徐立雷 孫晶 李菲 何俏穎 何曉芬 沈醉 劉伯宇 方劍喬 邵曉梅

摘要 目的：采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選痛記憶模型大鼠ACC腦區(qū)差異蛋白，并進(jìn)一步篩選與電針干預(yù)痛記憶可能相關(guān)的差異蛋白，為電針干預(yù)痛記憶的深入研究提供理論支持。方法：將18只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組（生理鹽水對照組）、模型組和電針組，每組6只。模型組及電針組大鼠通過二次角叉菜膠足跖注射建立痛記憶模型。對照組注射同等劑量的生理鹽水。電針組于首次注射后5 h、1～5 d進(jìn)行電針治療。模型組與空白組僅作與電針組相同的束縛處理。分別檢測3組大鼠造模前，首次注射后4 h、5 d和二次注射后4 h、72 h的機(jī)械痛閾。二次注射后第3天，大鼠處死后取ACC腦組織。以雙向凝膠電泳分離，雙向電泳后經(jīng)不同波長光激發(fā)掃描得到不同樣品的蛋白質(zhì)組圖譜，經(jīng)Image Master2D 6.0軟件進(jìn)行分析后，篩選相差在1.5倍以上的蛋白作為差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果：1）與空白組比較，模型組二次未注射角叉菜膠足跖痛閾顯著下降（P<0.05）;與模型組比較，電針組二次未注射角叉菜膠足跖痛閾顯著上升（P<0.05）。2）經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)分析共篩選出18個差異蛋白質(zhì)。其中模型組有明顯差異者有11個，4個表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)，分別為微管蛋白α-1A鏈、DAB2相互作用蛋白、NADH脫氫酶的輔酶黃素蛋白2、轉(zhuǎn)凝蛋白-3;7個表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)，分別為微管蛋白β-3鏈、肌動蛋白1、磷酸甘油酸激酶1、類固醇激素合成急性蛋白、肌動蛋白2、細(xì)胞色素c氧化酶6A1亞基、泛素40S核糖體蛋白S27a。與空白組比較，電針組有明顯差異者有15個，3個表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)，分別為微管蛋白α-1C鏈、Rho GDP解離抑制因子、NADH脫氫酶的輔酶黃素蛋白2;12個表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)，分別為微管蛋白β-2A鏈、微管蛋白β-3鏈、肌動蛋白1、烏頭酸水合酶、丙酮酸激酶同工酶、異檸檬酸脫氫酶、磷酸甘油酸激酶1、Ras相關(guān)Rab-19蛋白、類固醇激素合成急性蛋白、肌動蛋白2、細(xì)胞色素c氧化酶6A1亞基、泛素40S核糖體蛋白S27a。電針組與模型組比較后呈現(xiàn)明顯差異的有8個差異蛋白，2個呈現(xiàn)下調(diào)，分別是Rho GDP解離抑制因子、肌動蛋白2。6個呈現(xiàn)上調(diào)，分別是微管蛋白α-1A鏈、微管蛋白β-2A鏈、DAB2相互作用蛋白、烏頭酸水合酶、異檸檬酸脫氫酶、Ras相關(guān)Rab-19蛋白。結(jié)論：經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，有11個差異蛋白參與痛記憶的喚醒過程;有8個差異蛋白參與電針干預(yù)痛記憶的過程。提示電針對痛記憶的干預(yù)可能與穩(wěn)定神經(jīng)細(xì)胞骨架蛋白，進(jìn)而抑制神經(jīng)突觸可塑性改變有關(guān)。

