項(xiàng)璇兒 邵芳冰 許穎齡 杜俊英 房軍帆 方劍喬

摘要 目的：篩選電針干預(yù)慢性炎性痛的優(yōu)勢頻率，觀察不同頻率電針對慢性炎性痛大鼠DRG p-TRPV1的干預(yù)情況，探討優(yōu)勢頻率電針的DRG p-TRPV1活化干預(yù)機(jī)制。方法：所有實(shí)驗(yàn)大鼠完全隨機(jī)分為空白組、模型組、2 Hz電針組、100 Hz電針組和2/100 Hz電針組。除空白組外，其余各組均進(jìn)行CFA造模。電針組選用雙側(cè)“足三里”和“昆侖”穴，0.5 mA～1.5 mA，30 min/次。采用Von Frey Hair檢測各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)患側(cè)PWT和PWL;采用免疫印跡法檢測大鼠DRG p-TRPV1的表達(dá)。結(jié)果：100 Hz電針對CFA大鼠的PWT提升最為顯著（P<0.05），100 Hz、2/100 Hz電針均能有效提高CFA大鼠的PWL（P<0.05，P<0.05）;CFA模型大鼠L4-6 DRG p-TRPV1蛋白表達(dá)均有上調(diào)，其中L4水平上調(diào)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），L5、L6水平上升較為顯著（P<0.05），100 Hz電針能有效抑制CFA大鼠L5 DRG p-TRPV1蛋白的過表達(dá)（P<0.05），對L4、L6 DRG p-TRPV1蛋白的過表達(dá)雖有下調(diào)趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：100 Hz電針對慢性炎性痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)最佳，這可能與其能有效下調(diào)CFA大鼠L5 DRG p-TRPV1蛋白的過表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 電針;頻率;優(yōu)選;炎性痛;鎮(zhèn)痛;DRG;TRPV1;活化

Abstract Objective：To select the dominant frequency of electroacupuncture（EA）in treating chronic inflammatory pain，to observe the effects of different frequency EA on DRG p-TRPV1 of rats with chronic inflammatory pain，and to explore the mechanism of DRG p-TRPV1 activation by dominant frequency EA.Methods：All rats were randomly divided into a control group，a model group，a 2 Hz EA group，a 100 Hz EA group and a 2/100 Hz EA group.Except for the control group，rats of other groups were given CFA hypodermic injection into the plantar surface of the right hind paw of SD rats.In the EA group，Zusanli（ST36）and Kunlun（BL60）acupoints on both sides were selected，0.5 mA-1.5 mA，30 mins per time.Von Frey Hair was used to detect the PWT and PWL in the affected side of rats at different time points，and western blot was used to detect the expression of DRG p-TRPV1 in rats.Results：100 Hz EA can effectively improve the PWT of CFA rats（P<0.05），and 100 Hz and 2/100 Hz EA can increase the PWL of CFA rats（P<0.05，P<0.05）; the expression of L4-6 DRG p-TRPV1 protein in CFA model rats was up-regulated，and there is no significant difference in L4 level（P>0.05），otherwise L5 and L6 levels were up-regulated significantly（P<0.05）.100 Hz EA can effectively inhibit the overexpression of L5 DRG p-TRPV1 protein in CFA rats（P<0.05）.While the overexpression of L4 and L6 DRG p-TRPV1 protein decreased，but there was no significant difference（P>0.05）.Conclusion：100 Hz EA has the best analgesic effect on chronic inflammatory pain，which may be related to its effective down-regulation of L5 DRG p-TRPV1 protein expression in CFA rats.

