黃姍姍 劉慧萍 張韞玉 陳鎮(zhèn) 張楚潔 付慧蘭 肖小芹

〔摘要〕 細胞自噬是哺乳動物細胞物質代謝的一個重要機制，與細胞凋亡共同參與卵巢卵泡的發(fā)育和閉鎖，并發(fā)揮重要的作用。近年研究發(fā)現，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B， PI3K/AKT）信號通路參與卵巢疾病的發(fā)生。PI3K和AKT的過度激活可使原始卵泡過早發(fā)育以及卵泡過快凋亡，卵巢顆粒細胞作為卵泡發(fā)育重要的支持細胞，其功能的減退或凋亡很可能引發(fā)一系列女性內分泌方面的疾病。FOXO3a轉錄因子是PI3K/AKT信號通路下游的重要靶蛋白之一，參與抗增殖和凋亡。本文就關于卵巢顆粒細胞自噬與PI3K/AKT/FOXO3a信號通路的相關進展加以綜述。

〔關鍵詞〕 卵巢;卵泡;顆粒細胞;自噬;PI3K/AKT/FOXO3a信號通路

〔中圖分類號〕R711.75? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.06.023

〔Abstract〕 Autophagy is an important mechanism of material metabolism in mammalian cells. Together with apoptosis， it plays an important role in the development and atresia of ovarian follicles. In recent years， it has been found that phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B （PI3K/AKT） signaling pathway is involved in ovarian diseases. Excessive activation of PI3K and AKT can lead to premature development of primordial follicles and excessive apoptosis of follicles. As important supporting cells of follicular development， the functional decline or apoptosis of ovarian granulosa cells may lead to a series of female endocrine diseases. As one of the most important target proteins in the downstream of PI3K/AKT signaling pathway， FOXO3a transcription factor is involved in anti-proliferation and apoptosis. This paper reviewed the progress in the correlation between ovarian granulosa cells autophagy and PI3K/AKT/FOXO3a signaling pathway.

〔Keywords〕 ovary; follicle; granulosa cells; autophagy; PI3K/AKT/FOXO3a signaling pathway

卵巢是女性重要的生殖內分泌器官，產生卵細胞和分泌性激素，因此它兼具生殖與內分泌這兩種功能。顆粒細胞（granulosa cell， GC） 是卵泡的主要功能細胞之一，通過縫隙連接圍繞在卵母細胞周圍，它在卵泡的發(fā)育、成熟及閉鎖過程中起著重要作用[1]。近年來，隨著對卵巢微環(huán)境調節(jié)機制研究的深入，國內許多學者意識到顆粒細胞的功能變化對卵泡的生長發(fā)育及成熟起著決定性作用。通過大量的實驗研究，人們發(fā)現自噬這種程序性死亡的方式，區(qū)別于細胞凋亡的地方，在于對機體內環(huán)境的一個調節(jié)作用，并與癌癥、感染、神經退行性疾病、炎癥以及代謝性疾病密切相關[2]。由于分子生物學及其相關領域的不斷擴展，研究人員先是在酵母中發(fā)現一些與自噬有關的分子機制，之后又在哺乳動物之中發(fā)現了相似的分子機制[3-4]。

1 顆粒細胞自噬在卵泡發(fā)育中的相關作用

生理性的自噬貫穿了細胞的整個自我修整與恢復的過程，通過清理掉內部無用的或者不被需要的部分，來完成細胞的自身代謝以及其中某些重要細胞器的一個更新，并防止細胞的異常死亡，維持細胞、組織和器官之間的穩(wěn)態(tài)與平衡，以此來確保機體的健康狀態(tài)[5]。而且，自噬作為細胞內物質再循環(huán)的重要途徑之一，不僅有利于細胞的存活[6]，還在卵巢的胚胎發(fā)育、卵巢的疾病中起著重要作用[4，7-8]。