關(guān)鍵詞 電針;痛記憶;前扣帶皮層;蛋白質(zhì)組學(xué);差異蛋白;角叉菜膠;全景式;大鼠

Abstract Objective：To screen the differential protein of ACC brain region in pain memory model rats by proteomics method，to further screen the differential proteins related to electroacupuncture intervention pain memory，so as to provide theoretical support for the further study of electroacupuncture intervention pain memory.Methods：A total of 18 healthy male Sprague Dawley rats were divided into three groups，with 6 rats in each group，including a control group，a model group and an EA group.The pain memory model was made by twice cross-injection carrageenan in EA and model groups.The control group was given the same dose of normal saline in the same time point as the model and EA group.EA was applied to bilateral Zusanli（ST36）and given at 5 h，1～5 days after the first injection for 30 min per time.The model group was taken the same measures except for EA.The pain withdrawal thresholds were detected before modeling and at 4 h，120 h after the first injection and before second injection and at 4 h，72 h after the second injection.Rats were killed at 3rd day after the second injection and taking the ACC of rats for preparation.Samples were separated by 2-D gel electrophoresis（2-DE）.Then we got different samples of proteomic map by different excitation wavelength light scan.The gels were respectively image analyzed by Image Master 2D 6.0，to screen the protein changed in abundance more than 1.5 folder up or down compared with which in constitution of the control group as differential proteomics，and then had the mass spectrum identification.Results：1）Compared with the blank group，the pain threshold of carrageenan ankle was significantly decreased in the model group（P<0.05）.Compared with the model group，the ankle pain threshold of electroacupuncture group without twice cross-injection carrageenan was rised significantly（P<0.05）.）2）After proteomic analysis，18 differential proteins were screened out.Among them，there were 11 with significant difference in the model group，4 of them had down expression，including Tubulin alpha-1C chain，DAB2 interacting protein，NADH dehydrogenase [ubiquinone] flavoprotein 2，Transglutinin-3; and 7 of them had up expression，including Tubulin beta-3，Phosphoglycerate kinase 1，Steroidogenic acute regulatory protein，Actin cytoplasmic 2，Cytochrome c oxidase subunit 6A1，Ubiquitin-40S ribosomal protein S27a.Compared with the blank group，EA group had 15 proteins with significant differences，3 of them had down expression，including Tubulin alpha-1C chain，Rho GDP-dissociation inhibitor 1，NADH dehydrogenase [ubiquinone] flavoprotein 2，and 12 of them had up expression，including Tubulin beta-2A chain，Tubulin beta-3A chain，Actin 1，aconitate hydratase，pyruvate kinase isoenzyme，isocitrate dehydrogenase，phosphoglycerate kinase 1，Ras-related Rab-19 protein，steroid hormone synthesis of acute protein，actin 2，cells Pigment c oxidase 6A1 subunit，ubiquitin 40S ribosomal protein S27a.There were 8 differentially expressed proteins in the EA group compared with the model group，and 2 were down-regulated，which were Rho GDP dissociation inhibitor and actin 2.6 were up-regulated，respectively，tubulin α-1A Chain，tubulin β-2A chain，DAB2 interacting protein，aconitate hydratase，isocitrate dehydrogenase，Ras-related Rab-19 protein.Conclusion：There were 11 differential proteomics involved in pain memory of awakening process through proteomics analysis.And 8 differential proteomics were involved in the intervention of EA on pain memory.The intervention effect of electroacupuncture（EA）pretreatment on pain memory may be related to inhibition of synaptic plasticity.And the inhibition may be related to reinforce nerve cytoskeleton structure.

Key Words Electroacupuncture; Pain memory; Anterior cingulate cortex; Proteomics; Differential proteins; Carrageenan; Panoramic; Rat