Key Words Electroacupuncture; Frequency; Optimal; Inflammatory pain; Analgesia; DRG; TRPV1; Activation

中圖分類號：R245文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.06.002

慢性炎性痛嚴(yán)重影響患者的身心健康，是臨床最常見的病癥之一。目前慢性炎性痛的治療常使用抗炎鎮(zhèn)痛類藥物，而現(xiàn)有的藥物治療存在不良反應(yīng)大，治療效果不佳等問題[1]。

電針作為一種綠色無不良反應(yīng)的干預(yù)手段，具有良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，已被臨床廣泛運(yùn)用于慢性炎性痛的治療[2-3]。電針頻率是影響電針鎮(zhèn)痛效應(yīng)的重要因素，不同頻率適用于不同類型病理性疼痛的治療[4-5]。因此，篩選電針干預(yù)慢性炎性痛的優(yōu)勢頻率，可以為臨床電針治療慢性炎性痛提供更優(yōu)化的治療方案。

長期以來，慢性炎性痛的機(jī)制是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[6-7]。背根神經(jīng)節(jié)（Dorsal Root Ganglion，DRG）神經(jīng)元接受并整合周圍神經(jīng)末梢傳出的信號，是痛覺傳入的初級感覺神經(jīng)元[8-9]。瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1（Transient Receptor Potential Vanilloid Type1，TRPV1）在外周廣泛分布于DRG神經(jīng)元和三叉神經(jīng)節(jié)（Trigeminal Ganglion，TG）神經(jīng)元中[10]。研究表明，DRG TRPV1參與了慢性炎性痛外周敏化的病理進(jìn)程[11]。

本研究使用完全弗氏佐劑（Complete Freund′s Adjuvant，CFA）誘導(dǎo)的慢性炎性痛模型是用于研究慢性炎性痛最經(jīng)典的動物模型[12]。通過觀察各組大鼠50%機(jī)械縮足閾（Paw Withdrawal Thresholds，PWT）和熱縮足潛伏期（Thermal Paw Withdrawal Latencies，PWL），篩選電針干預(yù)慢性炎性痛的優(yōu)勢頻率。分析各組大鼠DRG p-TRPV1的表達(dá)，闡明優(yōu)勢頻率電針對慢性炎性痛鎮(zhèn)痛效應(yīng)的外周TRPV1活化機(jī)制，以期為電針鎮(zhèn)痛提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用清潔級雄性健康Sprague Dawley（SD）大鼠60只，動物合格證書：SCXK（滬）2013-0016，體質(zhì)量200～240 g;購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料（由實(shí)驗(yàn)動物中心提供）及自由飲食，12 h循環(huán)燈光。

1.1.2 試劑與儀器

試劑：CFA（美國Sigma，批號：SLBM9312V）;一抗：兔抗大鼠p-TRPV1單克隆抗體（美國Abnova，產(chǎn)品貨號：PAB8499）;小鼠抗大鼠TfR單克隆抗體（美國Thermo Scientific，產(chǎn)品貨號：MA1-90784）;二抗：山羊抗兔（美國Abcam，產(chǎn)品貨號：ab6721）;山羊抗小鼠（美國Abcam，產(chǎn)品貨號：ab97230）;BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號：P0018）;其余試劑均為國產(chǎn)分析純級。

儀器：纖毛機(jī)械刺激針（Von Frey Hairs test觸覺纖維絲，美國stoelting）;足底熱輻射測痛儀（37370，意大利UGO BASILE）;韓式穴位神經(jīng)刺激儀（HANS-200A，聯(lián)創(chuàng)科技南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司）;電泳-轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）;全能臺式高速冷凍離心機(jī)（Sorvall Biofuge Stratos，美國Thermo Scientific公司）;酶標(biāo)儀（Spectra Max M4，美國美谷分子有限公司）;凝膠成像系統(tǒng)（德國GE公司，型號：Image Quant LAS4000型）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

分組：用于本研究的實(shí)驗(yàn)大鼠完全隨機(jī)分為5組：空白組、CFA模型組、2 Hz電針組、100 Hz電針組和2/100 Hz電針組，每組12只（6只用于PWT檢測，6只用于PWL檢測）。