卵泡是維持卵巢功能的物質基礎，卵泡發(fā)育的任何一個環(huán)節(jié)受阻，都會影響到女性生殖和內分泌功能。顆粒細胞是卵泡發(fā)育最早的細胞之一，可分泌某些激素受體來刺激卵母細胞使其開始發(fā)育[9-10]。它與卵母細胞，與卵泡膜細胞之間互相作用，影響卵泡的生長，其中，與后者之間的互相作用對卵泡的正常發(fā)育以及功能的正常運轉也非常重要。而且原始卵泡的發(fā)育也有賴于顆粒細胞的生長與分化，再者生長期的卵泡發(fā)育和閉鎖也是顆粒細胞經過受體介導的信號轉導途徑去調節(jié)[11-12]，使顆粒細胞在卵泡的生長過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。顆粒細胞與卵泡膜細胞之間也可以合成，并且釋放出相關激素，如性激素、抑制素等，卵母細胞則會釋放出與生長和分化有關聯(lián)的一些因子，如生長分化因子-9（growth differentiation factor-9， GDF-9）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-15（bone morphogenetic protein-15， BMP-15）等，其中，GDF-9可以通過抑制顆粒細胞的凋亡和卵泡閉鎖，來促進卵泡的生長和增殖;如果GDF-9的表達下調，則可以促進半胱天冬酶-3（Caspase-3）的活化和顆粒細胞的凋亡[13]。而且激活素A（Activin A），作為一種由顆粒細胞分泌的肽類物質，不但可以推進顆粒細胞的發(fā)育和增長[14]，對卵泡的一個生長、排卵和黃體的形成也很關鍵。一旦這些因子發(fā)生了突變，就可能表現出卵泡的發(fā)育障礙，或者是說出現卵泡的一個提前閉鎖的情況[15]。

卵泡閉鎖可分為早期的卵泡閉鎖和晚期的卵泡閉鎖，在部分卵泡細胞內會觀察到自噬體，它包含細胞膜的結構、羊毛狀的物質以及降解的線粒體，這些細胞內形態(tài)有利于晚期卵泡閉鎖的鑒別[16]。有研究表明，卵泡閉鎖與細胞凋亡有一定的關聯(lián)，顆粒細胞作為細胞凋亡的主要靶細胞，可誘導顆粒細胞自噬[17-18]。而且卵巢功能受損具有隱匿性，被發(fā)現時往往已經處于衰竭狀態(tài)[19-20]。在相關分子機制中，Silva等[21-22]報道表皮細胞生長因子（epidermal growth factor， EGF）和其家族成員之一的EGFR在山羊卵巢上皮表面和卵巢黃體及卵巢卵泡均有表達。Zhao F等[23]研究發(fā)現，沉默信息調節(jié)因子1（silent information regulator1， SIRT1）蛋白也許能夠通過推動顆粒細胞的凋亡來參與到豬卵泡閉鎖的調節(jié)控制之中。胡衛(wèi)紅等[24]研究了患有多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome， PCOS）的患者，就卵巢顆粒細胞的表達調控，來證明雄激素和胰島素可以調節(jié)卵巢顆粒細胞中過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptor γ， PPARγ）的表達，并得出結論，PPARγ的異常表達可能與PCOS患者的內分泌失調和排卵障礙有關。并且在PCOS患者中，由于卵泡發(fā)育障礙，顆粒細胞分泌較少，缺乏芳香化酶的活性，促卵泡生成刺激素（follicle stimulating hormone， FSH）的活性阻遏，沒有足夠多的雌二醇（E2），容易導致 PCOS患者的高雄激素血癥[25]。宋翠淼等[26]發(fā)現排卵前孕酮（progesterone， P）的分泌受到抑制，可能會阻止促黃體生成素（luteotropichormone， LH）峰前的P水平過早升高和卵泡過早黃素化、卵泡閉鎖以及未破裂卵泡黃素化綜合征的發(fā)生有重要生理意義。