中圖分類號：R245文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.06.001

痛記憶目前被認(rèn)為是慢性痛形成的主要原因之一，主要表現(xiàn)為炎性反應(yīng)、創(chuàng)傷等引起疼痛的初始病因消除后，傷害性感受仍然存在的現(xiàn)象[1-3]。對這類疼痛的治療目前臨床仍以抗炎鎮(zhèn)痛藥物為主，但臨床效果不明顯，并且長期恐懼、回避行為將導(dǎo)致患者的生活能力下降、肢體廢用、肌力下降等[4]，對于疼痛患者的生命質(zhì)量產(chǎn)生重大影響。因此對痛記憶的干預(yù)已逐漸成為疼痛治療的新熱點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)前扣帶皮層（Anterior Cingulate Cortex，ACC）是人類疼痛研究中激活頻率最高的腦區(qū)[5-7]，我們以往研究也已發(fā)現(xiàn)電針可有效緩解痛記憶，并且其作用與抑制ACC腦區(qū)活性有關(guān)[8]。盡管既往研究初步說明電針是干預(yù)痛記憶的有效方法，但是目前對于針灸治療痛記憶的認(rèn)識極其有限，有下列問題急需解決：1）缺乏蛋白質(zhì)組學(xué)層面對編碼痛記憶的關(guān)鍵腦區(qū)（ACC）可能涉及的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞通路的證據(jù)。盡管有研究報道了與痛記憶變化密切相關(guān)的通路或因子包括cAMP/PKA/CERB通路、ERK磷酸化、NMDA受體等[9-11]，以及與痛感覺密切相關(guān)MAPK信號通路、P2X嘌呤受體、TRPV等[12-14]。但是尚未開展就ACC腦區(qū)全景式的蛋白質(zhì)組學(xué)差異蛋白比較研究。2）缺乏蛋白質(zhì)組學(xué)層面針灸抗痛記憶機(jī)制認(rèn)識。我們的前期工作以痛記憶模型研究對象，有力說明了電針對痛記憶早期的干預(yù)優(yōu)勢，遺憾的是我們僅關(guān)注了p-CREB在痛記憶喚醒過程及電針干預(yù)中的作用，沒有采用更加合適的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)全景式揭示電針對痛記憶的干預(yù)機(jī)制。針灸作為鎮(zhèn)痛公認(rèn)有效的作用多靶點(diǎn)傳統(tǒng)療法，對于揭示針灸鎮(zhèn)痛原理的研究多數(shù)仍然集中在針灸對特定通路或蛋白的研究，極大限制了本領(lǐng)域的發(fā)展。因此，目前的研究成果不能完全闡釋針灸對痛記憶干預(yù)的原理。本研究基于比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)分析痛記憶喚醒階段ACC腦區(qū)差異蛋白表達(dá)，并進(jìn)一步觀察電針對差異蛋白表達(dá)的影響，這對初步構(gòu)建針灸干預(yù)痛記憶調(diào)制網(wǎng)絡(luò)尤為必要，將為深入了解痛記憶喚醒機(jī)制及針灸干預(yù)奠定夯實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心的18只健康雄性SD大鼠，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)（實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證號為SYXK（浙）2008-0115），體質(zhì)量（180±20）g。

1.1.2 藥物 角叉菜膠、0.9%生理鹽水。

1.1.3 試劑和儀器 Von Frey纖維絲測痛儀（美國stoelting公司），韓式HANS-200A穴位神經(jīng)刺激儀（聯(lián)創(chuàng)科技（集團(tuán)）南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司），EttanTM DALTSix垂直板電泳儀（GE公司），Typhoon 9400多功能掃描成像系統(tǒng)（GE公司），DeCyder Image QuantTM V6.5凝膠圖像析軟件（GE公司），基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），MultiTemp Ⅲ溫控循環(huán)水浴系統(tǒng)（美國BioSciences公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 選用清潔級健康雄性SD大鼠18只，體質(zhì)量（180±20）g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠隨機(jī)分分為空白組（生理鹽水對照組）、模型組、電針組3組，每組6只。

本研究通過2次角叉菜膠注射誘導(dǎo)炎性痛，建立疼痛記憶模型。模型組與電針組大鼠首次造模于左后足跖皮下注射2%角叉菜膠0.1 mL，首次造模后14 d，以同樣的方法在2組大鼠右后足跖皮下注射2%角叉菜膠0.1 mL?？瞻捉M在相應(yīng)時間點(diǎn)注射等劑量的生理鹽水。