模型制備：空白組于大鼠右后足底皮下注射0.9%氯化鈉溶液，0.1 mL/只，其余各組大鼠于相同部位注射CFA 0.1 mL/只，建立大鼠炎性痛模型。

1.2.2 干預(yù)方法 空白組不做任何處理;CFA模型組：僅予以與觀察組相同時(shí)間的束縛固定。所有電針組于造模后24 h完成患側(cè)PWT和PWL檢測后，即刻介入電針治療。參照華興邦大鼠穴位圖譜，取大鼠雙側(cè)“足三里”穴（膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下5 mm處）和“昆侖”穴（后肢外踝與跟腱之間的凹陷中）[12]。采用0.18 mm×13 mm針灸針，進(jìn)針后用LH-202H韓氏穴位暨神經(jīng)刺激儀連接雙側(cè)“足三里”和“昆侖”穴。治療參數(shù)如下，2 Hz電針組：2 Hz，0.5 mA～1.5 mA（起始強(qiáng)度為0.5 mA，每隔15 min增加0.5 mA），共45 min，1次/d，連續(xù)治療7 d;100 Hz電針組和2/100 Hz電針組：除治療頻率分別為100 Hz和2/100 Hz，其余同2 Hz電針組。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

PWT檢測：采用Von Frey hair檢測大鼠基礎(chǔ)痛、模后24 h、模后1 d、模后3 d和模后7 d電針治療后5個(gè)時(shí)間點(diǎn)PWT作為痛閾指標(biāo)。選用Von Frey hair套組：0.4 g、0.6 g、1 g、2 g、4 g、6 g、8 g、15 g、26 g。測量時(shí)，將大鼠置于鐵絲網(wǎng)上透明有機(jī)玻璃箱內(nèi)（20 cm×20 cm×15 cm）。待其安靜后，用Von Frey hair刺激大鼠足底區(qū)域，至Von Frey hair輕微彎曲并持續(xù)5 s。強(qiáng)度從4 g開始，若大鼠出現(xiàn)逃避反應(yīng)則記為“X”并給予小一級纖維絲刺激，反之記為“O”并給予大一級纖維絲刺激，每次刺激間隔不少于2 min。當(dāng)出現(xiàn)“OX”或是“XO”組合后，再刺激4次，得一串“O”或“X”組合序列，通過公式50%PWTs（g）=10^（xf+k*δ-4）計(jì)算出大鼠50%PWTs。xf為序列中最后一根Von Frey絲的對數(shù)值，k為所得序列在k值表中相對應(yīng)的數(shù)值，δ為各個(gè)纖維絲力度取log后的均差，在此約為0.231。若連續(xù)五次刺激均為“O”則記為26.0 g，反之若刺激均為“X”則記為0.4 g。若計(jì)算得出50%PWT大于26.0 g或小于0.4 g，仍以26.0 g或0.4 g作為最大或最小值。測量時(shí)間固定在9：00-16：00，環(huán)境溫度：（23±2）℃。

PWL檢測：采用足底熱輻射測痛儀檢測各組大鼠基礎(chǔ)痛、模后24 h、模后1 d、模后3 d和模后7 d電針治療后5個(gè)時(shí)間點(diǎn)PWL。測量前，各組大鼠適應(yīng)環(huán)境3 d。測量時(shí)，將大鼠置于玻璃板上的透明有機(jī)玻璃箱內(nèi)，室溫保持（25±2）℃，待大鼠安靜后（即停止梳理毛發(fā)和探索性活動，約15 min）。將測試儀上的“十”字形標(biāo)記置于大鼠右后足足底中央并避開足墊，開啟儀器用強(qiáng)光照射大鼠右后足足底中央，照射開始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避的時(shí)間為大鼠的PWL測量5次，每次間隔5 min。去除最低值和最高值，取3次結(jié)果的平均值為測定結(jié)果。為防止大鼠熱輻射燙傷，將大鼠的PWL測定時(shí)間上限值設(shè)定為20 s，溫度上限值設(shè)定為35 ℃。