2 PI3K/AKT/FOXO3a信號通路

PI3K/AKT信號通路被認為是與多種人類疾病相關的一條通路[27]。它是細胞增殖調控的重要通路之一，主要是通過促進細胞增殖來抗凋亡。PI3K由催化亞基（p110）和調節(jié)亞基（p85）組成。一旦PI3K激活，它的產物PI-3，4-P2和PI-3，4，5-P3將會與AKT的PH區(qū)進行連合，讓AKT從細胞質到了細胞膜，并且改變它的結構。在絲氨酸473（Serine 473， Ser473）以及蘇氨酸308（Threonine 308， Thr308）這兩個關鍵點磷酸化激活，更重要的是，這兩個位點的磷酸化還是AKT被激活過程中不可或缺的環(huán)節(jié)[28]。信號傳導通路的級聯(lián)反應也被AKT的活化所促進引導，也讓一些下游的靶蛋白開始出現磷酸化反應，例如，叉頭框蛋白（Forkhead box， FOX）家族成員之一的FOXO3a蛋白參與了抗增殖和凋亡;雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）控制蛋白之間的生物合成，調節(jié)細胞生長;p27蛋白則維持原始卵泡儲量等[29-30]。研究表明，自噬能被PI3Ks家族中的PI3K-I與它下游的AKT用激活mTOR來約束壓制，這主要是用激活AKT來加強PI3K/AKT信號通路，讓mTOR抑制結節(jié)性硬化癥基因2（TSC2），致使mTOR被活化，來控制自噬的發(fā)生[31]。在研究腫瘤的發(fā)生和發(fā)展機制時，觀察到細胞的活性被PI3K/AKT信號通路經由磷酸化多種底物而變化，并通過這種方式，進一步推動了腫瘤細胞的生長與增殖，還抑制了細胞的凋亡[32-33]。該通路的抗細胞凋亡機制，主要是AKT被激活之后通過凋亡相關程序的直接磷酸化，又或者是編碼的凋亡相關程序基因表達水平的一個間接改變，來控制凋亡過程[34]。人們通過使用多種基因修飾的小鼠，或者通過對大鼠進行造模，來對卵巢相關的生理和病理過程中PI3K信號通路實行了一系列的研究，發(fā)現它不僅參與了卵泡的發(fā)育、排卵，還參與到了卵巢腫瘤的發(fā)展過程之中[29]。

叉頭框蛋白是廣泛分布于酵母和人類的一類轉錄因子，包括17個亞族，研究最多的是O亞家族，FOXO家族的四個成員分別是FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6[35]。作為重要成員之一，FOXO3a蛋白參與了重要生命過程的調控，如細胞的增殖、生長、分化、凋亡以及衰老[36-37]。FOXO3a是PI3K/AKT通路下游重要轉錄因子之一，磷酸化的PI3K激活AKT，被激活的AKT進而磷酸化FOXO3a，磷酸化后的FOXO3a特異性結合細胞核內的結構蛋白14-3-3，并從細胞核轉移到細胞漿中，通過泛素化降解，喪失正常的轉錄活性，細胞凋亡將會降低;而當AKT途徑受到抑制時，大部分去磷酸化的FOXO3a進入了細胞核并加速細胞凋亡[38]。有研究者建立了大鼠腦缺血模型，通過檢測FOXO3a的表達情況以及海馬區(qū)神經細胞凋亡的情況，證實了FOXO3a的磷酸化受PI3k/AKT通路的調節(jié)[39]。同樣，有研究人員在體外培養(yǎng)人鼻咽癌CNE-1、CNE-2細胞時，通過對FOXO3a表達的觀察，來研究它對這兩種細胞是否有增殖和凋亡的影響。通過進一步的研究發(fā)現，PI3K/AKT信號通路的活性一旦被抑制，人鼻咽癌CNE-1和CNE-2的表達將會出現上調的現象，并改變細胞中FOXO3a的表達，結果證明，它不僅控制了細胞的增殖，還誘導了細胞的凋亡[40]。