1.2.2 干預(yù)方法 參照《實(shí)驗(yàn)動物穴位圖譜》進(jìn)行穴位定位，將0.3 mm×13 mm毫針針刺電針組大鼠雙側(cè)“后三里”穴，將參考電極置于“后三里”下1 cm處，使用韓氏穴位暨神經(jīng)刺激儀連接針灸針，電針儀的刺激參數(shù)設(shè)定如下：波形為疏密波，頻率2/100 Hz;波寬0.2 ms;電流強(qiáng)度以動物局部皮膚輕微顫動為度（1 mA～2 mA），起始強(qiáng)度為1 mA，每10 min增加0.5 mA，直至2 mA，共計(jì)30 min。電針時間為首次造模后5 h及第1～5天?？瞻捉M與模型組大鼠僅作與電針組相同的束縛處理。

1.2.3 指標(biāo)檢測與方法 1）機(jī)械縮足閾檢測：采用von frey檢測大鼠雙側(cè)后足縮足閾（Paw Withdrawal Thresholds，PWTs）作為機(jī)械痛閾。檢測時間段為上午9點(diǎn)至12點(diǎn)，保持室內(nèi)溫度23～25 ℃，濕度45%～55%，噪聲40 dB以下。痛閾檢測時間點(diǎn)為首次造模前、首次造模后4 h、120 h，2次造模前、2次造模后4 h、72 h。每次測痛連續(xù)檢測5次，每次間隔5 min，取后面4次縮足閾的平均值作為1個時間點(diǎn)痛閾值。各組大鼠于基礎(chǔ)痛閾測量前，進(jìn)行兩天適應(yīng)性痛閾的檢測，以減少環(huán)境對實(shí)驗(yàn)大鼠痛閾的影響。2）提取總蛋白及電泳：3組大鼠在第2次角叉菜膠注射后的第4天，麻醉狀態(tài)下經(jīng)心灌注預(yù)冷生理鹽水后，取大鼠左側(cè)前扣帶皮層20 mg ACC組織，加入200 μL裂解液，勻漿后靜置于冰盒30 min。再置于高速低溫離心機(jī)中設(shè)定11 000 r/min，4 ℃離心10 min，結(jié)束后提取上清液。并采用BCA法檢測蛋白濃度，再進(jìn)行雙向電泳和銀染法蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測。3）凝膠銀染后圖像掃描與軟件分析：凝膠電泳之后使用MilliQ純水沖洗數(shù)次，運(yùn)用Typhoon9400掃描儀進(jìn)行掃描成像。所獲得的蛋白質(zhì)組圖譜采用DeCyderImage QuantTM V6.5圖像分析軟件進(jìn)行點(diǎn)識別、點(diǎn)匹配、背景消除以及差異蛋白質(zhì)分析。確定差異蛋白質(zhì)后，使用250 μL槍頭剪去其前端部分，將感興趣的蛋白質(zhì)點(diǎn)對準(zhǔn)后，輕壓切下，置于離心管中備用。4）膠內(nèi)酶解：將進(jìn)行銀染后切下的蛋白質(zhì)點(diǎn)置于離心管中，再用ddH2O將蛋白質(zhì)凝膠反復(fù)沖洗后，依次進(jìn)行洗膠脫色、分解和剩余物中半胱氨酸烷基化、酶解、萃取、純化和結(jié)合。5）質(zhì)譜分析（MALDI-TOF-TOF-MS檢測）：用4800串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀（4800 Plus MALDI TOF/TOFTM Analyzer）進(jìn)行質(zhì)譜分析，設(shè)定激光強(qiáng)度為3 880，采集數(shù)據(jù)方式采用反射模式和自動獲取數(shù)據(jù)的模式，每張圖譜共采集1 000點(diǎn)，肽段掃描范圍為900～4 000 Da，選擇信噪比大于5 000的母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜（MS/MS）分析，每個樣品點(diǎn)上選擇2個母離子，二級MS/MS激光激發(fā)碰撞能量2 KV。每個樣品采集3個～5個譜圖。質(zhì)譜數(shù)據(jù)用Data Explorer（4.0）分析軟件去除同位素峰后，用Mascot檢索在NCBInr引擎中進(jìn)行檢索。最后，結(jié)合2-D圖譜上初步的蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)信息鑒定蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 電針對痛記憶模型大鼠機(jī)械痛閾的影響

