孟海寧 高鈿 仵俊宇 黃巧 徐晟偉 沈若武

[摘要]?目的?探究miRNA-375（miR-375）通過MYC/上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）對非小細胞肺癌（NSCLC）侵襲和遷移的影響。

方法?將未做任何處理的NSCLC細胞A549作為空白組，轉(zhuǎn)染空載慢病毒的A549細胞作為對照組，轉(zhuǎn)染表達miR-375慢病毒的A549細胞作為實驗組。采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測miR-375在NSCLC組織和癌旁組織中的表達量，以及miR-375在正常肺組織細胞（BEAS-2B細胞）和A549細胞中的表達量;通過Transwell實驗檢測3組細胞的侵襲、遷移能力;采用Western blot檢測3組細胞中MYC蛋白和EMT相關(guān)蛋白（E-鈣黏蛋白、波形蛋白）的表達量。

結(jié)果?miR-375在NSCLC組織中的表達量顯著高于癌旁組織（t=16.88，P<0.05），在A549細胞中的表達量顯著高于BEAS-2B細胞（t=8.51，P<0.05）。過表達miR-375后，實驗組與空白組和對照組相比，NSCLC細胞的侵襲（F=29.55，P<0.05）、遷移（F=90.21，P<0.05）能力增強，MYC蛋白表達增加（F=37.15，P<0.05），E-鈣黏蛋白表達減少（F=47.25，P<0.05），波形蛋白表達增加（F=77.64，P<0.05）。

結(jié)論?上調(diào)miR-375可以通過MYC/EMT影響NSCLC的侵襲和遷移能力。

[關(guān)鍵詞]?微RNAs;癌，非小細胞肺;基因，myc;上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化;細胞運動

[中圖分類號]?R734.2;R342.2

[文獻標志碼]?A

[文章編號]??2096-5532（2019）06-0639-05

doi：10.11712/jms201906003

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

MIRNA-375 AFFECTS THE INVASION AND MIGRATION OF NON-SMALL CELL LUNG CANCER CELLS VIA MYC/EPITHE-

LIAL-MESENCHYMAL TRANSITION

MENG Haining， GAO Tian， WU Junyu， HUANG Qiao， XU Shengwei， SHEN Ruowu

（Department of Special Medicine， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of miRNA-375 （miR-375） on the invasion and migration of non-small cell lung cancer （NSCLC） via MYC/epithelial-mesenchymal transition （EMT）.

Methods NSCLC A549 cells without any treatment were established as blank group， A549 cells transfected with empty vector lentivirus were established as control group， and A549 cells transfected with miR-375 lentiviral vector were established as experimental group. Quantitative real-time PCR was used to measure the expression of miR-375 in NSCLC tissue and adjacent tissue， as well as in BEAS-2B cells and A549 cells. Transwell assay was used to measure the invasion and migration abilities of A549 cells， and Western blot was used to measure the expression of MYC protein and EMT-related proteins （E-cadherin and vimentin） in the three groups of cells.

Results The NSCLC tissue had significantly higher expression of miR-375 than the adjacent tissue （t=16.88，P<0.05）， and A549 cells had significantly higher expression of miR-375 than BEAS-2B cells （t=8.51，P<0.05）. After the overexpression of miR-375， compared with the blank group and the control group， the experimental group had significant increases in the abilities of invasion （F=29.55，P<0.05） and migration （F=90.21，P<0.05）， a significant increase in the protein expression of MYC （F=37.15，P<0.05）， a significant reduction in the expression of E-cadherin （F=47.25，P<0.05）， and a significant increase in the expression of vimentin （F=77.64，P<0.05）.

Conclusion Upregulation of miR-375 can promote the invasion and migration of NSCLC through MYC/EMT.

[KEY WORDS] microRNAs; carcinoma， non-small-cell lung; genes， myc; epithelial-mesenchymal transition; cell movement

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，同時也是全球惡性腫瘤死亡的主要原因[1-2]，其中非小細胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌的80%以上[3]。NSCLC目前的主要治療方法是手術(shù)、放療和化療，盡管放療和化療的應用使NSCLC預后得到很大改善，但其生存率還是很低[4]，所以NSCLC的靶向研究顯得尤為重要。近年來研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA對肺癌的進展、診斷以及治療起著關(guān)鍵作用，其在肺癌的治療研究中備受關(guān)注[5]。miRNA是一類長約20個氨基酸的小RNA，它可以與特定的靶點結(jié)合，影響靶位點的mRNA翻譯，進而影響相關(guān)蛋白的表達[6]。有研究表明，miRNA-375（miR-375）與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡有著密切的聯(lián)系，而且miR-375的表達與癌癥病人的總生存率相關(guān)，所以推測miR-375可能是一種有用的臨床預后生物標志物[7-8]。JUNG等[9]研究發(fā)現(xiàn)，MYC可以受miR-375的調(diào)節(jié)進而影響腫瘤的進展和表型。MYC家族包括C-MYC、N-MYC和L-MYC，對腫瘤細胞的侵襲、遷移都有很重要的作用[10-11]。已有研究表明，一些藥物可以通過抑制MYC通路的激活來抑制人宮頸癌細胞的增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[12];hsa-miR-24則可以通過調(diào)節(jié)c-MYC/EMT軸來抑制鼻咽癌細胞的轉(zhuǎn)移能力[13];MYC還可以通過抑制RPS19/EMT信號傳導的激活來抑制癌細胞的轉(zhuǎn)移[14]。本研究旨在探討miR-375是否可通過MYC/EMT對NSCLC的侵襲和遷移產(chǎn)生影響。

