì)量較游離PTX組顯著增長(zhǎng)，提示PTX制成NLC后可減小藥物的毒副作用，提高用藥安全性。

綜上，A-P-NLC具有明顯的緩釋作用，其對(duì)NCI- H1299細(xì)胞和S180細(xì)胞的體外抑制作用以及對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤的抑制作用均優(yōu)于游離PTX和P-NLC，且毒性有所降低。

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（收稿日期：2018-09-28 修回日期：2019-01-22）

（編輯：段思怡）