首次造模前，空白組、模型組和電針組大鼠雙側(cè)足跖基礎(chǔ)痛閾組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與空白組比較，模型組大鼠左側(cè)足跖首次造模后4 h痛閾顯著下降（P<0.01）并延續(xù)至造模后120 h（P<0.01）。電針組痛閾在4 h均顯著低于空白組（P<0.01）。與模型組比較，電針組造模后4 h痛閾無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但在造模后120 h痛閾顯著上升（P<0.01）（見圖1A）。未造模側(cè)足跖痛閾在各時間點(diǎn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（見圖1B）。

14 d之后，當(dāng)大鼠右后足跖痛閾恢復(fù)到基礎(chǔ)痛閾，進(jìn)行右后足跖2次角叉菜膠造模（首次未注射側(cè)足跖），2次造模后右后足跖痛閾變化類似于首次造模側(cè)足跖，與空白組比較，模型組與電針組大鼠痛閾在2次造模后4 h至72 h均有顯著下降（P<0.01）。模型組與電針組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（見圖1C）。在大鼠2次未造模側(cè)足跖即首次造模側(cè)足跖，與空白組比較，模型組痛閾在2次造模后4 h、72 h顯著下降（P<0.01）（見圖1D）;電針組痛閾在2次造模后4 h、72 h痛閾無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，電針組2次造模后4 h及72 h痛閾均有顯著升高（P<0.01，P<0.01）。

與此同時，空白組各時間點(diǎn)機(jī)械痛閾均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 電泳圖譜分析

圖2顯示了經(jīng)過差異蛋白質(zhì)組分析后的銀染蛋白質(zhì)圖譜?？梢钥闯龈鞯鞍踪|(zhì)在A空白組、B模型組、C電針組表達(dá)量的變化（余蛋白質(zhì)圖譜見附圖）。

2.3 質(zhì)譜分析

對上述3塊膠蛋白質(zhì)組圖譜中相匹配的點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，選擇模型組、2/100 Hz電針組與空白組相較表達(dá)差值絕對值異超過50%的蛋白質(zhì)，再將這些蛋白點(diǎn)經(jīng)膠內(nèi)酶解后用基質(zhì)輔助激光電離質(zhì)譜進(jìn)行檢測，與蛋白質(zhì)文庫進(jìn)行比對分析后，將蛋白質(zhì)CI值<60者剔除后，即為本實(shí)驗(yàn)所獲得差異蛋白質(zhì)。結(jié)果共篩選出18個差異蛋白質(zhì)，這18種差異蛋白分別是微管蛋白α-1A鏈（Tubulin alpha-1A chain，Tuba1a）、微管蛋白α-1C鏈（Tubulin alpha-1C chain，Tuba1c）、微管蛋白β-2A鏈（Tubulin beta-2A chain，Tubb2a）、DAB2相互作用蛋白（Disabled homolog 2-interacting protein，Dab2ip）、微管蛋白β-3鏈（Tubulin beta-3 chain，Tubb3）、Rho GDP解離抑制因子（Rho GDP-dissociation inhibitor 1;Arhgdia，rho GDI）、NADH脫氫酶的輔酶黃素蛋白2，（NADH dehydrogenase [ubiquinone] flavoprotein 2，NDUFV2）、肌動蛋白1（Actin，cytoplasmic1，Actb1）、烏頭酸水合酶（Aconitate hydratase）、丙酮酸激酶同工酶（Pyruvate kinase，PKM）、異檸檬酸脫氫酶（Isocitrate dehydrogenase）、磷酸甘油酸激酶1（Phosphoglycerate kinase 1，Pgk1）、Ras相關(guān)Rab-19蛋白（Ras-related protein Rab-19，Rab19）、類固醇激素合成急性蛋白（Steroidogenic acute regulatory protein，Star）、轉(zhuǎn)凝蛋白-3（Transgelin-3）、肌動蛋白2（Actin，cytoplasmic2，Actb2）、細(xì)胞色素c氧化酶6A1亞基（Cytochromec oxidase subunit 6A1，Cox6a1）、泛素40S核糖體蛋白S27 a（Ubiquitin-40S ribosomal protein S27a，Rps27a）等18個差異蛋白。其相關(guān)性質(zhì)見表1。圖3～圖10為K2、K4、K5、K10、K19、K21、L1、L9，等8個差異蛋白的肽指紋圖譜。