1?材料與方法

1.1?細胞與樣本

所用NSCLC細胞（A549）和正常肺組織細胞（BEAS-2B）由青島大學博雅樓實驗室凍存。A549細胞用RPMI-1640（HyClone，美國）培養(yǎng)液培養(yǎng)，BEAS-2B細胞用LHC-9（HyClone，美國）培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)細胞時兩種培養(yǎng)液都加入體積分數(shù)0.10胎牛血清（索萊寶，北京）。含EDTA的胰蛋白酶（索萊寶，北京）用于消化貼壁細胞。NSCLC組織和癌旁組織的新鮮樣本各30例，來自青島市市立醫(yī)院。本研究的組織來源病人均簽署了書面同意書，研究獲青島大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2?細胞轉(zhuǎn)染

將A549細胞接種于96孔板中，每孔10 000個，置于含體積分數(shù)0.05 CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實驗共分3組，在96孔板中未做任何處理的A549細胞作為空白組，將轉(zhuǎn)染含空載體慢病毒（吉凱基因公司，上海）的A549細胞作為對照組，將轉(zhuǎn)染表達miR-375慢病毒（吉凱基因公司，上海）的A549細胞作為實驗組。將3組細胞置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)10 h后，移除96孔板中的培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液，每孔100 μL。然后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，應用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測3組細胞中miR-375的表達量。

1.3?qRT-PCR

收集長勢良好的細胞，按照iso plus RNA提取試劑盒（Takara，日本）的說明書提取3組細胞的總RNA，用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（Takara，日本）將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq RR420A（Takara，日本）進行qRT-PCR，檢測細胞中miR-375的表達。反應條件：95 ℃、30 s;95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40個循環(huán);60 ℃、15 s。實驗所用引物均購自上海生工，其中U6作為miRNA-375的內(nèi)源性參照。引物序列見表1。

1.4?Transwell小室實驗

①遷移實驗：向24孔板（康寧，美國）的3個孔中加入含體積分數(shù)0.15胎牛血清的培養(yǎng)液，每孔500 μL，將3個Transwell小室（康寧，美國）分別放入3個孔中。取3組細胞各5×104個分別接種于以上3個Transwell小室內(nèi)，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，用棉簽擦拭3個Transwell小室的內(nèi)膜，之后小室用甲醇溶液固定10 min，用甲紫染色10 min，PBS洗3次，拍照，在顯微鏡下計數(shù)細胞。②侵襲實驗：將基質(zhì)膠（康寧，美國）與完全培養(yǎng)液按1∶9的比例稀釋，將稀釋后的混合液按每孔100 μL加入Transwell小室中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中4 h，其余實驗步驟同遷移實驗。

1.5?Western blot檢測

取3組細胞，用PBS洗2次后加入1 mL的PBS，使用細胞刮刀將細胞刮下分別放入3個離心管中，以5 000 r/min離心5 min。去上清留細胞沉淀，在細胞沉淀中加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min，以12 000 r/min離心10 min，上清即為總蛋白。將提取的蛋白質(zhì)加入上樣緩沖液SDS-Loading Buffer，沸水浴煮5 min。取45 μg蛋白置SDS-PAGE凝膠中電泳，電泳結(jié)束后將膠中的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上（Millipore，美國）。用脫脂奶粉封閉2 h，在4 ℃下與MYC（1∶1 000，CST）、β-actin（1∶3 000，Bioss）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin，1∶1 000，CST）、波形蛋白（Vimentin，1∶1 000，CST）的一抗一起孵育過夜;加入二抗（1∶1 000，Abcam）低速振蕩60 min。用超敏型化學發(fā)光底物試劑（ECL）進行蛋白條帶成像，分析條帶灰度值，計算各蛋白相對表達量。

1.6?統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料結(jié)果以±s形式表示，兩組間比較采用配對t檢驗，多組間比較采用方差分析。以P<0.05表示差異有顯著性。