3 卵巢顆粒細胞自噬與PI3K/AKT/FOXO3a信號通路

PI3K/AKT作為調節(jié)自噬的經典信號傳導通路，有研究表明，顆粒細胞經由PI3K/AKT/mTOR的途徑來介導自噬，進一步的調整控制卵泡發(fā)育和卵泡閉鎖，并給性未成熟時期的大鼠注射促性腺激素，以此控制大鼠在卵泡發(fā)育時期卵泡中顆粒細胞的自噬，來抑制細胞的凋亡[41]。研究還表明，微管相關蛋白3（Light Chain 3， LC3）是自噬相關基因8（Autophagy-related 8 genes， Atg8）同源基因之一，主要表達于卵泡顆粒細胞中，由于細胞的特異性，自噬主要出現在顆粒細胞中[42]。這些表明PI3K/AKT/mTOR途徑參與了顆粒細胞自噬。而且自噬基因Beclin-1對維持人體黃體細胞和卵巢雄激素分泌細胞的壽命起著重要的調控作用，并通過維持自噬水平來促進細胞存活[43]。Beclin-1還能和PI3K/AKT信號通路中PI3K-III受體結合，在自噬早期階段發(fā)揮著重要作用，并參與早期自噬體的形成[44]。而Bcl-2蛋白的作用則與Beclin-1的相反，通過和Beclin-1的結合來抑制它對自噬活性的一個推進作用[45-46]。并且當細胞的營養(yǎng)供給缺乏時會活化PI3K/AKT這條途徑。王偉等[47]研究發(fā)現，自噬水平能通過PI3K/AKT途徑的活化來提升，還能推動細胞對自身代謝部分的吸收，給細胞的生存與運動供應能量。

同樣的，PI3K/AKT信號傳導通路下游的FOXO3a轉錄因子的磷酸化/去磷酸化，也可以影響細胞自噬和細胞凋亡的水平。通過研究發(fā)現[48]，經過多種方式喚醒哺乳動物中胰島素信號通路之后，因為AKT的磷酸化，FOXO3a的功能受到抑制，細胞中的FOXO3a被滅活，調控細胞的發(fā)育和代謝的作用也會失效[49]。換過來說，AKT和它的下游分子也能被FOXO3a進行負調節(jié)，而且內源性的AKT和FOXO3a 也能組成復合體，它們的表達狀態(tài)能促使細胞凋亡[50-51]。同樣，細胞凋亡因子能被活化后的FOXO3a上調，通過調節(jié)前凋亡蛋白Bim來調控細胞周期，以此來推動細胞的凋亡以及周期阻滯[52]。FOXO3a還可以改變細胞核中p27kip和細胞周期蛋白D的表達，使細胞不再活躍，卵泡不再發(fā)育。研究還發(fā)現，敲除了FOXO3a基因的小鼠在出生后3周左右顯示出原始卵泡的大量啟動，進而出現促性腺激素水平降低、原始卵泡耗竭以及早期不孕等情況[53]。

FOXO3a在卵巢卵母細胞及卵泡發(fā)育中起著重要的調節(jié)作用[50]，使細胞發(fā)生自噬活動，并出現細胞的免疫性異常死亡[54]。有研究顯示，FOXO3a可能通過SCF-PI3K-FOXO3a-p27kip1/Bim通路介入新生大鼠卵巢中裸露卵母細胞及原始卵泡卵母細胞凋亡的調節(jié)[55]。而且FOXO3a在卵泡的激活中也起著很重要作用，研究證明，盡管FOXO3a（DAF-16同源基因）雌性小鼠處在性成熟正常的階段，但是原始卵泡已經在性成熟之前就被激活了，相關機制尚未明確，作為PI3K的下游分子，其與自噬的改變極有可能息息相關[56]。另有研究發(fā)現，E2的參與，可能使顆粒細胞FOXO3a的表達下調，并激活下游調控因子AKT，并且由于AKT對FOXO3a的磷酸化，使得FOXO3a的表達顯著降低，最終抑制細胞凋亡[57]。