經(jīng)質(zhì)譜鑒定后各蛋白質(zhì)在3組間表達(dá)程度（灰度值）及差異如表2（差異絕對值比例>50%為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），表述如下：微管蛋白α-1A鏈，在空白組表達(dá)值為2.679 38，模型組1.246 56，電針組1.863 75;與空白組比較，模型組明顯下調(diào)，電針組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，電針組與模型組比較明顯上調(diào);微管蛋白α-1C，在空白組表達(dá)值為6.433 03，模型組3.459 21，電針組3.185 83;與空白組比較，模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，電針組明顯下調(diào)，電針組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;鏈微管蛋白β-2A鏈，在空白組表達(dá)值為1.013 90，模型組0.986 50，電針組1.905 96;與空白組比較，模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，電針組明顯上調(diào)，模型組與電針組比較明顯上調(diào);DAB2相互作用蛋白，在空白組表達(dá)值為2.816 10，模型組1.106 96，電針組1.750 22;與空白組比較，模型組明顯下調(diào)，電針組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，電針組與模型組比較明顯上調(diào);微管蛋白β-3鏈，在空白組表達(dá)值為1.227 87，模型組2.535 63，電針組2.278 81;與空白組比較，模型組明顯上調(diào)，電針組明顯上調(diào)，電針組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Rho GDP解離抑制因子，在空白組表達(dá)值為3.531 25，模型組3.654 80，電針組1.524 28;與空白組比較，模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，電針組明顯下調(diào)，電針組與模型組比較明顯下調(diào);NADH脫氫酶，在空白組表達(dá)值為3.857 73，模型組1.187 02，電針組1.261 16;與空白組比較，模型組明顯下調(diào)，電針組明顯下調(diào)，電針組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;肌動蛋白1，在空白組表達(dá)值為1.993 42，模型組5.552 76，電針組3.850 43;與空白組比較，模型組明顯上調(diào)，電針組明顯上調(diào)，電針組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;烏頭酸水合酶，在空白組表達(dá)值為0.724 02，模型組0.570 86，電針組1.811 56;與空白組比較，模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，電針組明顯上調(diào)，電針組與模型組比較明顯上調(diào);丙酮酸激酶同工酶，在空白組表達(dá)值為2.164 34，模型組2.722 70，電針組3.833 47;與空白組比較，模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，電針組明顯上調(diào)，電針組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;異檸檬酸脫氫酶，在空白組表達(dá)值為0.644 61，模型組0.864 12，電針組1.751 80;與空白組比較，模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，電針組明顯上調(diào)，電針組與模型組比較明顯上調(diào);磷酸甘油酸激酶1，在空白組表達(dá)值為0.975 09，模型組1.884 78，電針組2.025 63;與空白組比較，模型組明顯上調(diào)，電針組明顯上調(diào)，電針組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Ras相關(guān)Rab-19蛋白，在空白組表達(dá)值為1.493 79，模型組1.675 15，電針組3.152 37;與空白組比較，模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，電針組明顯上調(diào)，電針組與模型組比較明顯上調(diào);類固醇激素合成急性蛋白，在空白組表達(dá)值為0.750 78，模型組2.141 67，電針組2.158 57;與空白組比較，模型組明顯上調(diào)，電針組明顯上調(diào)，電針組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;轉(zhuǎn)凝蛋白-3，在空白組表達(dá)值為2.112 51，模型組0.733 93，電針組1.092 01;與空白組比較，模型組明顯下調(diào)，電針組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，電針組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;肌動蛋白2，在空白組表達(dá)值為0.332 67，模型組6.158 96，電針組2.768 16;與空白組比較，模型組明顯上調(diào)，電針組明顯上調(diào)，電針組與模型組比較明顯下調(diào);細(xì)胞色素c氧化酶6A1亞基，在空白組表達(dá)值為1.304 55，模型組1.972 40，電針組2.861 41;與空白組比較，模型組明顯上調(diào)，電針組明顯上調(diào)，電針組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;泛素40S核糖體蛋白S27a，在空白組表達(dá)值為2.677 61，模型組6.446 49，電針組6.644 55;與空白組比較，模型組明顯上調(diào)，電針組明顯上調(diào)，電針組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