2?結(jié)?果

2.1?miR-375的表達

2.1.1?NSCLC組織和癌旁組織miR-375表達的比較?癌旁組織和NSCLC組織miR-375的相對表達量分別為0.40±0.20和1.00±0.03，NSCLC組織miR-375的表達明顯高于癌旁組織，差異有顯著性（t=16.88，P<0.05）。

2.1.2?BEAS-2B細胞和A549細胞miR-375表達的比較?BEAS-2B細胞和A549細胞miR-375的相對表達量分別為1.00±0.02和2.20±0.30，A549細胞miR-375的表達明顯高于BEAS-2B細胞，差異有統(tǒng)計學意義（t=8.51，P<0.05）。

2.1.3?各組細胞miR-375表達的比較?實驗組細胞miR-375的表達較空白組和對照組明顯增加，差異有顯著性（F=1 677.95，P<0.05），而空白組和對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

2.2?miR-375對細胞侵襲和遷移能力的影響

與空白組和對照組相比，實驗組細胞的遷移、侵襲能力均增強，差異有顯著意義（F=90.21、29.55，P<0.05），而空白組和對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3?miR-375對MYC蛋白表達的影響

與空白組和對照組相比，實驗組細胞MYC的表達增加，差異有顯著意義（F=37.15，P<0.05），而空白組和對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

2.4?miR-375對EMT相關(guān)蛋白表達的影響

與空白組和對照組相比，實驗組細胞E-cadhe-

rin的表達降低，Vimentin的表達升高，差異均有顯著性（F=47.25、77.64，P<0.05），而空白組和對照組E-cadherin和Vimentin的表達比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖1和表3。

3?討?論

肺癌是全球范圍內(nèi)很常見的一種腫瘤，NSCLC在所有肺癌類型中發(fā)病率最高[15]。NSCLC確診時多數(shù)已發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，這是其死亡率高的主要原因，所以研究影響NSCLC侵襲和轉(zhuǎn)移的靶點顯得尤為重要。miRNAs是小分子內(nèi)源性非編碼RNA，可以影響基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，從而起到腫瘤抑制基因或致癌基因的作用[16-17]。已有大量的證據(jù)表明，miRNAs對NSCLC的進展有影響[18-19]。在眾多的miRNAs中，越來越多的研究集中在miR-375上，miR-375與癌癥總體生存率顯著相關(guān)，并且對多種癌癥的侵襲、轉(zhuǎn)移、生長和分化產(chǎn)生作用[8，20]。但miR-375在NSCLC中的研究較少，它對NSCLC的影響還不甚明確，所以本研究選擇了miR-375作為NSCLC的研究靶點。

本研究結(jié)果顯示，miR-375在NSCLC組織中呈高表達，與相關(guān)研究結(jié)果一致[21]，推測miR-375在NSCLC中起促癌基因的作用。進一步的實驗結(jié)果顯示，過表達miR-375后細胞的侵襲和遷移能力增強，表明miR-375可以調(diào)節(jié)NSCLC的侵襲遷移能力，并且是起促癌基因的作用。但是也有研究結(jié)果顯示，miR-375在肺癌、食管癌、肝細胞癌中呈低表達[22-24]。目前miR-375在癌癥中具體的作用還不確定，其是否能作為癌癥治療的靶點還有待進一步證實。目前，綜合本實驗結(jié)果和相關(guān)文獻可以看出，miR-375既可以為癌基因，也可以為抑癌基因，

它在不同腫瘤中的作用不同。MYC癌蛋白為“超級轉(zhuǎn)錄因子”，可以調(diào)控基因組15%左右的轉(zhuǎn)錄，其下游效應子可以參與核糖體生物合成、蛋白質(zhì)翻譯、協(xié)調(diào)細胞增殖和分化等生物功能[25-26]。本文實驗結(jié)果顯示，過表達miR-375后NSCLC細胞MYC蛋白的表達水平升高，表明miR-375可以通過調(diào)節(jié)MYC的表達來影響NSCLC的侵襲和遷移。EMT是一個動態(tài)變化的過程，在該過程中穩(wěn)定的上皮細胞轉(zhuǎn)化為不穩(wěn)定的、具有轉(zhuǎn)移和侵襲能力的間質(zhì)細胞，故EMT在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著不可或缺的角色[27-28]。MYC也可以通過調(diào)節(jié)EMT的發(fā)生發(fā)展來影響腫瘤進展[29]。本實驗結(jié)果表明，隨著miR-375的過表達，NSCLC細胞的MYC表達顯著增加，侵襲和遷移能力顯著增強，EMT相關(guān)蛋白的表達也發(fā)生明顯變化，提示miR-375可以通過MYC/EMT影響NSCLC細胞的侵襲和遷移能力。

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