然而，還有一些研究發(fā)現，自噬可誘導細胞死亡[58]，B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）下調可誘導自噬，轉染Bcl-2反義mRNA的白血病原髓細胞幾乎不再生長。通過電子顯微鏡觀察發(fā)現，一些細胞死亡是由自噬引起的，與凋亡沒有關系[59]。佟慶等[60]在PCOS大鼠顆粒細胞自噬率的相關研究中，證明了卵巢顆粒細胞的減少會直接影響卵泡的發(fā)育，而且在竇狀卵泡階段的時候就有大多數卵泡不再發(fā)育，并大膽假設PCOS大鼠的顆粒細胞可能出現有過度自噬的情況。也就是說，在某種情況下，自噬過度可能會出現一些病理狀態(tài)，如顆粒細胞死亡。研究發(fā)現，在促性腺激素依賴性大鼠的卵巢卵泡閉鎖中，自噬體的蓄積能經由降低凋亡相關蛋白Bcl-2的表達和下游Caspase-3的活化使得卵巢顆粒細胞凋亡[4，41]，但是其機制還有待進一步的研究。陏旭霞在前期的研究中發(fā)現[61]，FOXO3a轉錄因子在新生大鼠卵巢卵母細胞巢中的一些卵母細胞和一些原始卵泡的卵母細胞中出現高表達。此外，FOXO3a高表達的陽性細胞率和卵母細胞凋亡率基本相同。后期的研究猜測，FOXO3a可能同步誘導促凋亡蛋白Bim和FasL，出現高表達，激活下游細胞凋亡途徑，并引起卵母細胞凋亡[62]。楊竹[63]發(fā)現，在沒有FOXO3a的雌性小鼠中，特征性卵巢表型，即球型卵泡，一旦被激活，就會導致卵母細胞死亡。Fu Y等[64]研究發(fā)現，褪黑素（10-7M）能夠向下調節(jié)P53的表達，向上調節(jié)Bcl-2和LHR基因的表達，以此來減少應激條件下給綿羊卵巢顆粒細胞造成的負面影響。

綜上所述，一旦轉錄因子出現異常，顆粒細胞的自噬水平就有可能被升高或降低，而且顆粒細胞內的PI3K/AKT/FOXO3a信號通路對卵泡的生長和成熟也有至關重要的作用[65-66]。

4 其他

FOXO可通過調節(jié)SIRT1 的去乙?；谡{節(jié)自噬中發(fā)揮重要作用，并且SIRT1-FOXO介導的細胞自噬在氧化應激中也起著一定的作用[67]。SIRT1不僅能夠增強FOXO3a引導細胞周期停滯和應對氧化應激損害的“本領”;還能夠控制FOXO3a引導細胞死亡的“本領”。并且原始卵泡的發(fā)育也能通過FOXO3a的激活來調控，并讓它們維持原始形態(tài)，減少轉變?yōu)槌墒炻雅莸臄的?，并通過減少卵泡中顆粒細胞的凋亡，來維持卵巢中卵泡的儲備以及延緩卵巢的退化[51]。

5 展望

自噬發(fā)生在卵泡的各個發(fā)育階段，并參與卵巢疾病的發(fā)生和發(fā)展，PI3K/AKT信號通路作為與卵泡發(fā)育相關聯(lián)的一個重要信號通路，對其相關因子的研究已經成為治療女性內分泌疾病的一個有力的研究方向。通過近些年的研究，人們在卵母細胞和顆粒細胞中，發(fā)現存在有完整的PI3K/AKT信號系統(tǒng)，它們不僅可以調節(jié)卵母細胞的生長，促進原始卵泡的生存和發(fā)育，還可以推動顆粒細胞的增殖與分化，并且能抑制細胞的凋亡，這些對于卵巢發(fā)育和生理性的維穩(wěn)都有著的非常重要的作用[29]。有研究表明，FOXO3a對于雌性動物卵泡的發(fā)育調控、顆粒細胞自噬以及卵巢功能調控的研究還在繼續(xù)，對調節(jié)FOXO3a之后是增殖還是延緩卵泡的發(fā)育，研究的結論也不盡相同[68-69]。但是，充分了解顆粒細胞自噬的相關機制對卵巢疾病的發(fā)生、發(fā)展、治療以及預后有重大意義，也有很大的發(fā)展空間，值得我們進一步去探索。

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