疼痛是一種跟機(jī)體組織受到傷害或者跟潛在性傷害有關(guān)的不愉快的主觀感覺和情緒體驗(yàn)（IASP 1994）。疼痛的定義中包含了疼痛感覺和疼痛情緒等兩方面。Apkarian等[15]認(rèn)為記憶是人們不由自主的行為，疼痛的發(fā)生會與學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)聯(lián)。隨著疼痛的發(fā)生，記憶就可以被喚醒而恢復(fù)。本次實(shí)驗(yàn)我們所使用的痛記憶模型是參照Igor的方法[16]建立的，在前人的研究結(jié)果中已經(jīng)確認(rèn)角叉菜膠2次交叉注射大鼠足跖方法，將其作為疼痛記憶的評價模型[17-21]。前期研究工作中，本研究小組發(fā)現(xiàn)2/100頻率早期電針對痛記憶有較好的干預(yù)作用。

本研究經(jīng)質(zhì)譜儀共篩選出18個差異蛋白依其功能大致可以分為3類，即結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白、傳導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白、能量代謝相關(guān)蛋白。依其數(shù)量結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白占總數(shù)的50%，傳導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白占總數(shù)的17%、能量代謝相關(guān)蛋白占總數(shù)的33%。各組差異蛋白所占比例如圖11所示。

將空白組、模型組與電針組比較，表達(dá)差異值絕對值超過50%，并符合質(zhì)譜鑒定后蛋白質(zhì)CI值>60者，為最終被確定的差異蛋白質(zhì)，共獲得18種差異蛋白，分別是微管蛋白α-1A鏈、微管蛋白α-1C鏈、微管蛋白β-2A鏈、DAB2相互作用蛋白、微管蛋白β-3鏈、Rho GDP解離抑制因子、NADH脫氫酶2，、肌動蛋白1、烏頭酸水合酶、丙酮酸激酶同工酶、異檸檬酸脫氫酶、磷酸甘油酸激酶1、Ras相關(guān)Rab-19蛋白、類固醇激素合成急性蛋白、轉(zhuǎn)凝蛋白-3、肌動蛋白2、細(xì)胞色素c氧化酶6A1亞基、泛素40S核糖體蛋白S27a。

痛記憶產(chǎn)生后（模型組）有11個差異蛋白表達(dá)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分別是結(jié)構(gòu)相關(guān)：轉(zhuǎn)凝蛋白-3、微管蛋白α-1A鏈、DAB2相互作用蛋白、微管蛋白β-3鏈、肌動蛋白1、肌動蛋白2;轉(zhuǎn)運(yùn)傳輸相關(guān)：類固醇激素合成急性蛋白、泛素40S核糖體蛋白S27a;能量代謝相關(guān)：NADH脫氫酶、磷酸甘油酸激酶1、細(xì)胞色素c氧化酶6A1亞基蛋白等。此11個差異表達(dá)蛋白質(zhì)的組合性變化與痛記憶喚醒有關(guān)。