取材及樣本處理：于電針治療后7 d，以1%戊巴比妥（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠。開胸暴露心臟，經(jīng)升主動脈快速灌注4 ℃生理鹽水。取大鼠患側(cè)L4-6 DRG放入預(yù)冷的EP管內(nèi)，保存于-80 ℃冰箱待用。

免疫印跡法測大鼠L4-6 DRG p-TRPV1膜蛋白表達(dá)組織加入RIPA裂解液和膜蛋白提取試劑，使用超聲粉碎法提取膜蛋白，BCA法測膜蛋白濃度。取適量L4/L5/L6 DRG膜蛋白，加入2×上樣緩沖液，100 ℃變性5 min。蛋白上樣為每泳道20 μg。電泳采用8%分離膠和5%濃縮膠，電泳參數(shù)：分離膠80 V恒壓，濃縮膠150 V恒壓。PVDF膜15V恒壓半干轉(zhuǎn)印45 min。5%脫脂奶粉室溫孵育封閉1 h，一抗（兔抗大鼠p-TRPV1（1∶1 000），小鼠抗大鼠TfR單克隆抗體（1∶1 000））4 ℃孵育過夜。二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔抗體（1∶10 000），辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠抗體（1∶10 000））室溫孵育2 h。ECL顯色，Image Quant LAS 4000凝膠成像系統(tǒng)拍片，Image Quant TL軟件分析條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（±s）表示，采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。PWT和PWL數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析，并用多因素方差分析進(jìn)行各時(shí)點(diǎn)比較;免疫印跡數(shù)據(jù)采用單因素方差分析;組間兩兩比較，采用Bonferroni檢驗(yàn)，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同頻率電針對CFA大鼠PWT的干預(yù)情況

由圖1可見，造模前各組大鼠PWT差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。LSD檢驗(yàn)表明，CFA造模后24 h至模后7 d電針治療后，與空白組比較，各造模組大鼠PWT顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示CFA致慢性炎性痛模型成功建立。模后1 d電針治療后，與模型組比較，各電針觀察組大鼠患側(cè)PWT顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與2 Hz電針組比較，100 Hz電針組大鼠患側(cè)PWT上升更為顯著，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模后3 d電針治療后結(jié)果與之相似，與2 Hz電針組比較，100 Hz與2/100 Hz電針組大鼠患側(cè)PWT上升更為顯著，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模后7 d電針治療后，與模型組比較，100 Hz電針組大鼠患側(cè)PWT有顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;2 Hz和2/100 Hz電針組大鼠患側(cè)PWT雖有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 不同頻率電針對CFA大鼠PWL的干預(yù)情況

由圖2可見，造模前各組大鼠PWL差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。LSD檢驗(yàn)表明，CFA造模后24 h至模后7 d電針治療后，與空白組比較，各造模組大鼠PWL顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示CFA致慢性炎性痛模型成功建立。模后1 d電針治療后，與模型組比較，100 Hz和2/100 Hz電針組大鼠患側(cè)PWL顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模后3 d電針治療后，與模型組比較，各電針觀察組大鼠患側(cè)PWL顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模后7 d電針治療后，結(jié)果與之相似，但與2 Hz電針組比較，100 Hz與2/100 Hz電針組大鼠患側(cè)PWL上升更為顯著，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 不同頻率電針對CFA大鼠DRG TRPV1活化的干預(yù)情況

2.3.1 不同頻率電針對CFA大鼠L4 DRG TRPV1活化的干預(yù)情況

由圖3可見，與空白組比較，CFA模型組大鼠L4 DRG p-TRPV1蛋白表達(dá)水平有所提升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與CFA模型組比較，各電針觀察組大鼠L4 DRG p-TRPV1蛋白表達(dá)有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.3.2 不同頻率電針對CFA大鼠L5 TRPV1活化的干預(yù)情況