電針干預(yù)后有15個差異蛋白表達(dá)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分別為微管蛋白α-1C鏈、Rho GDP解離抑制因子、NADH脫氫酶2、微管蛋白β-2A鏈、微管蛋白β-3鏈、肌動蛋白1、烏頭酸水合酶、丙酮酸激酶同工酶、異檸檬酸脫氫酶、磷酸甘油酸激酶1、Ras相關(guān)Rab-19蛋白、類固醇激素合成急性蛋白、肌動蛋白2、細(xì)胞色素c氧化酶6A1亞基、泛素40S核糖體蛋白S27a。此15個差異表達(dá)蛋白質(zhì)的組合性變化與電針干預(yù)有關(guān)。

電針組與模型組比較后有8個差異蛋白表達(dá)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。微管蛋白α-1A鏈、DAB2相互作用蛋白、Rho GDP解離抑制因子、微管蛋白β-2A鏈、肌動蛋白2、Ras相關(guān)Rab-19蛋白、烏頭酸水合酶、異檸檬酸脫氫酶等。此8個差異表達(dá)蛋白質(zhì)的組合性變化與電針干預(yù)痛記憶有關(guān)。

模型組的11個差異蛋白，與電針組的15個差異蛋白中，有8個差異蛋白相同，而此8個差異蛋白經(jīng)由模型組與電針組比較后，只有肌動蛋白2一個蛋白質(zhì)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且差異表達(dá)趨勢與動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同;提示肌動蛋白2在痛記憶喚醒過程及及電針干預(yù)痛記憶中扮演主要角色。

電針組與模型組比較后，電針組中有9個差異蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分別是微管蛋白α-1C鏈、NADH脫氫酶2、微管蛋白β-3鏈、肌動蛋白1、丙酮酸激酶同工酶、磷酸甘油酸激酶1、類固醇激素合成急性蛋白、細(xì)胞色素c氧化酶6A1亞基、泛素40S核糖體蛋白S27a。此9個差異表達(dá)蛋白質(zhì)的組合性變化其表達(dá)為電針干預(yù)后反應(yīng)，與電針干預(yù)痛記憶無關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)11個差異蛋白參與痛記憶的喚醒過程。分別是結(jié)構(gòu)相關(guān)：轉(zhuǎn)凝蛋白-3、微管蛋白α-1A鏈、DAB2相互作用蛋白、微管蛋白β-3鏈、肌動蛋白1、肌動蛋白2;轉(zhuǎn)運(yùn)傳輸相關(guān)：類固醇激素合成急性蛋白、泛素40S核糖體蛋白S27a;能量代謝相關(guān)：NADH脫氫酶、磷酸甘油酸激酶1、細(xì)胞色素c氧化酶6A1亞基蛋白等;本研究發(fā)現(xiàn)8個差異蛋白參與電針干預(yù)痛記憶的過程。分別是結(jié)構(gòu)相關(guān)：微管蛋白α-1A鏈、DAB2相互作用蛋白、Rho GDP解離抑制因子、微管蛋白β-2A鏈、肌動蛋白2;轉(zhuǎn)運(yùn)傳輸相關(guān)：Ras相關(guān)Rab-19蛋白;能量代謝相關(guān)：烏頭酸水合酶、異檸檬酸脫氫酶等;電針對痛記憶的干預(yù)可能與穩(wěn)定神經(jīng)細(xì)胞骨架蛋白，進(jìn)而抑制神經(jīng)突觸可塑性改變有關(guān)，但其作用的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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（2019-06-04收稿 責(zé)任編輯：徐穎）