由圖4可見，與空白組比較，CFA模型組大鼠L5 DRG p-TRPV1蛋白表達(dá)水平顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與CFA模型組比較，100 Hz電針觀察組大鼠L5 DRG p-TRPV1蛋白表達(dá)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），2 Hz和2/100 Hz電針觀察組大鼠L5 DRG p-TRPV1蛋白表達(dá)雖有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.3.3 不同頻率電針對CFA大鼠L6 TRPV1活化的干預(yù)情況

由圖5可見，與空白組比較，CFA模型組大鼠L6 DRG p-TRPV1蛋白表達(dá)水平顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與CFA模型組比較，各電針觀察組大鼠L6 DRG p-TRPV1蛋白表達(dá)雖有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

大鼠足底注射CFA可誘導(dǎo)紅、腫、熱、痛等顯著的炎性反應(yīng)，導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)機(jī)械痛覺過敏和熱痛覺過敏等現(xiàn)象[13-14]。本研究中，各造模組大鼠于模后24 h出現(xiàn)PWT、PWL顯著降低，該結(jié)果與以往研究結(jié)果相一致，提示CFA造模成功。

根據(jù)“腧穴所在，主治所在”的選穴規(guī)律，“足三里”和“昆侖”穴處于病變部位，具有通利關(guān)節(jié)、舒經(jīng)活絡(luò)止痛作用[15-16]。故本研究選取“足三里”和“昆侖”穴作為治療主穴。大量研究證明，電針“足三里”和“昆侖”穴對CFA誘導(dǎo)的慢性炎性痛有良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)[17-19]。本研究結(jié)果提示，模后1 d電針治療后，各電針組大鼠患側(cè)PWT和PWL均有提升，其中100 Hz電針組大鼠患側(cè)PWT和PWL上升最為顯著;模后3 d電針治療后，100 Hz和2/100 Hz電針組大鼠患側(cè)PWT上升較顯著，而各電針組大鼠患側(cè)PWL上升均顯著;模后7 d電針治療后，100 Hz電針組大鼠患側(cè)PWT上升較顯著，而100 Hz與2/100 Hz電針組大鼠患側(cè)PWL上升均顯著。由此可見：不同時(shí)間點(diǎn)100 Hz電針治療均能顯著提升大鼠患側(cè)PWT和PWL。該結(jié)果與以往研究相一致，即100 Hz是治療慢性炎性痛的優(yōu)勢頻率[19]。

TRPV1是一種與疼痛密切相關(guān)的非選擇性陽離子通道。炎性反應(yīng)狀態(tài)下，TRPV1在神經(jīng)系統(tǒng)疼痛信號傳導(dǎo)整合中發(fā)揮了重要作用[20]。磷酸化是TRPV1活化的重要形式之一[21]。在CFA誘導(dǎo)的慢性炎性痛模型中，大鼠會出現(xiàn)患側(cè)DRG p-TRPV1表達(dá)增多的現(xiàn)象[22]。本研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，慢性炎性痛大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞膜蛋白中的p-TRPV1蛋白表達(dá)顯著增多。已有研究報(bào)道，電針對炎性痛大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)可能與其抑制脊髓TRPV1 mRNA及蛋白的表達(dá)、p-TRPV1蛋白的表達(dá)有關(guān)[19，23]。本研究發(fā)現(xiàn)，100 Hz電針能有效調(diào)控慢性炎性痛大鼠L5 DRG神經(jīng)元細(xì)胞膜蛋白中的p-TRPV1蛋白過表達(dá)，但對L4、L6節(jié)段無顯著調(diào)控效應(yīng)。出現(xiàn)該差異的具體機(jī)制，仍需后期進(jìn)一步研究。

綜上所述，100 Hz電針是干預(yù)慢性炎性痛的優(yōu)勢頻率，其干預(yù)作用可能通過下調(diào)CFA大鼠L5 DRG p-TRPV1蛋白的過表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

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（2019-05-10收稿 責(zé)任編輯：徐穎）